雜合抗菌肽NK-LPd 的設(shè)計(jì)、表達(dá)及抑菌活性評(píng)價(jià)

劉子琦，劉正宇，郭銀虹，王鴻飛，姚 波,2,

（1.重慶科技學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，重慶 401331；2.工業(yè)發(fā)酵微生物重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 401331）

抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs）是一類廣泛存在于自然界中的多肽，是生物體先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，對(duì)細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)和病毒具有廣泛的抑制作用[1]。由于超級(jí)耐藥菌的出現(xiàn)以及對(duì)抗生素的過(guò)度使用促進(jìn)了AMPs 研究發(fā)展，其在醫(yī)藥、食品、畜牧、農(nóng)業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景[2]。AMPs 通過(guò)與細(xì)菌細(xì)胞膜相互作用，導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷和細(xì)菌死亡，或是與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)相互作用使細(xì)菌死亡[3]。

Piscidin 是一類最常見(jiàn)的抗菌肽，具有廣譜抗菌、抗真菌和抗病毒活性，但Piscidin 家族抗菌肽分子質(zhì)量較小且容易降解，導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)量低，成為其生產(chǎn)應(yīng)用的主要瓶頸[4]?？咕腘K-lysin 是一類由細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生的具有多功能的抗菌肽，其成熟肽具有六個(gè)保守的半胱氨酸以及一個(gè)Saposin B 結(jié)構(gòu)域[5]，而NK-lysin 含有74～78個(gè)氨基酸殘基，難以通過(guò)化學(xué)法或生物法合成，研究證實(shí)NK-lysin 的短截肽也具有抗菌活性，甚至較母體肽的抗菌活性更強(qiáng)[6]。雜合抗菌肽是通過(guò)將兩個(gè)或多個(gè)抗菌肽的部分序列重新組合形成一個(gè)新的雜合肽[7]。本研究采用雜合的方式，基于抗菌活性和結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系對(duì)銀鯽（Carassius gibelio）的NK-lysin和Piscidin 進(jìn)行優(yōu)化改造，改善兩親性和疏水性以提高其對(duì)細(xì)菌的選擇性和抗菌活性。應(yīng)用生物信息學(xué)等方法獲得NK-lysin 和Piscidin 的保守片段，采用甘氨酸接頭連接得到雜合抗菌肽，利用重疊延伸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（gene splicing by overlap extension polymerase chain reaction，SOE-PCR）技術(shù)合成雜合肽基因NK-LPd，在畢赤酵母KM71 中表達(dá)，評(píng)價(jià)其抗菌活性，以期獲得一種具有更高抗菌活性和更廣抗菌譜的雜合抗菌肽，為制備新型抗菌藥物、飼料添加劑或免疫增強(qiáng)劑提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

銀鯽（Carassius gibelio） 購(gòu)自大學(xué)城菜市場(chǎng)，飼養(yǎng)于本實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)魚(yú)箱；畢赤酵母菌株KM71 購(gòu)自上海瑞楚生物；表達(dá)載體pPIC9K 由重慶擎科生物提供；大腸桿菌（Escherichia coli，ATCC 25923）、金黃葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC 25923）、沙門(mén)氏菌（Salmonella enterica，ATCC 12022）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，ATCC 27853）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila，ATCC 7966）由本實(shí)驗(yàn)室保存；柱式質(zhì)粒提取試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒、酵母RNA 提取試劑盒、DNA Marker A（25～500 bp） 均購(gòu)自生工生物工程有限股份公司；限制性內(nèi)切酶EcoRI、NotI、SacI-HF 購(gòu)自New England Business Services 公司；DL2000 DNA Marker、DNA 連接試劑盒 購(gòu)自TaKaRa 公司；低分子量預(yù)染蛋白Marker 購(gòu)自Thermo Scientific 公司；其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

A200 型PCR 擴(kuò)增儀 杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；6132 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 德國(guó)Eppendorf公司；蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng) 伯樂(lè)Bio-Rad；1100/26M 凝膠成像系統(tǒng) Quantum ST4；ZQTY-70N 型恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；LC5090 高效液相色譜系統(tǒng) 浙江福立分析儀器股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雜合肽的設(shè)計(jì) 取銀鯽（Carassius gibelio）的NK-lysin 氨基酸序列（XP_052436046.1）與NKL-24[8]氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，獲得同源部分，從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中收集Piscidin 家族的氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)，獲得保守序列，再用兩個(gè)甘氨酸（GG）作接頭將兩個(gè)片段連接得雜合肽序列。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 利用Expasy 中的在線服務(wù)器Prot Param 分析雜合抗菌肽NK-LPd 的理化性質(zhì)，Prot Scale 預(yù)測(cè)雜合肽NK-LPd 的親水、疏水性，Helical Wheel Projections 繪制雜合肽NK-LPd 的三維螺旋輪圖，在線服務(wù)器SOPM Secondary Structure Prediction 預(yù)測(cè)雜合肽NK-LPd 的二級(jí)結(jié)構(gòu)，I-TASSER[9]預(yù)測(cè)NK-LPd 的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.3 目的基因片段的合成 為了使表達(dá)后的抗菌肽具有天然的N 端，在雜合肽序列N 端加上Kex2蛋白酶裂解位點(diǎn)，在C 端加上6×His 標(biāo)簽便于后續(xù)純化。參照畢赤酵母偏好性密碼子翻譯得到優(yōu)化后的核苷酸序列，在雜合抗菌肽核苷酸序列的5'端加上EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，在3'端加上終止密碼子（TAA）和NotⅠ酶切位點(diǎn)。根據(jù)其序列設(shè)計(jì)4 條引物NL 1、NL 2 和NL 3、NL 4（表1）兩兩互為模板，采用SOEPCR（兩次PCR，第一次PCR 的產(chǎn)物作為第二次PCR的模板）的方法合成目的基因。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 SOE-PCR 使用的引物序列Table 1 The sequences of primers used in SOE-PCR

1.2.4 pPIC9K-NK-LPd表達(dá)載體的構(gòu)建 將獲得的PCR 產(chǎn)物和質(zhì)粒pPIC9K DNA 分別用限制性內(nèi)切酶EcoRI 和NotI 進(jìn)行雙酶切，利用DNA 凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)目的片段然后用T4 DNA 連接酶連接，得到重組質(zhì)粒pPIC9K-NK-LPd，用重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，用含Amp 的LB平板篩選獲得陽(yáng)性克隆。將陽(yáng)性克隆送測(cè)序鑒定。

1.2.5 畢赤酵母KM71 的轉(zhuǎn)化及篩選 用含有氨芐青霉素LB 培養(yǎng)液過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，SacI-HF 酶切線性化后轉(zhuǎn)化入畢赤酵母KM71。用不含組氨酸的MD 平板篩選后，加1 mL 無(wú)菌水重懸轉(zhuǎn)化子，將菌液依次涂布于G418 濃度為1.0、2.0、3.0 mg/mL的YPD 平板上篩選高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子。使用載體的引物5'AOX 和3'AOX，PCR 檢測(cè)獲得陽(yáng)性重組菌株KM71/pPIC9K-NK-LPd，空載體轉(zhuǎn)化的酵母菌株作為陰性對(duì)照。

1.2.6 酵母菌的RT-PCR 取重組酵母菌液，用酵母菌RNA 提取試劑盒提取重組酵母RNA，由反轉(zhuǎn)錄為cDNA 第1 條鏈，以此為模板，用特異性引物NL 1 和3'AOX 進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 3 min，變性94 ℃ 30 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，循環(huán)數(shù)35，4 ℃ ∞[10]。

1.2.7 重組酵母的誘導(dǎo)表達(dá) 挑取篩選獲得的高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子，接種于YPD 培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。取1 mL 菌液接種于100 mL BMGY 培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至OD600=2～6，離心，收集菌體，棄上清，用滅菌水清洗菌體沉淀，離心，棄上清。用20 mL BMMY 培養(yǎng)液重懸菌體沉淀，轉(zhuǎn)入錐形瓶振蕩培養(yǎng)，用100%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，每隔24 h 加一次甲醇至終濃度仍為0.5%，誘導(dǎo)表達(dá)5 d 后，12000 r/min，10 min 離心收集上清，使用TCA 法濃縮蛋白，用于Tricine-SDSPAGE 檢測(cè)。

1.2.8 重組雜合肽的純化 將上清液與等體積Binding Buffer（5 mmol/L 咪唑）混合后上柱，使用15 倍柱體積的Binding Buffer 沖洗層析柱，洗去雜蛋白，然后使用Eluent Buffer（25 mmol/L 咪唑）沖洗層析柱，直至收集的洗脫液在280 nm 處的吸光度接近基線，收集洗脫液，將純化后的蛋白進(jìn)行HPLC 鑒定。

1.2.9 HPLC 條件 本實(shí)驗(yàn)采用液相色譜柱為C18柱（4.6×250 mm×5 μm），Pump A：含0.1%三氟乙酸的水，Pump B：含0.1%三氟乙酸的乙腈，流速控制為1 mL/min，保持色譜柱溫度為32 ℃，進(jìn)樣量：40 μL，波長(zhǎng)：214 nm[11]。

1.2.10 重組雜合肽的抗菌活性評(píng)價(jià) 采用瓊脂糖擴(kuò)散法初步測(cè)定重組表達(dá)產(chǎn)物的抗菌活性及抗菌譜[12]。選擇大腸桿菌、金黃葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、銅綠假單胞菌和嗜水氣單胞菌作為供試菌。用液體培養(yǎng)基將菌稀釋至1×106CFU/mL，按照1%的比例接種至固體培養(yǎng)基中，混勻后傾注平板。待平板冷卻后，用滅菌的打孔器打孔，向孔中加入100 μL 純化后的抗菌肽溶液，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，以直徑表示抑菌圈的大小。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

全部數(shù)據(jù)用Excel 2019 計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，使用Origin 9.0 軟件作圖。所有實(shí)驗(yàn)檢測(cè)均重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜合抗菌肽的設(shè)計(jì)

NK-lysin 序列比對(duì)結(jié)果如圖1 所示，獲得同源部分：IKIKLGMICDEIGFLKSMCRNLVN。再?gòu)腘CBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中收集Piscidin 家族的氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)，Piscidin 序列比對(duì)結(jié)果如圖2，獲得保守序列：HHIFRGIVH。再采用兩個(gè)甘氨酸接頭（GG，以方框表示）將兩個(gè)片段連接得到雜合肽序列：HHIFRGIVHGGIKIKLGMICDEIGFLKSMCRNLVN。

圖1 NK-lysin 序列比對(duì)結(jié)果Fig.1 NK-lysin sequence alignment results

圖2 Piscidin 序列比對(duì)結(jié)果Fig.2 Piscidin sequence alignment results

2.2 雜合抗菌肽NK-LPd 的生物信息學(xué)分析

雜合抗菌肽的理化性質(zhì)如表2 所示，預(yù)期分子量為3950.80 Da，理論等電點(diǎn)為9.39，理化性質(zhì)較穩(wěn)定。由螺旋輪圖3b 和疏水性圖3a 可知，雜合肽NKLPd 包含13 個(gè)親水性氨基酸殘基；11 個(gè)疏水性氨基酸；2 個(gè)帶負(fù)電荷氨基酸殘基；16 個(gè)正電荷的氨基酸殘基。NK-LPd 的親水性氨基酸和疏水性氨基酸大體分別位于螺旋輪的兩側(cè)，能形成明顯的疏水界面和親水界面，使其具有兩親性，且疏水性為54%。雜合肽NK-LPd 二級(jí)結(jié)構(gòu)主要含有α螺旋結(jié)構(gòu)，占整體結(jié)構(gòu)的85.71%。

圖3 NK-LPd 結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Structure prediction of NK-LPd

表2 雜合抗菌肽NK-LPd 理化性質(zhì)分析Table 2 Analysis of physicochemical properties of hybride antimicrobial peptide NK-LPd

2.3 雜合抗菌肽NK-LPd 的基因合成

通過(guò)SOE-PCR 的方法，設(shè)計(jì)4 條引物經(jīng)過(guò)兩次PCR 合成雜合抗菌肽的NK-LPd 的目的基因。第一次PCR 分別使用引物NL 1、NL 2 和NL 3、NL 4兩兩互為模板進(jìn)行擴(kuò)增得到延伸液1 和延伸液2。經(jīng)3.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如圖4a 所示，分別在85 和91 bp 處出現(xiàn)明顯的條帶，與預(yù)期大小符合。以第一次PCR 獲得的產(chǎn)物作為模板進(jìn)行第二次PCR，得到相應(yīng)的目的基因，經(jīng)3.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)如圖4b，得到單一條帶大小為152 bp，與目標(biāo)條帶大小相符，證明成功擴(kuò)增得到目的基因。

2.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

從氨芐抗性平板上挑取10 個(gè)長(zhǎng)勢(shì)較好單菌落作為模板，分別以NL 1 和NL 2 為引物進(jìn)行菌落PCR，經(jīng)過(guò)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)在152 bp 處出現(xiàn)單一目標(biāo)條帶，與理論值相符，證明挑取的單克隆均為陽(yáng)性克隆。將陽(yáng)性克隆送擎科生物公司測(cè)序驗(yàn)證，證明基因片段NK-LPd成功連接至pPIC9K 表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)，并且核苷酸序列未發(fā)生堿基突變，與預(yù)先設(shè)計(jì)的序列相同。

2.5 畢赤酵母的轉(zhuǎn)化及篩選

線性化的pPIC9K-NK-LPd通過(guò)原生質(zhì)法轉(zhuǎn)入畢赤酵母KM71 感受態(tài)細(xì)胞中，全部涂布至MD 培養(yǎng)基（His+缺陷型），4 d 后長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子。重懸轉(zhuǎn)化子，將菌液依次涂布于G418 濃度為1.0、2.0、3.0 mg/mL的YPD 平板上篩選高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子。以3' AOX和5' AOX 為引物進(jìn)行酵母菌PCR，1%瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果如圖5，除9 號(hào)泳道外，其余陽(yáng)性克隆擴(kuò)增得到一條大小620 bp 的清晰條帶，空載體沒(méi)有插入目標(biāo)基因，得到條帶大小為494 bp。將陽(yáng)性菌株提取總RNA，通過(guò)RT-PCR 驗(yàn)證目的基因的表達(dá)（圖6）。結(jié)果表明，重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-NK-LPd已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入酵母KM71，并能夠穩(wěn)定表達(dá)。

圖5 重組畢赤酵母PCR 鑒定Fig.5 Identification of recombinant P. pastoris by PCR

圖6 酵母RT-PCR 結(jié)果Fig.6 RT-PCR result of P. pastoris

2.6 NK-LPd 重組蛋白在畢赤酵母的表達(dá)及純化

選取陽(yáng)性酵母轉(zhuǎn)化子，在0.5%甲醇濃度的條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)5 d 后，離心收集培養(yǎng)上清經(jīng)TCA法濃縮之后進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE 分析，如圖7 所示。酵母轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)上清在4.6～10 kDa 處有一個(gè)較明顯的條帶（黑色箭頭所示），而空載體陰性對(duì)照的培養(yǎng)上清則無(wú)此條帶，說(shuō)明重組肽NK-LPd 在酵母中成功表達(dá)。HPLC 結(jié)果如圖8，NK-LPd 的保留時(shí)間為14.469 min，純度75.7%。

圖7 雜合抗菌肽NK-LPd 在畢赤酵母中的分泌表達(dá)Fig.7 Hybrid antimicrobial peptide NK-LPd secreted expression in yeast Pichia pastoris

圖8 純化的NK-LPd 高效液相色譜分析結(jié)果Fig.8 Analytical results of purified NK-LPd by HPLC

2.7 重組NK-LPd 的抑菌活性評(píng)價(jià)

重組NK-LPd 對(duì)大腸桿菌、金黃葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、銅綠假單胞菌和嗜水氣單胞菌的抑菌圈直徑如圖9。結(jié)果表明雜合肽NK-LPd 對(duì)大腸桿菌（2.402±0.11 cm）、金黃葡萄球菌（2.580±0.13 cm）、沙門(mén)氏菌（1.992±0.22 cm）、銅綠假單胞菌（2.140±0.24 cm）和嗜水氣單胞菌（2.648±0.08 cm）均顯示出良好的抑菌性。并且與母體肽相比，雜合肽NKLPd 對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌活性介于NK-lysin（2.202±0.13 cm）和Piscidin（1.814±0.07 cm）之間，但對(duì)大腸桿菌、金黃葡萄球菌、沙門(mén)氏菌和嗜水氣單胞菌的抑菌活性增強(qiáng)，尤其NK-LPd 對(duì)嗜水氣單胞菌的抑菌活性為Piscidin 的兩倍。因此，可以證明重組NK-LPd 肽對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌均有明顯的抑制作用，與母體肽相比抗菌活性增加。

圖9 重組NK-LPd 的抑菌活性測(cè)定Fig.9 Antibacterial activity of the recombinant NK-LPd

3 討論

目前對(duì)于病原菌的治療主要依靠抗生素，但抗生素的作用靶點(diǎn)單一導(dǎo)致大量的耐藥菌的出現(xiàn)，已經(jīng)成為臨床感染管理的主要挑戰(zhàn)[13]?？咕脑趯?duì)抗各種病原微生物方面表現(xiàn)出顯著的效果和優(yōu)勢(shì)，被認(rèn)為是替代抗生素的理想候選者[14]。迄今為止，抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù)（APD）已經(jīng)儲(chǔ)存了3000 多種AMP，包括抗菌、抗病毒、抗寄生蟲(chóng)等[15]。雖然已經(jīng)有少數(shù)抗菌肽進(jìn)入了臨床階段[16]，但天然的AMP 存在溶血活性和細(xì)胞毒性等問(wèn)題使其在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中受到了嚴(yán)重限制。因此，需要對(duì)天然抗菌肽進(jìn)行適當(dāng)?shù)母脑焓蛊涓m合于應(yīng)用。

將不同的抗菌肽連接得到雜合抗菌肽是目前抗菌肽分子改造的主要手段之一。Al 等[17]利用LL-37 和BMAP-27 的序列開(kāi)發(fā)了一個(gè)新的雜合肽B1，具有選擇性，細(xì)胞毒性降低并且對(duì)哺乳動(dòng)物的溶血作用降低，抗菌活性和聯(lián)合用藥后毒性顯著改善。對(duì)天然抗菌肽開(kāi)展分子改造主要從AMP 結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系出發(fā)，AMP 的抗菌活性受到多種結(jié)構(gòu)參數(shù)的影響[18]，如凈電荷、兩親性、疏水性和結(jié)構(gòu)傾向等。所有的參數(shù)都是相互關(guān)聯(lián)的，因此在設(shè)計(jì)雜合肽的時(shí)候要考慮結(jié)構(gòu)的改變對(duì)其功能的影響。AMP 的電荷數(shù)量與抗菌活性并不是單純的線性相關(guān)，只有在一定的范圍內(nèi)才能提高抗菌活性，通常認(rèn)為雜合肽的電荷在+3～+8 之間較為合適[19]。疏水性決定著抗菌肽插入磷脂雙分子層的程度，通常在50%左右[20]?？咕牡膬捎H性使其具有獨(dú)特的殺菌機(jī)制，親水區(qū)域可以與細(xì)胞膜的磷脂分子的頭部結(jié)合，而疏水區(qū)域與磷脂分子尾部相互作用。但完美的兩親性會(huì)降低AMP的選擇性，導(dǎo)致抗菌活性與細(xì)胞毒性同時(shí)增加[21]。本研究中，對(duì)設(shè)計(jì)的雜合肽NK-LPd 進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，NK-LPd 的凈電荷為4.5，疏水性為54%，繪制的螺旋輪圖譜的親水性氨基酸和疏水性氨基酸大體分別位于螺旋輪的兩側(cè)，不是完美的兩親性，但能形成明顯的疏水界面和親水界面。結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)NK-LPd 主要含有α螺旋結(jié)構(gòu)，占整體結(jié)構(gòu)的85.71%，通過(guò)APD 預(yù)測(cè)有成為新型抗菌肽的可能。

本研究選擇的母體肽Pisicidn 和NK-lysin 具有不同的抗菌作用機(jī)制，Piscidin 通過(guò)環(huán)形孔機(jī)制破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，α-螺旋體插入膜的脂質(zhì)之間，導(dǎo)致細(xì)胞破裂死亡[22]。而NK-lysin 進(jìn)入目標(biāo)微生物的細(xì)胞質(zhì)后與微生物核酸相互作用并導(dǎo)致細(xì)胞死亡[23]。Shan 等[8]發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)NK-lysin 的24 個(gè)殘基的截短肽，通過(guò)膜活性的細(xì)胞殺傷機(jī)制對(duì)副溶血性弧菌具有強(qiáng)大的抗菌作用并且可以提高非特異性免疫參數(shù)。鑒于NK-lysin 和Piscidin 具有不同的抗菌機(jī)制，為了獲得抗菌活性更強(qiáng)，抗菌譜更廣的抗菌肽，本研究基于雜合抗菌肽的設(shè)計(jì)思想，將銀鯽NKlysin 和NK-lysin 的短截肽NKL-24 通過(guò)NCBI 網(wǎng)站進(jìn)行Blastn 比對(duì)發(fā)現(xiàn)NK-lysin 的71～94 氨基酸（IKIKLGMICDEIGFLKSMCRNLVN）具有70%相似度，將Piscidin 家族的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)HHIFRGIVH 序列保守。為了使連接的片段具有正確的構(gòu)象和生物學(xué)活性，選擇合適的連接肽進(jìn)行連接。但目前對(duì)于連接肽的研究較少，并沒(méi)有明確的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。連接肽中常用的氨基酸包括甘氨酸（Gly）、脯氨酸（Pro）、丙氨酸（Ala）等[24]，Gly 分子質(zhì)量較小并且無(wú)側(cè)鏈基團(tuán)，作為連接肽柔軟易彎折，不會(huì)影響連接肽的空間結(jié)構(gòu)[25]。陳香君等[26]截取LL-37 和HNP-1 的活性作用片段KEKIGKEF 和RIPACIA，經(jīng)“-甘氨酸（Gly，G）甘氨酸（Gly，G）-”兩兩拼接，設(shè)計(jì)合成新型LL-37 雜合肽能夠顯著抑制乳腺癌MCF-7 細(xì)胞的增殖、周期進(jìn)展并促使其凋亡。Tonk等[27]測(cè)試了將CopA3 和Hp1090 與兩個(gè)（InSco2）或六個(gè)（InSco6）甘氨酸殘基的接頭連接而產(chǎn)生的兩種雜合肽的抗菌活性，發(fā)現(xiàn)雜合肽InSco2 顯示出比親本AMP 或InSco6 更有效的殺菌活性?；谏鲜龅难芯繄?bào)道，本研究選擇兩個(gè)Gly 作連接肽將兩個(gè)片段連接構(gòu)建雜合抗菌肽，期望得到更高活性的雜合抗菌肽。

由于抗菌肽本身具有抗菌作用，采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)會(huì)抑制其進(jìn)一步表達(dá)。有研究表明，用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的抗菌肽的抗菌活性比大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的產(chǎn)物抗菌活性強(qiáng)[28]。薛劍鋒[29]分別用大腸桿菌和畢赤酵母表達(dá)了對(duì)蝦素Chp3、Chp5，原核表達(dá)的重組蛋白抑菌活性不高，而用畢赤酵母表達(dá)的重組蛋白的抑菌活性與從凡納對(duì)蝦和大西洋白對(duì)蝦發(fā)現(xiàn)的天然對(duì)蝦素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌和真菌的抑菌活性相似。這是因?yàn)楫叧嘟湍甘钦婧吮磉_(dá)系統(tǒng)，能夠?qū)⒎g后的蛋白進(jìn)行修飾加工，如添加二硫鍵等。由于母體肽NK-lysin 的成熟肽具有6 個(gè)保守的半胱氨酸，能夠形成3 個(gè)二硫鍵，對(duì)其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定具有關(guān)鍵性的作用，這種結(jié)構(gòu)與其抗菌活性密切相關(guān)[30]。為了使重組雜合肽具有正確的結(jié)構(gòu)功能，本研究采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中的真核表達(dá)載體pPIC9K，利用甲醇調(diào)控啟動(dòng)子AOX 1 使目標(biāo)蛋白大量表達(dá)，將雜合抗菌肽NK-LPd 的序列克隆在α-factor 序列后實(shí)現(xiàn)目的蛋白的分泌表達(dá)。

經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)后雜合抗菌肽NK-LPd 的空間結(jié)構(gòu)、兩親性和疏水性等都發(fā)生了巨大的變化，本研究將雜合抗菌肽與雜合前的兩種抗菌肽通過(guò)抑菌圈法進(jìn)行抑菌活性比對(duì)。母體肽均由本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)相同的方法進(jìn)行畢赤酵母誘導(dǎo)表達(dá)獲得。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雜合抗菌肽的抑菌活性顯著增加，對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌均有明顯的抑制作用。這可能是由于兩種抗菌肽的作用方式不同，位于N 端的Piscidin 通過(guò)環(huán)型孔作用方式破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞后NK-lysin 與胞內(nèi)目標(biāo)成分結(jié)合加速了細(xì)胞的死亡。下一步我們將對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步分析驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究將Piscidin 和NK-lysin 的活性片段融合拼接成雜合抗菌肽，通過(guò)畢赤酵母KM71 分泌表達(dá)獲得重組雜合肽，純化的雜合肽NK-LPd 對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均有明顯的抑制作用。本研究設(shè)計(jì)了一種新型具有生物學(xué)活性的雜合肽NKLPd，能夠代替抗生素在動(dòng)物性食品中的使用，提高食品的安全性，在食品防護(hù)和動(dòng)物飼料添加劑方面具有很好的應(yīng)用前景。