復(fù)合乳酸菌發(fā)酵沙棘汁降酸的工藝優(yōu)化及特性分析

寧志雪，朱立斌，朱 丹 ，牛廣財(cái), ，魏文毅，徐瑞航

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，黑龍江大慶 163319；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江大慶 163319）

沙棘是一種藥食同源植物，屬胡頹子科，所結(jié)漿果呈橙色或紅色，因其富含抗壞血酸、多酚、類胡蘿卜素和類黃酮等生物活性物質(zhì)而備受關(guān)注[1]。另外，沙棘是公認(rèn)的抗氧化活性非常高的漿果，已有研究證明沙棘果汁的氧自由基吸收能力可達(dá)111.57 μmol TE/mL，分別是藍(lán)莓汁、檸檬汁和柑橘汁的2.82、15.96和60.97 倍[2]。然而，高含量的蘋(píng)果酸使沙棘果具有強(qiáng)烈的酸味，這對(duì)其在食品工業(yè)中的應(yīng)用構(gòu)成了障礙。最近的研究表明，乳酸菌在改善產(chǎn)品風(fēng)味或提高保質(zhì)期方面有著巨大的發(fā)展前景。例如，李維妮等[3]以嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、乳雙歧桿菌和副干酪乳桿菌發(fā)酵蘋(píng)果汁，在菌株比例1:1:1:1、接種量2%、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時(shí)間24 h 的條件下處理蘋(píng)果汁，蘋(píng)果酸含量為1574.36 mg/L，較發(fā)酵前下降了46.06%，且風(fēng)味物質(zhì)更加豐富。張晟等[4]使用酒酒球菌6066 對(duì)北五味子汁進(jìn)行發(fā)酵，在初始pH3.4、接種量7%、發(fā)酵溫度24 ℃、發(fā)酵時(shí)間8 d 的條件下處理北五味子汁，發(fā)酵后蘋(píng)果酸含量降低了59.00%，DPPH、ABTS+自由基清除率和還原力分別是發(fā)酵前的1.22、1.10 和1.444 倍。由此可見(jiàn)，乳酸菌發(fā)酵果汁具有使產(chǎn)品風(fēng)味和香氣復(fù)雜性增強(qiáng)、酸性降低的優(yōu)點(diǎn)[5]。沙棘具有強(qiáng)烈的酸性和收斂性，因此，乳酸菌發(fā)酵也是提升沙棘汁感官品質(zhì)的一個(gè)潛在方法。

已有研究證實(shí)復(fù)合菌種發(fā)酵不僅可使產(chǎn)品品質(zhì)提升，而且復(fù)合菌株發(fā)酵體系中自由基清除效果要優(yōu)于單一菌株發(fā)酵[6]。目前，尚未有采用酒酒球菌與短乳桿菌復(fù)合使用對(duì)沙棘汁降酸的報(bào)道。本研究以酒酒球菌與短乳桿菌為復(fù)合菌種，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化其對(duì)沙棘汁的降解工藝，并對(duì)發(fā)酵沙棘汁的理化指標(biāo)與抗氧化活性進(jìn)行分析，以期為拓寬沙棘汁的商業(yè)用途提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙棘果 購(gòu)于黑龍江省孫吳縣寶江大果沙棘展銷中心；酒酒球菌SP-2T（Oeniococcus oeniSP-2T）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis） 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保藏；蘆丁、沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品 上海麥克林生化科技有限公司；酒石酸鉀鈉、3,5-二硝基水楊酸、NaOH、苯酚、無(wú)水亞硫酸鈉、葡萄糖、無(wú)水乙醇、NaNO2、Al（NO3）3、K2S2O4、乙酸鈉、冰醋酸、濃鹽酸、FeCl3·6H2O、FeSO4、福林酚試劑、碳酸氫鈉 天津大茂化學(xué)試劑廠；MRS 培養(yǎng)基、Na2CO3、蛋白胨、酵母膏、MnSO4·H2O、MgSO4·7H2O、L-鹽酸半胱氨酸 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2'-聯(lián)氮-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）、三吡啶基三嗪（TPTZ） 分析純，梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；甲醇、磷酸二氫鉀、磷酸 色譜純，天津大茂化學(xué)試劑廠；草酸、抗壞血酸、乳酸、奎寧酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸、酒石酸標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma 公司。

980 力邦全自動(dòng)破壁料理機(jī) 寧波禾高電子科技有限公司；AHP9052 電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海澳程檢測(cè)儀器有限公司；高壓滅菌器 西班牙SELECTA；EX324 型電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；TD4C 臺(tái)式低速離心機(jī) 鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；752N 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海儀電（集團(tuán)）有限公司；SW-CJ-2F 超凈工作臺(tái) 常州恩培儀器制造有限公司；HWS 電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；PHS-25 型pH 計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；2WAJ 型單目阿貝折光儀 上海申光儀器儀表有限公司；1260 Infinity 高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 復(fù)合乳酸菌發(fā)酵沙棘汁工藝流程與操作要點(diǎn)

1.2.1.1 工藝流程

1.2.1.2 操作要點(diǎn) 打漿：取解凍后的沙棘果與蒸餾水按照5:2（W:V）的比例進(jìn)行打漿。

調(diào)pH：用1 mol/L 的NaHCO3調(diào)pH。

殺菌：置于85 ℃的水浴中殺菌40 min。

菌種活化：ATB 培養(yǎng)基參照參考文獻(xiàn)[7]制備。將適量酒酒球菌凍干粉接種到ATB 液體培養(yǎng)基中，31 ℃培養(yǎng)2 d，將所得菌液離心（4000 r/min、10 min），收集菌泥，蒸餾水懸重，使細(xì)胞濃度為1×109CFU/mL；取短乳桿菌凍干粉放入已經(jīng)滅菌后的MRS 培養(yǎng)基中溶解均勻，放入37 ℃培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，用蒸餾水懸重，使細(xì)胞濃度為1×109CFU/mL。

接種：冷卻后的沙棘汁，按照一定的比例接入酒酒球菌與短乳桿菌種子液進(jìn)行發(fā)酵。

發(fā)酵：接種后的樣品，置于設(shè)定的恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵一定時(shí)間后取出，留樣置于-80 ℃凍存，備用。

1.2.2 乳酸菌株接種液比例確定 沙棘汁經(jīng)殺菌后，分別接入酒酒球菌:短乳桿菌為1:0、2:1、1:1、1:2 和0:1 比例的混合菌，接種量為7%，于31 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵，每6 h 取樣，通過(guò)比較總酸降解率確定其最佳混菌比例。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 初始pH 對(duì)沙棘汁總酸降解率的影響 以發(fā)酵溫度31 ℃，發(fā)酵時(shí)間18 h，接種量7%，初始pH 分別為3.2、3.4、3.6、3.8、4.0 的條件下進(jìn)行復(fù)合乳酸菌發(fā)酵，確定其優(yōu)選初始pH。

1.2.3.2 發(fā)酵溫度對(duì)沙棘汁總酸降解率的影響 以初始pH3.4，發(fā)酵時(shí)間18 h，接種量7%，發(fā)酵溫度分別為25、28、31、34、37 ℃的條件下進(jìn)行復(fù)合乳酸菌發(fā)酵，確定其優(yōu)選發(fā)酵溫度。

1.2.3.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)沙棘汁總酸降解率的影響 以初始pH3.4，發(fā)酵溫度31 ℃，接種量7%，發(fā)酵時(shí)間分別為6、12、18、24、30 h 的條件下進(jìn)行復(fù)合乳酸菌發(fā)酵，確定其優(yōu)選發(fā)酵時(shí)間。

1.2.3.4 接種量對(duì)沙棘汁總酸降解率的影響 以初始pH3.4，發(fā)酵溫度31 ℃，發(fā)酵時(shí)間18 h，接種量分別為1%、3%、5%、7%、9%的條件下進(jìn)行復(fù)合乳酸菌發(fā)酵，確定其優(yōu)選接種量。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化復(fù)合乳酸菌降酸工藝 以初始pH（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）、接種量（D）為因素，總酸降解率為響應(yīng)值，優(yōu)化復(fù)合乳酸菌降酸的工藝參數(shù)，因素與水平編碼表見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken design

1.2.5 總酸降解率的測(cè)定 采用張晟等[4]的方法測(cè)定總酸降解率。按式（1）計(jì)算總酸降解率。

式中：m1表示未經(jīng)發(fā)酵的沙棘汁總酸含量，g/L；m2表示發(fā)酵后沙棘汁總酸含量，g/L。

1.2.6 黃酮含量的測(cè)定 采用NaNO2-Al（NO3）3比色法測(cè)定沙棘發(fā)酵汁黃酮含量[8]。以濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：y=0.4595x-0.0084（R2=0.9968）。

1.2.7 多酚含量的測(cè)定 采用Folin-ciocalteu 法測(cè)定沙棘發(fā)酵汁多酚含量[8]。以濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：y=8.8017x+0.0059（R2=0.9993）。

1.2.8 總酸含量的測(cè)定 參照國(guó)標(biāo)GB/T 12456-2021食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總酸的測(cè)定中pH 計(jì)電位滴定法，總酸含量以蘋(píng)果酸計(jì)。

1.2.9 pH 測(cè)定 pH 計(jì)直接測(cè)定。

1.2.10 TSS 的測(cè)定 阿貝折射儀法測(cè)定。

1.2.11 還原糖含量的測(cè)定 采用3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定[9]。以濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：y=0.7117x-0.0472（R2=0.9993）。

1.2.12 有機(jī)酸含量的測(cè)定 參考樊秋元等[10]的方法，略作修改。HPLC 條件如下：色譜柱：VP-ODS 柱（150 mm×4.6 mm I,d，5 μm）；流動(dòng)相為20 mmol/L KH2PO4溶液（pH2.8）；流速為0.8 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL；等度洗脫10 min，并在210 nm 處使用紫外檢測(cè)器進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：分別配制奎寧酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸、乳酸、抗壞血酸、草酸、酒石酸等濃度為4、4、3、3、1、1、1 mg/mL 的母液，根據(jù)需要稀釋到不同濃度，用0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾后分別進(jìn)樣。在分析前，將不同沙棘汁樣品稀釋10 倍，并通過(guò)0.45 μm尼龍微濾器過(guò)濾。所測(cè)有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)表2。

表2 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 Organic acid standard curve

1.2.13 DPPH 自由基清除能力測(cè)定 采用張琪等[11]的方法，略有改動(dòng)。吸取2 mL 沙棘稀釋液于比色管中，加入0.5 mL 的0.5 mmol/L DPPH 乙醇溶液混合均勻，暗處37 ℃反應(yīng)20 min 后，在517 nm 處測(cè)樣品吸光值A(chǔ)1。用相應(yīng)體積的無(wú)水乙醇分別代替DPPH 乙醇溶液與樣液，重復(fù)上述操作，分別測(cè)定對(duì)照組A2和空白組A0的吸光度值，并按式（2）計(jì)算清除率。

式中：A1=2 mL樣液+0.5 mL DPPH；A2=2 mL樣液+0.5 mL 無(wú)水乙醇；A0=2 mL 無(wú)水乙醇+0.5 mL DPPH。

1.2.14 ABTS+自由基清除能力測(cè)定 采用張璇[12]的方法，略有改動(dòng)。吸取0.4 mL 沙棘稀釋液于比色管中，加入3.6 mL 的ABTS+工作液混合均勻，暗處室溫反應(yīng)20 min 后，在734 nm 處測(cè)樣品吸光值A(chǔ)1。用相應(yīng)體積的蒸餾水分別代替ABTS+工作液與樣液，重復(fù)上述操作，分別測(cè)定對(duì)照組A2和空白組A0的吸光度值，并按式（3）計(jì)算清除率。

式中：A1=0.4 mL 樣液+3.6 mL ABTS 工作液；A2=0.4 mL 樣液+3.6 mL 蒸餾水；A0=0.4 mL 蒸餾水+3.6 mL ABTS 工作液。

1.2.15 鐵離子還原能力（FRAP）的測(cè)定 參照倪俊等[13]的方法將配置好的醋酸緩沖液、TPTZ 溶液、FeCl3溶液按照體積比10:1:1 混合得到FRAP 溶液。分別取0.5 mL 不同濃度的FeSO4溶液與3 mL FRAP 溶液充分混合，37 ℃下反應(yīng)30 min，在593 nm下測(cè)定吸光值。以濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：y=0.0011x+0.114（R2=0.9972）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果采用表示，使用Origin 8.6、Design-Expert V8.0.6 和SPSS 26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，以及圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同乳酸菌比例對(duì)沙棘汁總酸降解率的影響

通過(guò)沙棘汁的總酸降解率來(lái)評(píng)價(jià)其發(fā)酵能力和質(zhì)量，由表3 可知，酒酒球菌與短乳桿菌復(fù)合菌種發(fā)酵，可使沙棘汁總酸含量降低。在沙棘汁發(fā)酵中，酒酒球菌與短乳桿菌比例為1:0 時(shí)的總酸降解率低于0:1，表明在沙棘汁降酸實(shí)驗(yàn)中，短乳桿菌的降酸效果要優(yōu)于酒酒球菌，這可能由于初始pH 過(guò)低抑制了酒酒球菌生長(zhǎng)[5]。復(fù)合菌種發(fā)酵時(shí)，在酒酒球菌∶短乳桿菌比例為1:1、1:2、2:1 的條件下，總酸降解率都要優(yōu)于酒酒球菌或短乳桿菌單獨(dú)發(fā)酵，表明兩種乳酸菌是可以協(xié)同發(fā)酵的。另外，混菌發(fā)酵可使果汁口感更加柔和，并有明顯香味物質(zhì)生成[14]。當(dāng)菌株比例1:1 時(shí)，沙棘發(fā)酵汁總酸含量與其他比例復(fù)合菌之間無(wú)顯著差異（P＞0.05），且更易于操作，因此，選擇酒酒球菌:短乳桿菌比例1:1 作為沙棘汁后續(xù)發(fā)酵接種用菌株比例。

表3 乳酸菌配比對(duì)沙棘汁總酸降解率的影響Table 3 Effect of lactobacillus ratio on total acid degradation rate of sea buckthorn juice

2.2 初始pH 對(duì)沙棘汁總酸降解率的影響

由圖1 可知，沙棘汁總酸降解率在初始pH3.2～3.6 時(shí)呈上升趨勢(shì)，在pH3.6 時(shí)發(fā)生顯著增高（P＜0.05），達(dá)到最大值35.51%，說(shuō)明pH 為3.6 時(shí)最適宜這兩種乳酸菌的生長(zhǎng)，而較低的初始pH 使總酸降解率下降，這可能是因?yàn)榈蚿H 會(huì)使乳酸菌細(xì)胞內(nèi)環(huán)境和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而抑制了乳酸菌生長(zhǎng)和代謝[15]。沙棘汁總酸降解率在初始pH 大于3.6 時(shí)呈下降趨勢(shì)，這可能是由于過(guò)高的pH 對(duì)蘋(píng)果酸-乳酸酶等關(guān)鍵酶的合成起不到誘導(dǎo)作用[16]，使得總酸降解率下降。這一規(guī)律與韓誠(chéng)武等[17]在實(shí)驗(yàn)中明確的蘋(píng)果酸降解率隨初始pH 的增加先上升后下降的研究結(jié)果一致。因此，優(yōu)選初始pH 為3.6 進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖1 初始pH 值對(duì)沙棘汁總酸降解率的影響Fig.1 Effect of initial pH on total acid degradation rate of sea buckthorn juice

2.3 發(fā)酵溫度對(duì)沙棘汁總酸降解率的影響

由圖2 可知，在發(fā)酵溫度為25～31 ℃范圍內(nèi)，

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)沙棘汁總酸降解率的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on total acid degradation rate of sea buckthorn juice

沙棘汁總酸降解率隨著發(fā)酵溫度的升高不斷增加，當(dāng)發(fā)酵溫度為31 ℃時(shí)，降解率達(dá)到29.64%。這可能是因?yàn)檩^低溫度會(huì)使菌株增殖緩慢以及降低細(xì)胞內(nèi)的酶活性[18-19]，從而抑制了細(xì)胞內(nèi)各種生化反應(yīng)。在發(fā)酵溫度大于31 ℃時(shí)總酸降解率趨于平穩(wěn)且不再發(fā)生顯著變化（P＞0.05），這與張晟等[4]報(bào)道的蘋(píng)果酸降解率伴隨發(fā)酵溫度升高而先上升后下降的規(guī)律不同，可能是由于酒酒球菌與短乳桿菌的適宜生長(zhǎng)溫度和代謝溫度產(chǎn)生了互補(bǔ)。李維妮[3]通過(guò)實(shí)驗(yàn)也證明了復(fù)合乳酸菌活菌數(shù)在較高的溫度下無(wú)顯著變化，從而進(jìn)一步使總酸降解率變化不明顯。因此，優(yōu)選發(fā)酵溫度為31 ℃進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)沙棘汁總酸降解率的影響

如圖3 可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間低于18 h 時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，沙棘汁總酸降解率也不斷增加。在發(fā)酵18 h 時(shí)，沙棘汁總酸降解率上升到最高值（P＜0.05），達(dá)到29.13%，這是因?yàn)殡S著時(shí)間的延長(zhǎng)，兩種乳酸菌大量繁殖與代謝，發(fā)酵越來(lái)越充分[20]，使得總酸不斷被轉(zhuǎn)化和消耗；而當(dāng)發(fā)酵時(shí)間大于18 h 時(shí)，沙棘汁總酸降解率隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而降低，這是由于發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)使菌株活力下降。這與張晟等[4]報(bào)道的蘋(píng)果酸降解率伴隨發(fā)酵時(shí)間的增加先上升后下降的規(guī)律相一致。因此，在本實(shí)驗(yàn)中優(yōu)選發(fā)酵時(shí)間為18 h 進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)沙棘汁總酸降解率的影響Fig.3 Effect of fermentation time on total acid degradation rate of sea buckthorn juice

2.5 接種量對(duì)沙棘汁總酸降解率的影響

由圖4 可知，當(dāng)接種量從1%增加到5%時(shí)，沙棘汁總酸降解率迅速上升，當(dāng)接種量為5%時(shí)，沙棘汁總酸降解率達(dá)到28.27%。有機(jī)酸的降解遵循乳酸菌生長(zhǎng)模式，當(dāng)接種量過(guò)低時(shí)，因乳酸菌長(zhǎng)時(shí)間處于遲滯階段，受損群體修復(fù)損傷和開(kāi)始增長(zhǎng)所需的時(shí)間延長(zhǎng)，使得分解蘋(píng)果酸的能力較弱[21]。當(dāng)接種量超過(guò)5%時(shí)，總酸降解率不再發(fā)生顯著變化（P＞0.05），這可能是因?yàn)榻臃N量大，乳酸菌克服滯后時(shí)間快，使細(xì)胞的代謝能力完全恢復(fù)，同時(shí)，Selma 等[22]的研究結(jié)果表明在克服滯后時(shí)間后，乳酸菌最大生長(zhǎng)量不會(huì)受到接種量大小的影響。因此，總酸降解率變化不明顯。這與辛宇等[23]在實(shí)驗(yàn)中明確的靈芝菌發(fā)酵北五味子果汁中接種量對(duì)總酸降解率的影響一致。因此，在本實(shí)驗(yàn)中優(yōu)選接種量為5%進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖4 接種量對(duì)沙棘汁總酸降解率的影響Fig.4 Effect of inoculation amount on total acid degradation rate of sea buckthorn juice

2.6 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.6.1 模型的建立與分析 以初始pH（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）和接種量（D）為試驗(yàn)因素，總酸降解率Y（%）為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，其試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 沙棘汁降酸工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Response surface experiment design and results of reducing acid process of sea buckthorn juice

上述試驗(yàn)結(jié)果通過(guò)多元回歸方程擬合，得初始pH、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量為影響因素的多元二次方程為：

從表5 可知模型P＜0.0001，極顯著，回歸模型的失擬項(xiàng)P=0.1187＞0.05，模型校正決定系數(shù)R2Adj=0.9710，決定系數(shù)R2值為0.9855，表明該模型與實(shí)驗(yàn)擬合程度較好，可用于復(fù)合乳酸菌發(fā)酵沙棘汁降酸過(guò)程的分析和優(yōu)化。由F值可知，各因素對(duì)沙棘汁總酸降解率的影響大小順序?yàn)锳＞C＞B＞D，即初始pH＞發(fā)酵時(shí)間＞發(fā)酵溫度＞接種量。

表5 回歸模型方差分析結(jié)果Table 5 Variance analysis results of regression model

2.6.2 數(shù)學(xué)模型及響應(yīng)面分析 響應(yīng)曲面坡度越陡峭、等高線越密集以及形狀呈現(xiàn)橢圓形或馬鞍形都表明該因素變化或兩因素間的交互作用越顯著[24]。由圖5 和表5 可知，模型中A、B、C、AB、AC、AD、BC、CD、A2、B2、C2、D2對(duì)Y 影響極顯著（P＜0.01）。在所有交互項(xiàng)中，AC 交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響最強(qiáng)，表明初始pH 與發(fā)酵時(shí)間的交互作用對(duì)沙棘汁總酸降解率的影響最為顯著，由圖5b 可知，隨著初始pH 和發(fā)酵時(shí)間的增加，沙棘汁總酸降解率先增加后趨于平緩，且發(fā)酵時(shí)間曲面的坡度與初始pH 相比較為平滑，說(shuō)明初始pH 影響大于發(fā)酵時(shí)間。圖5d 呈現(xiàn)出發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度之間顯著的交互作用，其中發(fā)酵時(shí)間曲面陡于發(fā)酵溫度，說(shuō)明發(fā)酵時(shí)間的影響程度大于發(fā)酵溫度，與方差分析結(jié)果一致。

圖5 各因素交互作用的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface diagram of interaction of factors

2.6.3 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果及驗(yàn)證 以沙棘汁總酸降解率的最大化為目標(biāo)，預(yù)測(cè)得到的優(yōu)選發(fā)酵條件為：初始pH3.68，發(fā)酵溫度30.54 ℃，發(fā)酵時(shí)間18.21 h，接種量4.79%。在此條件下，回歸方程模型對(duì)沙棘汁總酸降解率的預(yù)測(cè)值為39.33%?？紤]實(shí)際操作的便利性，將發(fā)酵參數(shù)調(diào)整為：初始pH3.7，發(fā)酵溫度31 ℃，發(fā)酵時(shí)間18 h，接種量5%，在上述條件下進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證得到沙棘汁總酸降解率為38.51%±0.64%，相對(duì)誤差為2.08%，說(shuō)明模型可靠。

2.6.4 沙棘汁發(fā)酵過(guò)程中主要理化指標(biāo)的變化 由表6 可知，在發(fā)酵到18 h 時(shí)，除還原糖外，黃酮、多酚、總酸、pH 和TSS 含量與發(fā)酵前均具有顯著性差異（P＜0.05）。多酚與黃酮含量在發(fā)酵過(guò)程中都呈現(xiàn)出先上升后下降趨勢(shì)，在經(jīng)過(guò)18 h 的發(fā)酵后達(dá)到最大值，分別比發(fā)酵前增加了44.74%和22.22%。乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生大量水解酶，使沙棘細(xì)胞壁被破壞，與木質(zhì)素結(jié)合在一起的黃酮被釋放[25]，使黃酮含量上升。多酚類物質(zhì)增多，可能是在發(fā)酵后產(chǎn)生了糖苷酶和酚酯酶，能水解結(jié)合的酚類化合物形成游離酚，使總酚含量增加[26]。

表6 沙棘汁發(fā)酵過(guò)程中主要理化指標(biāo)的變化Table 6 Changes of main physicochemical indexes of sea buckthorn juice during fermentation

發(fā)酵過(guò)程中總酸含量呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，由初始的8.49 g/L 下降至18 h 時(shí)的5.22 g/L，下降了38.52%，這與有機(jī)酸可作為基質(zhì)被乳酸菌分解來(lái)增加生物量有關(guān)[27]。沙棘汁pH 由未發(fā)酵時(shí)的3.71 增加至發(fā)酵18 h 的3.85。TSS 發(fā)酵18 h 后下降了20.29%。另外，還原糖含量沒(méi)有顯著變化，這可能是因?yàn)樵谳^低的pH 下，利用糖發(fā)酵生成乳酸的過(guò)程就會(huì)明顯減少[26]。這與Tkacz 等[28]和Tiitinen 等[29-29]使用酒酒球菌或者植物乳桿菌發(fā)酵沙棘汁脫酸不會(huì)導(dǎo)致糖濃度差異（P＞0.05）的研究結(jié)果相同。

2.6.5 沙棘汁發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸的變化 酒酒球菌與短乳桿菌發(fā)酵沙棘汁，改變了其有機(jī)酸的含量，發(fā)酵過(guò)程中沙棘汁中有機(jī)酸的變化見(jiàn)表7。發(fā)酵前有機(jī)酸以蘋(píng)果酸和奎寧酸為主，分別為6.234±0.200和9.869±0.179 mg/mL，其次為檸檬酸、酒石酸、抗壞血酸、乳酸和草酸。發(fā)酵18 h 后有機(jī)酸比例和含量發(fā)生了明顯變化，以乳酸和奎寧酸為主，含量分別為10.372±0.618 和9.854±0.432 mg/mL。在發(fā)酵時(shí)間為0～18 h 的范圍內(nèi)，沙棘汁中蘋(píng)果酸含量快速降低，在發(fā)酵時(shí)間至18 h 時(shí)蘋(píng)果酸含量降低了94.59%，乳酸含量增加了904.07%?？鼘幩帷⒖箟难?、酒石酸、草酸和檸檬酸含量在發(fā)酵前后沒(méi)有顯著變化（P＞0.05）。

表7 沙棘汁發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸的動(dòng)態(tài)變化Table 7 Dynamic changes of organic acids in sea buckthorn juice during fermentation

2.7 沙棘汁發(fā)酵過(guò)程中抗氧化活性的變化

由圖6 可以看出，DPPH、ABTS+自由基清除率與FRAP 總體呈現(xiàn)先上升后降低趨勢(shì)。在0～24 h時(shí)，DPPH 自由基清除率由最初62.61%上升至78.20%，ABTS+自由基清除能力在發(fā)酵18 h 時(shí)達(dá)到最大值，為64.48%，較發(fā)酵之前提高了20.38%，對(duì)FRAP 來(lái)說(shuō)，發(fā)酵時(shí)間為18～24 h 是發(fā)酵的較佳時(shí)期，其維持在1.1626 mmol/L 左右。由此可以看出，沙棘汁通過(guò)乳酸發(fā)酵可以不同程度提高DPPH 和ABTS+自由基的清除率以及FRAP，這可能因?yàn)槿樗峋诎l(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶能將酚糖苷水解為相應(yīng)的苷元，使它們具有更多的自由基清除特性[30-31]，但是發(fā)酵過(guò)程中沙棘汁抗氧化活性均顯著（P＜0.05）低于陽(yáng)性對(duì)照組（0.4 mg/mL 維生素C 的DPPH、ABTS+自由基清除率與FRAP 分別為90.27%、89.54%、2.393 mmol/L）；在發(fā)酵至24 h 后，沙棘汁抗氧化活性整體呈下降趨勢(shì)，這可能是因?yàn)榭寡趸衔锏慕到夂脱趸斐傻腫32]。

圖6 沙棘汁發(fā)酵過(guò)程中的抗氧化活性變化Fig.6 Changes of antioxidant activity in sea buckthorn juice during fermentation

由表8 可以看出，發(fā)酵后沙棘汁中黃酮、多酚與ABTS+自由基清除率和FRAP 顯著正相關(guān)（P＜0.05），乳酸與DPPH 自由基清除率、ABTS+自由基清除率和FRAP 均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），蘋(píng)果酸與DPPH和ABTS+自由基清除率均呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。說(shuō)明通過(guò)復(fù)合乳酸菌發(fā)酵沙棘汁，不僅可以達(dá)到降酸的效果，還可以顯著提高其抗氧化能力。

表8 發(fā)酵沙棘汁組分與抗氧化能力相關(guān)性分析Table 8 Correlation analysis between components and antioxidant capacity of fermented sea buckthorn juice

3 結(jié)論

通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化復(fù)合乳酸菌發(fā)酵沙棘汁優(yōu)選工藝為酒酒球菌:短乳桿菌比例為1:1、初始pH3.7、發(fā)酵溫度31 ℃、發(fā)酵時(shí)間18 h、接種量5%，發(fā)酵后沙棘汁總酸降解率為38.52%。在上述條件發(fā)酵后沙棘汁的黃酮、多酚含量增加，pH 上升，總酸和TSS 含量下降，還原糖變化不顯著；復(fù)合乳酸菌發(fā)酵改變了沙棘汁有機(jī)酸含量，其中蘋(píng)果酸降解率達(dá)94.59%，乳酸含量增加了904.07%，奎寧酸、抗壞血酸、酒石酸、草酸和檸檬酸含量變化不顯著（P＞0.05）；沙棘發(fā)酵汁對(duì)DPPH 和ABTS+自由基清除率及亞鐵離子還原力分別為78.20%、64.48%和1.1626 mmol/L，表明復(fù)合乳酸菌發(fā)酵沙棘汁，不僅可以降低其酸度，改善沙棘汁酸澀的口感，還能顯著提高其抗氧化活性。今后還需繼續(xù)研究復(fù)合乳酸菌發(fā)酵對(duì)該果汁風(fēng)味物質(zhì)的影響，以有效增強(qiáng)沙棘汁的品質(zhì)，為沙棘新型功能性食品的開(kāi)發(fā)與高值化利用提供依據(jù)。