動物雙歧桿菌聯(lián)合傳統(tǒng)發(fā)酵劑對發(fā)酵牛乳、牦牛乳品質(zhì)的影響

潘 坤，陳寒霜露，周海棟，廖彬旭，李巧艷，唐善虎，李思寧, ，劉 亮

（1.西南民族大學食品科學與技術(shù)學院，四川成都 610041；2.川北醫(yī)學院，四川南充 637100）

發(fā)酵乳是由乳酸菌在代謝過程中產(chǎn)酸，使原料乳經(jīng)過酸化作用形成的風味獨特、營養(yǎng)價值高、易消化的乳制品。益生菌常與傳統(tǒng)發(fā)酵劑復(fù)合用于生產(chǎn)益生菌發(fā)酵乳[1]。2001 年，WHO 和FAO 將益生菌定義為“經(jīng)適量食用后有益于宿主健康的活微生物”[2]，益生菌在預(yù)防和治療人類亞健康或疾病方面的應(yīng)用已經(jīng)得到了廣泛的報道[3]?，F(xiàn)如今人們普遍追求更加健康的生活方式，益生菌的地位愈加凸顯，而發(fā)酵乳制品則是其主要載體。工業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵乳大多使用牛乳作為主要發(fā)酵底物，隨著市場對含益生菌的非牛乳制品需求不斷增加[4]，牦牛乳由于含有比牛乳更高的蛋白質(zhì)、鈣、磷、鐵、鋅等礦物質(zhì)含量[5]，且具有潛在的抗癌、降血壓、抗氧化和降低膽固醇的特性，也被廣泛用于生產(chǎn)益生菌發(fā)酵乳。

近年來，國內(nèi)外學者對不同發(fā)酵組合制備的發(fā)酵乳也展開了一些研究。閆瑞宇等[6]采用GC-IMS技術(shù)對植物乳桿菌、動物雙歧桿菌聯(lián)合商業(yè)發(fā)酵劑制備的蕎麥發(fā)酵乳與普通發(fā)酵乳以及商業(yè)發(fā)酵劑制備的市售發(fā)酵乳進行分析，結(jié)果表明，蕎麥發(fā)酵乳中特征性風味物質(zhì)為3-甲基丁醛、2-甲基丁醛等，市售發(fā)酵乳中為2-戊酮、丁醛等，而實驗室自制發(fā)酵乳中風味物質(zhì)種類較少；此外，蕎麥發(fā)酵乳乙酸含量顯著高于市售發(fā)酵乳。Zhang 等[7]以發(fā)酵劑MY105 與發(fā)酵乳桿菌HY01 分別制備MY105 發(fā)酵牦牛乳、HY01 發(fā)酵牦牛乳、共發(fā)酵牦牛乳、共發(fā)酵牛乳，并以傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛乳作為對照，結(jié)果表明，共發(fā)酵牦牛乳比傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛乳、HY01 發(fā)酵牦牛乳、共發(fā)酵牛乳具有更高的表觀粘度，同時其共軛亞油酸含量顯著高于單種發(fā)酵劑發(fā)酵乳。任海東[8]以八種商業(yè)發(fā)酵劑分別發(fā)酵豆乳與牛乳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同發(fā)酵劑在不同底物中表現(xiàn)出不同的發(fā)酵特性。目前，暫未見關(guān)于動物雙歧桿菌聯(lián)合傳統(tǒng)發(fā)酵劑共培養(yǎng)對發(fā)酵牛乳、牦牛乳及其混合乳品質(zhì)影響的報道。

本試驗研究了動物雙歧桿菌與傳統(tǒng)發(fā)酵劑共培養(yǎng)條件下，發(fā)酵乳在4 ℃冷藏28 d 過程中酸化能力、活菌數(shù)、持水力、蛋白水解活力、流變特性、物理穩(wěn)定性、微觀結(jié)構(gòu)、揮發(fā)性風味物質(zhì)及感官特性變化，以探討不同發(fā)酵組合對發(fā)酵乳品質(zhì)的影響，為益生菌發(fā)酵乳工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

全脂牛乳粉（蛋白質(zhì)23.8 g/100 g、脂肪28.4 g/100 g、碳水化合物40.6 g/100 g） 新西蘭Maxigenes 公司；全脂牦牛乳粉（蛋白質(zhì)28.0 g/100 g、脂肪26.0 g/100 g、碳水化合物36.5 g/100 g） 紅原牦牛乳業(yè)有限責任公司；嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌混合（1:1）直投式商業(yè)發(fā)酵劑（SL） Danisco（北京）菌種有限公司；動物雙歧桿菌21716（Ba） 中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；MRS 肉湯培養(yǎng)基、MRS 培養(yǎng)基、MC 培養(yǎng)基 杭州微生物試劑有限公司；BL 培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；酚酞、乙醇、十二烷基硫酸鈉、鄰苯二甲醛、甲醇、三氯乙酸、L-亮氨酸、異丙醇、石油醚、硫酸、氫氧化鉀、氯化鈉、戊二醛、乙醇、叔丁醇， 成都科隆化學品有限公司；四硼酸鈉 天津瑞金特化學品有限公司；氫氧化鈉 成都金山化學試劑有限公司；β-硫基乙醇 百靈威科技有限公司；上述試劑均為分析純。

MP511 型pH 計 上海三信儀表廠；V1000 紫外可見分光光度計 上海翱藝公司；5804R 冷凍離心機 德國Eppendorf 公司；SW-CJ-1F 超凈工作臺蘇州市安泰空氣技術(shù)有限公司；MLS-3020 高壓滅菌鍋 日本三洋電器有限公司；TA-XT plus 質(zhì)構(gòu)儀英國Stable Micro Systems 公司；DISCOVERY HR-1 旋轉(zhuǎn)流變儀 美國TA 儀器；LUMiSizer 611 穩(wěn)定分析儀 德國Lum 公司；DHP-9162D 恒溫培養(yǎng)箱上海齊欣科學儀器有限公司；D-37520 真空冷凍干燥機 德國Christ 公司；Apreo 2C 掃描電子顯微鏡美國Thermo 公司；Trace DSQ 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（配Tripplus 自動進樣器） 美國Thermo 公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭 美國Supelco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化 動物雙歧桿菌在MRS 肉湯中于37 ℃厭氧條件下復(fù)活24 h，再在MRS 肉湯培養(yǎng)基中連續(xù)活化兩代后，轉(zhuǎn)移至滅菌牛乳中，在37 ℃培養(yǎng)8～9 h，使活菌數(shù)達到108CFU/g。

1.2.2 試驗設(shè)計 分別將牛乳粉和牦牛乳粉加入60 ℃溫水中（乳粉:水=1:7），攪拌至完全溶解，4 ℃過夜使乳粉充分水合，獲得固形物含量為12.5%（w/w）的復(fù)原牛乳和復(fù)原牦牛乳。使用90 ℃滅菌10 min并冷卻至43～45 ℃的牛乳（M）、牦牛乳（Y）、牛乳與牦牛乳1:1 復(fù)配乳（M+Y）作為發(fā)酵底物。在所有處理中，SL 按原料乳質(zhì)量的0.1%（w/w）添加，而Ba 不添加或按原料乳質(zhì)量的107CFU/g 添加，攪拌均勻后于42 ℃發(fā)酵至pH4.6，獲得SL/M、SL-Ba/M、SL/Y、SL-Ba/Y、SL/M+Y、SL-Ba/M+Y 發(fā)酵乳。隨后，將各組發(fā)酵乳轉(zhuǎn)移至（4±1）℃冰箱冷藏1、7、14、21、28 d，取樣測定指標。

1.2.3 酸化能力測定 使用pH 計測定發(fā)酵乳的pH。滴定酸度測定參照Li 等[9]的方法。發(fā)酵乳樣品5.0 g與5 mL 去離子水混勻，加入2 滴0.5%酚酞（95%乙醇溶液作為溶劑），用0.1 mol/L NaOH 標準溶液滴定至持續(xù)的淡粉色。根據(jù)消耗NaOH 標準溶液的量計算滴定酸度（°T）。

1.2.4 活菌數(shù)測定 活菌數(shù)參照GB 4789.35-2016[10]方法。發(fā)酵乳樣品25 g 與生理鹽水225 mL 充分混合。吸取1 mL 菌液用生理鹽水稀釋適宜的倍數(shù)后，分別使用MRS 培養(yǎng)基、MC 培養(yǎng)基和BL 培養(yǎng)基對保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和動物雙歧桿菌進行平板計數(shù)。乳酸菌活菌數(shù)以CFU/g 發(fā)酵乳表示。

1.2.5 持水力測定 持水力參照吳淼等[1]的方法測定。取一定質(zhì)量（W0）發(fā)酵乳樣品于離心管，8000×g離心15 min（4 ℃），傾去上清液，稱量剩余樣品的質(zhì)量（W）。按照公式（1）計算持水力（Water holding capacity，WHC）。

1.2.6 蛋白水解活力測定 蛋白水解活力參照Church 等[11]的方法。鄰苯二甲醛（OPA）試劑配制：0.1 mol/L 四硼酸鈉溶液50 mL、20%十二烷基硫酸鈉溶液5 mL、OPA（80 mg 鄰苯二甲醛溶解于2 mL甲醇，加入β-疏基乙醇200 μL 與之混勻）2.2 mL 混合后，用去離子水定容至100 mL。發(fā)酵乳樣品2.0 g和去離子水1 mL 混勻，加入0.75 mol/L 三氯乙酸5 mL，混合均勻并靜置10 min，4 ℃、4000×g 離心10 min，收集上清液。取上清液或去離子水（對照）200 μL，加入OPA 試劑4 mL，混勻，室溫下反應(yīng)10 min 后于340 nm 波長處測定吸光度。

1.2.7 流變特性 流變特性參照任然[12]的方法，并略有修改。用HR-1 流變儀測定發(fā)酵乳的流變特性。實驗條件為：頻率掃描在25 ℃環(huán)境下，角頻率由0.1～100 rad/s，每個數(shù)量級點數(shù)為16 個；剪切掃描在 25 ℃環(huán)境下，剪切速率由1 增加到100 s-1，每個數(shù)量級點數(shù)為25 個。

1.2.8 物理穩(wěn)定性 用穩(wěn)定性分析儀測定發(fā)酵乳的穩(wěn)定性。吸取0.5 mL 發(fā)酵乳置于2 mm PC 管中，光源波長865 nm，譜線條數(shù)為255 條，時間間隔為每10 s 掃描一次，轉(zhuǎn)速為2500 r/min，溫度為25 ℃進行檢測。

1.2.9 微觀結(jié)構(gòu) 微觀結(jié)構(gòu)參考Kristo 等[13]的方法。用勺子挑取冷藏28 d 發(fā)酵乳中心凝塊，大小約為：2 cm×2 cm×2 cm，在4 ℃條件下于2.5%的戊二醛溶液中固定12 h 以上，然后用生理鹽水沖洗兩次，每次15 min。分別用50%、70%和90%乙醇進行梯度洗脫，每次洗脫10 min，用100%乙醇洗脫三次，每次10 min，再用叔丁醇置換10 min。將樣品放入-80 ℃預(yù)冷24 h 以上，再置于真空冷凍干燥機中冷凍干燥12 h 以上。采用離子濺射儀在樣品表面鍍鉑金膜，利用發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察樣品的微觀結(jié)構(gòu)。

1.2.10 揮發(fā)性風味物質(zhì) 使用GC-MS 聯(lián)用儀測定發(fā)酵乳的揮發(fā)性風味物質(zhì)，參照任然[12]的方法。發(fā)酵乳樣品5 g 裝入頂空進樣瓶內(nèi)，加入2 g 氯化鈉，加蓋密封，樣品預(yù)孵化10 min 后用萃取頭吸附30 min，220 ℃解析附3 min，進行GC-MS 分析。色譜條件：采用TR-FFAP 色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣為99.999%氦氣，流速為1.0 mL/min，采用不分流模式；進樣口溫度為230 ℃；升溫程序：起始溫度40 ℃保持3 min，以5 ℃/min 升到140 ℃，并持續(xù)3 min，再以7 ℃/min 升到220 ℃，并保持3 min，解析時間2 min。質(zhì)譜條件：EI，正離子掃描模式，70 eV；離子源溫度為250 ℃，質(zhì)量掃描范圍為33～450 amu。發(fā)酵乳中風味物質(zhì)的鑒定以其保留時間和NIST 08 標準庫比對確定，最終報道正反匹配因子均大于800的結(jié)果。揮發(fā)性風味物質(zhì)含量（%）采用面積歸一化法，用各物質(zhì)的峰面積占總峰面積的百分比表示，即相對峰面積。參照劉登勇[14]的方法，采用相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）法評價不同發(fā)酵乳樣品的香氣組分對主體香味的貢獻程度。定義對樣品整體風味貢獻程度最大的組分ROAVstan為100，對其他風味化合物的ROAV 按公式（2）計算：

式中：Ci和Ti為該揮發(fā)性化合物的相對含量（%）和感覺閾值（μg/kg）；Cstan和Tstan為對整體風味貢獻最大的揮發(fā)性化合物的相對含量（%）和感覺閾值（μg/kg）。

1.2.11 感官特性 邀請6 名經(jīng)過感官評價訓練的人員，男女各一半，從產(chǎn)品的色澤、組織狀態(tài)、滋味以及氣味四方面進行感官評定。滿分為100 分，感官評分標準參照李思寧等[15]的方法，見表1。

表1 發(fā)酵乳的感官評分標準Table 1 Sensory evaluation criteria of fermented milks

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復(fù)三次，結(jié)果以平均值±標準偏差表示。使用SPSS 26.0 單因素方差分析（ANOVA）中的Duncan 法檢測各處理平均值的差異顯著性；使用一般線性模型中的單變量檢測不同組別發(fā)酵乳在冷藏期間的差異顯著性。P＜0.05 表示差異顯著。運用Origin 2021 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵劑與發(fā)酵底物對發(fā)酵乳酸化能力的影響

測定酸化能力能夠了解不同發(fā)酵劑在發(fā)酵體系中產(chǎn)酸速度的快慢。冷藏期間，發(fā)酵乳的pH 和滴定酸度變化結(jié)果見圖1 和圖2。從圖1 可以看出，隨著冷藏時間延長，各組發(fā)酵乳pH 顯著降低（P＜0.05）。對不同發(fā)酵乳pH 統(tǒng)計分析表明，采用同一發(fā)酵劑條件下，發(fā)酵牦牛乳組＞發(fā)酵混合乳組＞發(fā)酵牛乳組。牛乳和牦牛乳中的乳糖含量不同，導(dǎo)致酸的積累速度和總量不同[16]。對于相同的發(fā)酵底物，動物雙歧桿菌參與發(fā)酵可顯著降低發(fā)酵乳的pH（P＜0.05），這可能歸因于動物雙歧桿菌與傳統(tǒng)發(fā)酵劑共同作用于乳基質(zhì)，促進了乳糖的分解和乳酸的積累。這與李思寧等[17]報道的結(jié)果一致。

圖1 發(fā)酵乳在冷藏期間的pHFig.1 pH of fermented milk during refrigeration

圖2 發(fā)酵乳在冷藏期間的滴定酸度Fig.2 Titratable acidity of fermented milk during refrigeration

滴定酸度可以反映包括肽和游離氨基酸殘基在內(nèi)的所有酸性基團總和[18]。由圖2 可以看出，隨著冷藏時間延長，各組發(fā)酵乳的滴定酸度顯著增加（P＜0.05），其上升趨勢與pH 顯著降低的趨勢相呼應(yīng)。采用同一發(fā)酵劑條件下，不同發(fā)酵乳酸度由高到低依次為：發(fā)酵牛乳、發(fā)酵混合乳、發(fā)酵牦牛乳。SLBa/M 組的酸度顯著高于SL/M 組，SL-Ba/Y 組的酸度顯著高于SL/Y 組，SL-Ba/M+Y 組的酸度顯著高于SL/M+Y 組（P＜0.05），不難看出，動物雙歧桿菌參與發(fā)酵可顯著增加發(fā)酵乳的酸度。

2.2 活菌數(shù)

冷藏期間發(fā)酵乳中活菌數(shù)變化見圖3。由圖3可以看出，隨著冷藏時間增加，所有發(fā)酵乳中保加利亞乳桿菌活菌數(shù)在1～7 d 顯著增加，隨后顯著下降（P＜0.05）。推測在冷藏前期，保加利亞乳桿菌處于對數(shù)期，且發(fā)酵乳中營養(yǎng)物質(zhì)充足，保證了乳酸菌的生長繁殖；到冷藏中后期，乳酸菌度過對數(shù)生長期，且發(fā)酵乳中營養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗，活菌數(shù)減少。武士美[19]也在發(fā)酵乳中發(fā)現(xiàn)保加利亞乳桿菌有類似的變化趨勢。對于相同的乳基質(zhì)，含有動物雙歧桿菌的發(fā)酵乳中保加利亞乳桿菌數(shù)顯著高于不含動物雙歧桿菌的發(fā)酵乳（P＜0.05），可能是共培養(yǎng)體系中，三株菌能夠互相促進生長[20]，因此添加動物雙歧桿菌能夠提高并維持嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌的數(shù)量。SL/M 組發(fā)酵乳中保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌活菌數(shù)顯著高于SL/Y 組和SL/M+Y 組，SL-Ba/M 組顯著高于SL-Ba/Y 和SL-Ba/M+Y 組（P＜0.05），原因是這兩種乳酸菌主要利用乳糖作為碳源為其生長提供能量[21]，而牛乳中乳糖含量顯著高于牦牛乳[16]。

圖3 發(fā)酵乳在冷藏期間的活菌數(shù)Fig.3 Viable bacteria count of fermented milk during refrigeration

嗜熱鏈球菌活菌數(shù)在1～7 d 內(nèi)顯著增加，隨后顯著減少（P＜0.05）。這與任然[12]研究結(jié)果一致。嗜熱鏈球菌活菌數(shù)的下降與發(fā)酵乳酸度的升高有關(guān)，隨著乳酸菌分解乳糖產(chǎn)酸，體系中酸度升高，嗜熱鏈球菌的生長受到抑制，同時，隨著儲藏時間的延長，體系中嗜熱鏈球菌能利用的營養(yǎng)成分也逐漸減少，導(dǎo)致嗜熱鏈球菌活菌數(shù)減少[22]。

各組發(fā)酵乳中動物雙歧桿菌活菌數(shù)在1～7 d 增顯著加，隨后顯著減少（P＜0.05）。在整個冷藏期間，SL-Ba/M 組的動物雙歧桿菌活菌數(shù)顯著高于SLBa/Y 和SL-Ba/M+Y 組（P＜0.05），推測是乳糖水解后會生成低聚糖[23]，而牛乳中乳糖的含量顯著高于牦牛乳[16]，使得不同乳基質(zhì)中低聚糖的組成和含量有所區(qū)別。又有研究表明，低聚糖可以刺激雙歧桿菌的生長[24]，進而導(dǎo)致不同的發(fā)酵乳中動物雙歧桿菌的數(shù)量有所不同。

2.3 持水力

酪蛋白形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)決定了發(fā)酵乳的持水力，較高的持水力會使發(fā)酵乳較長時間保持產(chǎn)品的感官及質(zhì)地。由圖4 可以看出，在冷藏期間，所有發(fā)酵乳持水力均在1～7 d 顯著增加，隨后顯著減少（P＜0.05）。冷藏初期（1～7 d），酪蛋白膠束之間的吸引力強度較弱，從而保持了凝膠中的較多孔隙，減少自然脫水，導(dǎo)致持水力增加[25]。冷藏7 d 之后，pH 持續(xù)降低導(dǎo)致凝膠中蛋白網(wǎng)絡(luò)重排，粒子-粒子連接數(shù)量增加，使得凝膠收縮，排出其間隙液即乳清，從而降低持水力[26]。相同的變化趨勢也被潘瀟[27]報道。1～21 d，SL/Y 組持水力顯著高于SL/M 組和SL/M+Y組（P＜0.05）；在28 d 時，SL/Y 組與SL/M 組差異不顯著（P＞0.05），但SL/Y 和SL/M 組持水力顯著高于SL/M+Y 組（P＜0.05）。在1～14 d，SL-Ba/M+Y 組的持水力顯著高于SL-Ba/M組和SL-Ba/Y 組（P＜0.05）；在21～28 d，SL-Ba/M+Y 組的持水力顯著高于SLBa/M 組（P＜0.05），與SL-Ba/Y組無顯著差異（P＞0.05），推測發(fā)酵混合乳在SL-Ba 的作用下可能會形成更加細密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)來更好地維持發(fā)酵乳的持水力。

圖4 發(fā)酵乳在冷藏期間的持水力Fig.4 Water-holding capacity of fermented milk during refrigeration

2.4 蛋白水解活力

牛乳中的游離氨基酸和肽僅能支撐乳酸菌繁殖2～3 代，因此乳酸菌需要借助自身蛋白水解系統(tǒng)將乳中酪蛋白降解成氨基酸和肽來滿足生長。在這個過程中，因蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的游離氨基酸和小肽也會改善發(fā)酵乳的風味[28]。從圖5 可以看出，SL/M 組、SLBa/M 組的蛋白水解活力在冷藏期內(nèi)持續(xù)上升（P＜0.05）；SL/Y 組、SL-Ba/Y 組、SL/M+Y 組的蛋白水解活力在1～14 d 顯著上升，隨后顯著下降（P＜0.05）；SL-Ba/M+Y 組的蛋白水解活力在1～14 d 上升，在后續(xù)冷藏期內(nèi)無顯著差異（P＞0.05）。這表明，發(fā)酵乳的蛋白水解活力與發(fā)酵劑、發(fā)酵底物關(guān)系較大。在發(fā)酵牛乳組中，SL-Ba/M 組的蛋白水解活力在整個冷藏期顯著高于SL/M 組（P＜0.05），原因是添加動物雙歧桿菌的組總活菌數(shù)要多于未添加動物雙歧桿菌的組，并且動物雙歧桿菌也擁有一定的游離氨基釋放能力[17]。在發(fā)酵牦牛乳組中，SL-Ba/Y 組的蛋白水解活力在1、21 d 顯著高于SL/Y 組（P＜0.05），其余時間無顯著差異（P＞0.05），推斷動物雙歧桿菌能夠很好的維持發(fā)酵牦牛乳中的蛋白水解活力，使SL-Ba/Y 組蛋白水解活力的上升速度快于SL/Y 組，下降速度慢于SL/Y 組。在發(fā)酵混合乳組中，SL-Ba/M+Y 組的蛋白水解活力在1 d 時顯著高于SL/M+Y 組（P＜0.05），其余時間無顯著差異（P＞0.05），推斷動物雙歧桿菌在發(fā)酵混合乳中的蛋白代謝活動僅在冷藏初期較強。

圖5 發(fā)酵乳在冷藏期間的蛋白水解活力Fig.5 Proteolytic activity of fermented milk during refrigeration

2.5 流變特性

儲能模量（G′）也稱彈性模量，表示當物體受到外力作用時的形變程度，可以反映樣品彈性形變能力的大??；G′越大說明物體受到外力作用時的形變程度越小。損耗模量（G′）也稱黏性模量，表示物體受到外力作用時阻礙其流動的特性，可以一定程度上反映樣品的黏性；G′′越大說明物體受到外力作用時越不容易流動[29]。從圖6 可以看出，各組發(fā)酵乳的G′都大于G′′，說明發(fā)酵乳的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，能夠承受高頻率的破壞，表現(xiàn)的更像固體[12]。隨著冷藏時間的增加，SL/M 組、SL-Ba/M 組、SL/Y 組的G′和G′上升；SL-Ba/Y組的G′和G′′無明顯變化；SL/M+Y 組G′和G′′下降；SL-Ba/M+Y 組的G′、G′′上升。SL/M+Y 組隨著冷藏時間的增加，受到外力作用時，更容易發(fā)生形變，更容易流動，變得更像液體，其余五組都變得越來越穩(wěn)定，越來越像固體。后酸化能夠促進酪蛋白顆粒不斷融合，提升發(fā)酵乳的穩(wěn)定性[30]，因此可以推斷動物雙歧桿菌在發(fā)酵混合乳中能夠促進發(fā)酵乳后酸化過程中酪蛋白顆粒的融合。SL/Y 組在28 d 表現(xiàn)出過高的G′、G′′，推測是大量乳清析出，導(dǎo)致發(fā)酵乳凝乳結(jié)塊。其中SL-Ba/Y 組的G′、G′′低于SL/Y 組，但是高于SL/M 組、SL-Ba/M 組、SL/M+Y 組、SL-Ba/M+Y組，這表明其凝膠結(jié)構(gòu)更多，因此會表現(xiàn)出更加厚重的口感[31]。

圖6 發(fā)酵乳在冷藏期間的流變特性Fig.6 Rheological property of fermented milk during refrigeration

2.6 物理穩(wěn)定性

不穩(wěn)定指數(shù)可以衡量乳液的穩(wěn)定性。在相同條件下，不穩(wěn)定指數(shù)越接近于1，說明發(fā)酵乳分離越快，發(fā)酵乳越不穩(wěn)定[32]。由表2 可知，SL/M 組各相鄰冷藏期無顯著變化（P＞0.05），但21～28 d 相比1～7 d 有顯著下降（P＜0.05）。SL-Ba/M 組的不穩(wěn)定指數(shù)在14～21 d 顯著下降（P＜0.05）。SL/Y 組不穩(wěn)定指數(shù)先增加后顯著下降（P＜0.05），于14 d 達到最大值。SL-Ba/Y組不穩(wěn)定指數(shù)在1～7 d 增加（P＜0.05），隨后無顯著變化（P＞0.05）。SL/M+Y 組在21～28 d 下降（P＜0.05），其余時間無顯著變化（P＞0.05）。SL-Ba/M+Y 組不穩(wěn)定指數(shù)在各相鄰冷藏期無顯著變化（P＞0.05），但21 d 對比7 d 有顯著下降（P＜0.05）。不穩(wěn)定指數(shù)降低，代表發(fā)酵乳不易沉淀分層，凝膠網(wǎng)絡(luò)變得更加穩(wěn)定，發(fā)酵乳持水力升高[32]。SL/Y 組與SL-Ba/Y 組與前述持水力的結(jié)果一致，而其余四組推測是發(fā)酵乳酸度過高，對蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的影響過大而導(dǎo)致與持水力結(jié)果不符。由表2 可以看出，同種發(fā)酵底物，不同發(fā)酵劑的發(fā)酵乳不穩(wěn)定指數(shù)差別不顯著（P＞0.05），推斷動物雙歧桿菌對發(fā)酵乳的不穩(wěn)定指數(shù)影響不大。發(fā)酵牦牛乳組的不穩(wěn)定指數(shù)顯著高于發(fā)酵牛乳組（P＜0.05），原因是發(fā)酵乳中酪蛋白表面大部分帶有正電荷，在酸性條件下會相互聚集[33]，而牦牛乳中酪蛋白的含量顯著高于牛乳[5]，更容易聚集成團，形成沉淀。

表2 發(fā)酵乳在冷藏期間的不穩(wěn)定指數(shù)Table 2 Instability index of fermented milk during refrigeration

2.7 微觀結(jié)構(gòu)

凝固型發(fā)酵乳具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且這種網(wǎng)狀纖維中間有無數(shù)大小不一且呈六棱形的空隙，乳脂肪球與乳酸菌通常貫穿其中，使這種凝膠結(jié)構(gòu)更加嚴密而堅實，從而提高發(fā)酵乳凝膠的持水力[34]。從圖7中能看出，所有組的發(fā)酵乳都形成了這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)都是由球形酪蛋白膠束堆砌而成，很少形成鏈段，因此這種結(jié)構(gòu)比較脆弱，強度較低[35]。有研究表明，在發(fā)酵乳的間隙中主要是由乳清和微生物菌體填充，而冷凍干燥的處理方法會使得乳酸菌菌體爆裂因而無法看見[36]，這與本研究的結(jié)果一致。在28 d 時，可以看到添加動物雙歧桿菌的發(fā)酵乳微觀結(jié)構(gòu)顯得有更多、更大的孔隙，因此會持留更多的水分，降低乳清析出，提高持水力，這與前述持水力的表現(xiàn)一致。與發(fā)酵牦牛乳組相比，發(fā)酵牛乳組形成的蛋白網(wǎng)絡(luò)更疏松，凝膠顆粒更細小，因此會更加難以分層，這與前述穩(wěn)定性分析結(jié)果一致。在不同底物發(fā)酵乳中，發(fā)酵牦牛乳組形成的蛋白凝膠結(jié)構(gòu)更加緊密，表面聚集物形成的結(jié)構(gòu)更大，使得發(fā)酵乳更容易沉降，這與前述穩(wěn)定性分析的結(jié)果一致，此種發(fā)酵乳的微觀結(jié)構(gòu)與盛嘉睿[37]觀察到的情況相近。在6 組發(fā)酵乳中，SL-Ba/M+Y 組的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)最為繁雜，孔隙最多最密集，因此其能夠固定更多的水分，這與前述持水力的結(jié)果一致。

2.8 揮發(fā)性風味物質(zhì)

風味是評估發(fā)酵乳品質(zhì)的主要指標之一[38]。由表3 看出，冷藏期內(nèi)不同發(fā)酵乳中共檢測出131 種揮發(fā)性風味物質(zhì)。包括醛類化合物（27 種）、醇類化合物（22 種）、酮類化合物（16 種）、烴類化合物（23 種）、酯類化合物（13 種）、酸類化合物（8 種）以及其他化合物（12 種）。在各組發(fā)酵乳中，醛類、醇類、酮類是占比較大的風味物質(zhì)。

表3 發(fā)酵乳在冷藏期間的揮發(fā)性風味物質(zhì)Table 3 Volatiles of fermented milk during refrigeration

對表3 進行主成分分析，取特征值＞1 和累計貢獻率＞70%的物質(zhì)種類作為主成分[39]。由圖8 可知，發(fā)酵乳揮發(fā)性風味物質(zhì)有三個主成分，第一主成分（PC1）貢獻率為34.958%，構(gòu)成成分是醛類、酮類、烴類；第二主成分（PC2）貢獻率為24.297%，構(gòu)成成分是醇類和其他；第三主成分（PC3）貢獻率為20.979%，構(gòu)成成分是醇類和酯類。由圖9 可以看出，不同發(fā)酵乳在不同發(fā)酵時間在得分上具有差異。在第1 d，發(fā)酵底物相同的組得分接近。SL/M 第28 d 和SL/M+Y 第14 d 在第一主成分上得分較高；SL/M 第1 d 和SLBa/M 第1 d 在第二主成分上得分較高；SL/M 第28 d和SL-Ba/Y 第28 d 在第三主成分上得分較高。

圖8 揮發(fā)性風味物質(zhì)的因子載荷分析圖Fig.8 Factor loading analysis diagram of volatiles

圖9 各樣品PCA 得分散點圖Fig.9 Distribution points of samples on different principal components

不同冷藏時間的發(fā)酵乳關(guān)鍵風味貢獻物質(zhì)結(jié)果以熱圖表示。發(fā)酵乳中共確定30 種關(guān)鍵風味物質(zhì)（ROAV≥1）。隨著冷藏時間的增加，SL/M 組關(guān)鍵風味物質(zhì)種類逐漸減少，而SL-Ba/M 組數(shù)量保持恒定；SL/Y 組關(guān)鍵風味物質(zhì)在1～14 d 增加而在14～28 d減少，但SL-Ba/Y 組隨冷藏時間增加而增加；SL/M+Y 組的關(guān)鍵風味物質(zhì)隨冷藏時間的增加出現(xiàn)先減少后增加的趨勢，而SL-Ba/M+Y 組持續(xù)增加。因此可以判斷添加動物雙歧桿菌有助于關(guān)鍵性風味物質(zhì)的增加，原因是多種乳酸菌共培養(yǎng)增加了更多的代謝途徑使發(fā)酵乳產(chǎn)生了更多的風味物質(zhì)[40]。

醛類化合物是各種氧化風味的來源，可通過如脂質(zhì)氧化和分解等多種途徑產(chǎn)生[41]。各組樣品的揮發(fā)性風味物質(zhì)均包括壬醛，壬醛能夠給發(fā)酵乳帶來類似柑橘和脂肪的香味[42]，其在各樣品中的ROAV 值均大于1，被認為是關(guān)鍵風味貢獻物。發(fā)酵乳中呈現(xiàn)油脂味的醛類化合物還包括:庚醛、反-2-壬烯醛及反-2-辛烯醛等[43]。正辛醛具有強烈的水果香味，癸醛具有橙皮、牛油香氣[43]。

醇類化合物一般由糖類、氨基酸和醛類物質(zhì)發(fā)生還原反應(yīng)而產(chǎn)生，但醇類物質(zhì)的閾值較高，所以對發(fā)酵乳風味的影響較低[44]。圖10 中，關(guān)鍵風味貢獻物中的醇類僅葉綠醇、糠醇、1-辛烯-3-醇、庚醇4 種。葉綠醇在SL/M 組1 d 時作為關(guān)鍵風味貢獻物質(zhì)；糠醇在SL-Ba/Y 組1 d 時作為關(guān)鍵風味貢獻物質(zhì)；1-辛烯-3-醇擁有蘑菇風味，可能來自于脂類的分解[19]，在SL/M 組1 d 時、SL-Ba/M 組1 d 時、SL/M+Y 組1 d 時作為關(guān)鍵風味物質(zhì)，可以判斷1-辛烯-3-醇僅僅在牛乳或含牛乳的發(fā)酵乳中作為關(guān)鍵風味物質(zhì)，且會受到動物雙歧桿菌的影響使得該種脂類更少的被分解為1-辛烯-3-醇。

圖10 發(fā)酵乳在冷藏過程中的ROAV 值Fig.10 ROAV value of fermented milk during refrigeration

酮類化合物具有獨特的風味，這些酮類的形成途徑是通過氨基酸或不飽和脂肪酸的氧化分解，或是乳酸菌的代謝過程產(chǎn)生的[45]。由圖10 可以看出，酮類中的關(guān)鍵風味物質(zhì)很少，只有甲基壬基甲酮、2-壬酮、2,3-戊二酮3 種，其中甲基壬基甲酮和2-壬酮主要在發(fā)酵牦牛乳組和發(fā)酵混合乳中出現(xiàn)作為關(guān)鍵風味物質(zhì)。2,3-戊二酮的特征香氣是帶有堅果香的奶油焦糖味[46]，而甲基壬基甲酮和2-壬酮則具有酸漿蕓香、果香、椰子和奶油的香味[47]。

2.9 感官評定

由圖11 可知，各組發(fā)酵乳的感官評分在1～7 d上升，隨后下降（P＜0.05）。隨著冷藏時間的增加，發(fā)酵乳感官品質(zhì)發(fā)生變化，其在冷藏后期的色澤、組織狀態(tài)、滋味和氣味都比冷藏前中期差。添加了動物雙歧桿菌的發(fā)酵乳感官評分要高于未添加動物雙歧桿菌的樣品，可以推斷動物雙歧桿菌的加入使得發(fā)酵乳產(chǎn)生了更多的風味物質(zhì)，擁有更好的感官特征，這點與前述風味的結(jié)果一致。在冷藏前中期，SL-Ba/M組的感官高于其他組，這與前述的物理穩(wěn)定性分析結(jié)果一致。在冷藏后期，由于酸度的進一步增加、持水力下降等因素，使得各組發(fā)酵乳的感官出現(xiàn)了明顯下降（P＜0.05）。

圖11 發(fā)酵乳在冷藏期間的感官評分變化Fig.11 Sensory score changes of fermented milk during refrigeration

3 結(jié)論

本文研究了不同發(fā)酵劑、發(fā)酵底物對發(fā)酵乳理化特性、蛋白水解活力、流變特性、物理穩(wěn)定性、微觀結(jié)構(gòu)、揮發(fā)性風味與感官特性等指標的影響。結(jié)果表明，對于相同發(fā)酵底物，動物雙歧桿菌聯(lián)合傳統(tǒng)酸奶發(fā)酵劑共培養(yǎng)，能提升發(fā)酵乳的酸化能力、活菌數(shù)及蛋白水解活力，改善發(fā)酵乳的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、揮發(fā)性風味與感官品質(zhì)，但不影響發(fā)酵乳的物理穩(wěn)定性。對于相同發(fā)酵劑，牛乳發(fā)酵乳活菌數(shù)最多，酸化能力、蛋白水解活力與物理穩(wěn)定性最好；牦牛乳發(fā)酵乳粘彈性最優(yōu)；混合乳發(fā)酵乳持水力最高，凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)最致密，關(guān)鍵風味物質(zhì)種類最多。本研究表明，動物雙歧桿菌聯(lián)合傳統(tǒng)發(fā)酵劑共培養(yǎng)可以改善發(fā)酵乳品質(zhì)，且相比于牦牛乳，牛乳和混合乳更適合作為發(fā)酵底物。本文并未從乳酸菌代謝物方面探究發(fā)酵乳品質(zhì)發(fā)生變化的原因，未來需要進一步通過代謝組學技術(shù)來揭示不同發(fā)酵劑作用于不同發(fā)酵底物的代謝物變化與發(fā)酵乳品質(zhì)形成的關(guān)系。