基于理化指標(biāo)和MiSeq 高通量測(cè)序技術(shù)紅曲品質(zhì)及微生物類群的解析

鄭巳芳，程馳新笑，龍樹瑺，王玉榮，田龍新，郭 壯,

（1.湖北文理學(xué)院，湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北襄陽 441053；2.湖北文理學(xué)院，襄陽市醬香型白酒固態(tài)發(fā)酵企校聯(lián)合創(chuàng)新中心，湖北襄陽 441053）

紅曲，又名丹曲或赤曲[1]，其制作原料主要為大米和紅曲霉，經(jīng)過紅曲霉發(fā)酵后的大米變成紅曲米，被用來釀造紅曲黃酒或紅曲米醋[2]。隨著紅曲及其副產(chǎn)物的功能特性不斷被發(fā)現(xiàn)，紅曲行業(yè)也逐漸得到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。有研究表明，紅曲色素具有抗氧化性和抗菌性等多種功能特性，也因此被作為食品添加劑被廣泛應(yīng)用于食品加工業(yè)中[3]。此外，更多的研究關(guān)注于紅曲黃酒發(fā)酵過程中的微生物群落演替亦或是風(fēng)味物質(zhì)變化。有研究表明紅曲黃酒在發(fā)酵過程中，游離氨基酸、有機(jī)酸以及關(guān)鍵揮發(fā)性化合物含量有明顯增加[4]。Huang 等[5]對(duì)福建武夷紅曲黃酒釀造過程中的微生物和揮發(fā)性化合物進(jìn)行了解析，發(fā)現(xiàn)葡糖酸醋桿菌屬（Gluconacetobacter）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、畢赤酵母屬（Pichia）和威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）等為產(chǎn)生揮發(fā)性化合物的核心菌群。Huang 等[6]和Liu 等[7]的研究表明不同類型的紅曲（黑武夷紅曲、紅武夷紅曲和古田紅曲）其微生物群落間具有顯著差異，并且相較于其它類型的黃酒，古田紅曲釀造的黃酒在發(fā)酵過程中氨基酸總量增加較慢[6]。上述研究結(jié)果表明，紅曲對(duì)于紅曲黃酒品質(zhì)的塑造至關(guān)重要，且不同紅曲釀造出的紅曲黃酒在品質(zhì)上存在一定差異。此外，目前有關(guān)紅曲源菌株資源挖掘方面的研究更多集中在霉菌和酵母菌上，然而有研究表明酒曲中可能蘊(yùn)含著部分具有增香特性的芽孢桿菌[8]，還有研究顯示部分乳酸菌能促進(jìn)黃酒釀造過程中酵母菌的增長(zhǎng)，對(duì)黃酒品質(zhì)的提升亦有一定作用[9]。因而紅曲中的乳酸菌和芽孢桿菌資源亦值得被挖掘。

目前，我國(guó)生產(chǎn)紅曲的主要產(chǎn)區(qū)在福建省，該地區(qū)生產(chǎn)紅曲的歷史已有上千年，生產(chǎn)技術(shù)和產(chǎn)品質(zhì)量均處于行業(yè)領(lǐng)先水平[1]。由于紅曲黃酒在國(guó)內(nèi)外的流行度逐漸增加，我國(guó)其它地區(qū)亦開始生產(chǎn)紅曲。然而目前針對(duì)我國(guó)其它地區(qū)生產(chǎn)的紅曲研究較少，且缺少相關(guān)國(guó)家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系，其品質(zhì)和蘊(yùn)含的微生物類群也了解尚少。MiSeq 高通量測(cè)序技術(shù)作為第二代測(cè)序技術(shù)，能夠以相對(duì)較低的成本產(chǎn)生大量序列，與其他方法相比，增加了微生物群落分析的測(cè)序深度，同時(shí)降低了實(shí)驗(yàn)成本，在解析茯磚紅茶[10]和酸湯[11]等傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物類群的研究中具有廣泛應(yīng)用。

本研究在對(duì)其理化指標(biāo)和發(fā)酵特性進(jìn)行測(cè)定的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用MiSeq 高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)其微生物類群進(jìn)行了全面掃描，并結(jié)合純培養(yǎng)技術(shù)對(duì)其中的芽孢桿菌和乳酸菌進(jìn)行了鑒定保藏，以期為后續(xù)紅曲品質(zhì)的提升提供一定的理論參考依據(jù)，并豐富純種發(fā)酵菌株資源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅曲樣品 采集自山東省某制曲公司；DNeasy mericon Food Kit DNA 基因組提取試劑盒 德國(guó)QIAGEN 公司；正反/向引物338F/806R、正/反向引物ITS3F/ITS4R 和正/反向引物27F/1495R 上海桑尼生物科技有限公司；Axygen 清潔試劑盒 康寧生命科學(xué)吳江有限公司；PCR 擴(kuò)增所用緩沖液、dNTP和rTaq DNA 聚合酶 寶生物工程（大連）有限公司；Illumina MiSeq 測(cè)序試劑盒v3 美國(guó)Illumina 公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂和MRS 培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

SH-10A 水分測(cè)定儀 上海力辰儀器科技有限公司；KBF1700 高溫箱式爐 南京南大儀器廠；PHS-3C 數(shù)顯臺(tái)式酸度計(jì) 上海越平科學(xué)儀器有限公司；K1100 全自動(dòng)定氮儀 濟(jì)南海能儀器股份有限公司；VSA 動(dòng)態(tài)水蒸汽吸附分析儀 美國(guó)AquaLAB公司；DG250 型厭氧工作站 英國(guó)Don Whitley 公司；Vetiri 梯度基因擴(kuò)增儀 美國(guó)AB 公司；MiSeq PE300 高通量測(cè)序平臺(tái) 美國(guó)Illumina 公司；R930機(jī)架式服務(wù)器 美國(guó)Dell 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集 于2021 年10 月從山東某制曲公司紅曲制作車間采集同一批次紅曲樣品3 份，編號(hào)為SQ1～SQ3。紅曲以秈米為原料，經(jīng)過浸米、蒸飯、攤涼、接種紅曲母、室內(nèi)培菌、加溫發(fā)酵和烘干等十多道工序制作而成，整個(gè)制作周期歷時(shí)18 d。樣品采集時(shí)已在庫(kù)房中常溫儲(chǔ)存了1 個(gè)月左右。

1.2.2 紅曲理化特性指標(biāo)測(cè)定 紅曲的灰分、酸度、氨基酸態(tài)氮、淀粉和蛋白質(zhì)含量等理化指標(biāo)均參照輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 4257-2011《釀酒大曲通用分析方法》提供的測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定[12]，紅曲水分活度使用水蒸汽吸附分析儀進(jìn)行測(cè)定，水分含量使用水分測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定，所有指標(biāo)測(cè)定均進(jìn)行3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 紅曲發(fā)酵特性指標(biāo)測(cè)定 紅曲的糖化力和酯化力均參照輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 5188-2017《釀造紅曲》中的方法進(jìn)行測(cè)定[13]，發(fā)酵力、酒化力和液化力等生化指標(biāo)均參照輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 4257-2011《釀酒大曲通用分析方法》提供的測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定[12]，所有指標(biāo)測(cè)定均進(jìn)行3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 紅曲細(xì)菌和真菌多樣性解析 使用DNeasy mericon Food Kit DNA 試劑盒提取紅曲的宏基因組DNA，參照郭壯等[14]的方法使用引物338F/806R 對(duì)細(xì)菌16S rRNA V3～V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，參照王智耀等[15]的方法使用引物ITS3F/ITS4R 對(duì)真菌ITS2 區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物寄至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成高通量測(cè)序（表1）。參照郭壯等[14]的方法對(duì)測(cè)序返回的序列進(jìn)行質(zhì)控，基于QIIME（v1.95）平臺(tái)采用UCLUST 兩步法對(duì)有效序列分別按照100%和97%相似度劃分操作分類單元OTU（Operational taxonomic units，OTU）[16]，并進(jìn)行嵌合體檢查。基于RDP[17]、Greengenes[18]和SILVA[19]數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)細(xì)菌類群進(jìn)行物種注釋，基于UNITE（v7.2）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)真菌類群進(jìn)行物種注釋[20]。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequence information

1.2.5 乳酸菌和芽孢桿菌的分離鑒定 使用生理鹽水對(duì)紅曲進(jìn)行倍比稀釋，取10-4～10-6稀釋液涂布于含有1% CaCO3的MRS 平板中，于厭氧工作站37 ℃培養(yǎng)48 h，對(duì)其乳酸菌進(jìn)行分離。使用生理鹽水首先對(duì)紅曲稀釋10 倍后，于85 ℃加熱15 min，繼而繼續(xù)進(jìn)行倍比稀釋，取10-3～10-5稀釋液涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板中，于28 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，對(duì)其芽孢桿菌進(jìn)行分離。后續(xù)單菌落的挑取、純化、保藏和鑒定步驟均參照洋洋等[24]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2021 軟件繪制柱形圖，并使用SPSS 25 軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)；采用R（v4.1.1）軟件中的“ggplot2”和“reshape2”包繪制氣泡圖；采用SAS（v9.4）軟件計(jì)算優(yōu)勢(shì)菌群與生化指標(biāo)的相關(guān)性系數(shù)及顯著性，并使用Catyscape（v3.7.2）軟件繪制相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖；采用MEGA（v7.0）和R（v4.1.1）軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲的理化特性指標(biāo)分析

本研究首先對(duì)3 份紅曲樣品的理化指標(biāo)進(jìn)行了分析，其理化指標(biāo)結(jié)果見圖1。

圖1 紅曲的理化指標(biāo)分析Fig.1 Analysis of physicochemical indexes of Hong Qu

由圖1（a）可知，紅曲的水分含量在8.27%～10.30%之間，灰分含量在5.47～7.25 g/100 g 之間，酸度在1.0～1.3 mmol/10 g 之間，水分活度在0.544～0.648 aw 之間。由圖1（b）可知，紅曲的氨基酸態(tài)氮含量在131.65～172.76 mg/100 g 之間；淀粉含量在40.9%～51.1%之間，蛋白質(zhì)含量在15.38%～19.78%之間。方差分析結(jié)果顯示，3 份樣品的各項(xiàng)理化指標(biāo)間均存在顯著性差異。標(biāo)準(zhǔn)QB/T 5188-2017《釀造紅曲》中規(guī)定釀造紅曲的水分含量不得高于12%[16]。王俏等[25]在解析酒曲理化性能的研究中指出，酒曲中的酸度主要來源于乳酸菌和醋酸菌等微生物代謝碳水化合物產(chǎn)生的乳酸和醋酸等，還有部分來源于脂肪和蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生的脂肪酸和氨基酸等。由此可見，三個(gè)紅曲樣品其水分含量均符合標(biāo)準(zhǔn)，此外曲中還可能蘊(yùn)含了部分產(chǎn)酸微生物。作為酒曲中主要的氮源物質(zhì)，適宜含量的氨基酸態(tài)氮不僅有利于促進(jìn)酒曲中功能菌株的生長(zhǎng)繁殖，而且與酒曲的生香能力呈正相關(guān)[26]。通過對(duì)低溫、中溫和高溫大曲組份進(jìn)行研究，李祖明等發(fā)現(xiàn)3 類大曲的淀粉含量在45%～68%之間，蛋白質(zhì)含量在14%～20%之間，高溫大曲的氨基酸態(tài)氮含量在280～445 mg/100 g 之間[26-27]。由此可見，較之大曲而言，紅曲的淀粉和蛋白質(zhì)含量與其無明顯差異，但其氨基酸態(tài)氮含量要明顯低于大曲，因而其生香能力可能略低于大曲。

2.2 紅曲的發(fā)酵特性指標(biāo)分析

酒曲的生化性能主要包括了糖化力、酯化力、發(fā)酵力、液化力和酒化力，它們分別代表了酒曲的糖化能力、產(chǎn)乙酸乙酯能力、產(chǎn)二氧化碳能力、出酒率和產(chǎn)酒精的能力，紅曲樣品的發(fā)酵特性結(jié)果如圖2 所示。

圖2 紅曲的發(fā)酵特性指標(biāo)分析Fig.2 Analysis of fermentation characteristics indexes of Hong Qu

由圖2 可知，紅曲的糖化力在476～764 U/g 之間，酯化力在331～548 U/g 之間，發(fā)酵力在3.93～4.21 U/g之間，液化力在0.28～0.34 U/g 之間，酒化力在4.7～9.4 U/g 之間。方差分析結(jié)果顯示，3 份樣品的發(fā)酵特性間亦存在顯著差異（P＜0.05）。在輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 5188-2017《釀造紅曲》中，紅曲的糖化力需要大于等于1000 U/g[16]。由此可見，納入本研究的紅曲其糖化力、液化力和發(fā)酵力指標(biāo)均偏低。通過對(duì)制曲過程中微生物群落演替及其生化指標(biāo)的變化，張嬌嬌等[28]發(fā)現(xiàn)在96 h 發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，紅曲的糖化力隨著制曲時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增加，細(xì)菌豐度和多樣性不斷降低，而真菌豐度和多樣性不斷增加，然而其最終糖化力為542.61 U/g，亦沒有達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求。因此，糖化力不達(dá)標(biāo)或許是與菌群變化亦或是發(fā)酵時(shí)間較短等因素相關(guān)。結(jié)合圖1 和圖2 來看，3 份樣品在理化指標(biāo)和發(fā)酵特性之間均存在顯著性差異（P＜0.05），這說明其品質(zhì)相對(duì)不穩(wěn)定。通過對(duì)發(fā)酵特性進(jìn)行評(píng)價(jià)，梁璋成等[29]亦發(fā)現(xiàn)不同企業(yè)和批次生產(chǎn)的紅曲米品質(zhì)存在較大的差異，并導(dǎo)致了后續(xù)黃酒產(chǎn)品質(zhì)量可控性較差，而出現(xiàn)這種情況的原因主要在于紅曲缺乏完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系。綜上，在后續(xù)研究中盡可能多的增加采樣地點(diǎn)和采樣量，實(shí)現(xiàn)紅曲理化指標(biāo)和發(fā)酵特性的全面解析，對(duì)紅曲質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系和監(jiān)管體系的完善具有積極促進(jìn)作用。

2.3 基于門和屬水平紅曲細(xì)菌類群解析

通過對(duì)紅曲細(xì)菌16S rRNA V3～V4區(qū)進(jìn)行測(cè)序共得到了174896 條序列，所有序列均通過了質(zhì)量控制，樣品SQ1～SQ3 中分別含有59019 條、54526 條和61351 條有效序列，所有有效序列按照97%相似度劃分共得到2538 個(gè)OTU，平均每個(gè)樣品中含有1747 個(gè)OTU。經(jīng)過同源性比對(duì)，這些OTU 分別隸屬于6 個(gè)門、10 個(gè)綱、19 個(gè)目、41 個(gè)科和77 個(gè)屬。本研究基于門和屬水平對(duì)紅曲的細(xì)菌多樣性進(jìn)行了解析，并將相對(duì)含量＞1.0%的門和屬定義為優(yōu)勢(shì)門和優(yōu)勢(shì)屬，如圖3 所示。

圖3 紅曲中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門和屬相對(duì)含量分析Fig.3 Analysis of the relative content of dominant bacterial phyla and genera in Hong Qu

由圖3 可知，F(xiàn)irmicutes 和Proteobacteria 為紅曲中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門，其平均相對(duì)含量分別為62.00%和36.66%，然而其在3 份樣品中的比例存在一定的差異，其中SQ1 和SQ3 中Firmicutes 和Proteobacteria的比例接近1:1，而SQ2 中兩者的比例接近7:1。由此可見，和理化與發(fā)酵特性指標(biāo)一樣，3 個(gè)樣品的細(xì)菌類群亦存在較大差異。制曲溫度和水分含量被認(rèn)為與酒曲中微生物群落形成具有密切聯(lián)系[30]。與大曲培菌時(shí)因堆積排列而受到的發(fā)酵熱和空間異質(zhì)性不同[31]，紅曲是將拌好曲的紅曲米平鋪在室內(nèi)進(jìn)行自然培菌，受熱較為均勻，因而不同樣品細(xì)菌類群結(jié)構(gòu)間的差異更可能是由水分分布不均所引起的。由圖3可知，紅曲中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬共有12 個(gè)，分別為隸屬于Firmicutes 的Weissella（魏斯氏菌屬，41.93%）、Acetobacter（醋酸桿菌屬，9.99%）、Bacillus（芽孢桿菌屬，5.94%）、Lactobacillus（5.29%）、Enterococcus（腸球菌屬，1.99%）、Leuconostoc（明串珠球菌屬，1.40%）、Pediococcus（片球菌屬，1.30%）和Lactococcus（乳球菌屬，1.27%）；隸屬于Proteobacteria 的Cronobacter（克羅諾桿菌屬，8.76%）、Klebsiella（克雷伯氏菌屬，5.21%）、Pantoea（泛菌屬，3.28%）和Gluconobacter（葡糖桿菌屬，2.06%）。由此可見，Weissella、Acetobacter和Cronobacter為紅曲中的主要細(xì)菌類群。此外，這些優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬中屬于乳酸菌類群的有Weissella、Lactobacillus、Enterococcus、Leuconostoc、Pediococcu和Lactococcus，累計(jì)相對(duì)含量為47.22%。此外，Acetobacter的含量也占到近10%。由此可見，富含乳酸菌和醋酸菌或許是導(dǎo)致納入本研究紅曲酸度較高的主要原因，然而較高的酸度可能會(huì)抑制部分耐酸性較弱的霉菌和酵母菌生長(zhǎng)繁殖，在一定程度上對(duì)紅曲糖化力產(chǎn)生了不利影響。

2.4 基于門和屬水平紅曲真菌類群解析

本研究進(jìn)一步從門和屬水平解析了紅曲的真菌多樣性。通過對(duì)真菌ITS 2 區(qū)測(cè)序共得到了301978條有效序列，樣品SQ1～SQ3 中分別含有100274 條、99144 條和102560 條序列，按照97%相似度劃分共得到了694 個(gè)OTU，平均每個(gè)樣品含有488 個(gè)OTU。經(jīng)同源性比對(duì)，這些OTU 分別隸屬于3 個(gè)門、6 個(gè)綱、9 個(gè)目、20 個(gè)科和28 個(gè)屬，其中的優(yōu)勢(shì)真菌門和真菌屬如圖4 所示。

圖4 紅曲中優(yōu)勢(shì)真菌門和屬相對(duì)含量分析Fig.4 Analysis of the relative content of dominant fungal phyla and genera in Hong Qu

由圖4 可知，Ascomycota（子囊菌門，99.52%）為紅曲中唯一優(yōu)勢(shì)真菌門，在所有樣品中含量均達(dá)99.0%以上。紅曲中的優(yōu)勢(shì)真菌屬共有6 個(gè)，分別為隸屬于Ascomycota 的Pichia（55.83%）、Monascus（紅曲霉菌屬，21.24%）、Dipodascus（雙足囊菌屬，6.55%）、Cyberlindnera（擬威爾嗜殺酵母屬，6.09%）、Xeromyces（耐干霉菌屬，3.71%）和Candida（假絲酵母屬，1.75%）。由此可見，Pichia和Monascus為三個(gè)樣品中主要的真菌類群。

通過解析福建地區(qū)紅曲真菌類群，李路等[32]亦發(fā)現(xiàn)黑曲霉（Aspergillus niger）和紫紅曲霉（Monascus purpureus）為其優(yōu)勢(shì)真菌類群，但其中并不蘊(yùn)含Pichia。此外，對(duì)福建省5 個(gè)不同地區(qū)紅曲微生物類群和發(fā)酵特性進(jìn)行研究，Huang 等[33]發(fā)現(xiàn)Aspergillus和Monascus為其中優(yōu)勢(shì)真菌屬，亦未發(fā)現(xiàn)Pichia，且Monascus與糖化力之間呈顯著正相關(guān)關(guān)系。此外，相較于正常紅曲樣品，糖化力不達(dá)標(biāo)的紅曲樣品其真菌豐度和多樣性要明顯偏低。有研究表明，霉菌是釀酒過程中的糖化動(dòng)力[34]，而且根霉、米曲霉和紅曲霉是常用的糖化劑。因而，霉菌含量偏低而Pichia含量偏高亦或是真菌豐度和多樣性較低可能導(dǎo)致是納入本研究紅曲糖化力達(dá)不到輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 5188-2017《釀造紅曲》要求的主要原因。此外，在發(fā)酵前接種了紅曲母，曲母中主要蘊(yùn)含著曲霉菌類群，經(jīng)過發(fā)酵后其含量卻未占據(jù)主導(dǎo)地位，因而過高含量的Pichia存在可能預(yù)示著紅曲在制作過程存在一定的污染。紅曲的制作環(huán)境并非是在受控的無菌條件下進(jìn)行，微生物接種物、加工技術(shù)和生產(chǎn)環(huán)境以及氣候條件均會(huì)影響紅曲的微生物類群及其多樣性[35]，因而在后續(xù)生產(chǎn)中加強(qiáng)工作菌種的管理、注意生產(chǎn)環(huán)境衛(wèi)生狀況的改善以及適當(dāng)增加紅曲霉的接種量對(duì)這一問題的解決可能具有積極意義。

2.5 紅曲發(fā)酵特性與微生物類群的關(guān)聯(lián)性分析

紅曲發(fā)酵特性與微生物類群的關(guān)聯(lián)性分析，結(jié)果如圖5 所示。

圖5 優(yōu)勢(shì)菌群與紅曲發(fā)酵特性指標(biāo)之間的相關(guān)性分析Fig.5 Correlation analysis between dominant flora and fermentation characteristics indexes of Hong Qu

由圖5 可知，Weissella與酒化力之間呈現(xiàn)顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），而Cronobacter、Bacillus、Klebsiella、Enterococcus和Lactococcus與酒化力之間均呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。此外，Dipodascus與糖化力之間呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。由此可見，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌對(duì)紅曲生化性能的影響主要體現(xiàn)在酒化力上，而真菌主要對(duì)糖化力產(chǎn)生影響。

2.6 紅曲中乳酸菌和芽孢桿菌的分離鑒定

上述研究結(jié)果表明，納入本研究的各樣品品質(zhì)間差異較大，且糖化力偏低，因而對(duì)其中的微生物進(jìn)行初步分離鑒定為解決以上問題提供菌株支持具有一定的積極意義。目前，研究人員對(duì)酒曲中功能菌株進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，除了霉菌等真菌類群能起到糖化作用外，部分芽孢桿菌亦具有良好的糖化能力，其亦可作為功能菌株被富集添加到酒曲中的應(yīng)用中[36]。此外，紅曲中的乳酸菌能對(duì)其他菌群產(chǎn)生積極影響，并提高紅曲黃酒品質(zhì)[9]。因而，本研究采用純培養(yǎng)技術(shù)對(duì)紅曲中的芽孢桿菌和乳酸菌進(jìn)行了分離鑒定，其系統(tǒng)發(fā)育樹如圖6 所示。

圖6 紅曲中芽孢桿菌和乳酸菌分離株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of Bacillus and lactic acid bacteria isolates from Hong Qu

由圖6 可知，有24 株分離株被鑒定為芽孢桿菌，分別為B. siamensis（暹羅芽孢桿菌，19 株）、B. amyloliquefaciens（解淀粉芽孢桿菌，1 株）、B. altitudinis（高地芽孢桿菌，1 株）和B. proteolyticus（解蛋白芽孢桿菌，3 株），有18 株分離株被鑒定為乳酸菌，主要為隸屬于Pediococcus的P. acidilactici（乳酸片球菌，1 株）和P. pentosaceus（戊糖片球菌，10 株），隸屬于Enterococcus的E. faecium（屎腸球菌，5 株），隸屬于Lactiplantibacillus的L. plantarum（植物乳桿菌，2 株）。由圖6 亦可知，B. siamensis占芽孢桿菌分離株的79.17%，P. pentosaceus占乳酸菌分離株的55.55%，且兩者在3 個(gè)樣品中均可分離得到。由此可見，納入本研究的紅曲其芽孢桿菌和乳酸菌類群主要由B. siamensis和P. pentosaceus構(gòu)成。

3 結(jié)論

本研究對(duì)產(chǎn)自山東某地的紅曲理化指標(biāo)和發(fā)酵特性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，對(duì)其微生物類群進(jìn)行了解析，同時(shí)對(duì)蘊(yùn)含的芽孢桿菌和乳酸菌進(jìn)行了分離鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，納入本研究的紅曲其糖化力、液化力和發(fā)酵力不足均偏低，且不同樣品的理化指標(biāo)和發(fā)酵特性之間存在顯著性差異。紅曲中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為Weissella和Acetobacter等，優(yōu)勢(shì)真菌為Pichia和Monascus等，芽孢桿菌和乳酸菌類群主要由B. siamensis和P.pentosaceus構(gòu)成。然而，不同樣品在細(xì)菌類群結(jié)構(gòu)上亦存在較大差異，且霉菌含量偏低。由此可見，該批次生產(chǎn)的紅曲在理化特性與微生物群落結(jié)構(gòu)等方面均有明顯的不穩(wěn)定性。因而，在后續(xù)生產(chǎn)過程中要加強(qiáng)管理生產(chǎn)環(huán)境衛(wèi)生或是采用純種發(fā)酵技術(shù)以提高產(chǎn)品穩(wěn)定性。