兩種方法制備的蛹蟲(chóng)草多糖特性及體外生物活性對(duì)比分析

顧丹丹，侯靜宇，張金秀，王立安,

（1.石家莊學(xué)院化工學(xué)院，河北石家莊 050035；2.河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北石家莊 050024）

蛹蟲(chóng)草（Cordyceps militaris（L.ex Fr）Link）是一種常見(jiàn)的食藥同源真菌，又名北冬蟲(chóng)夏草、東北草等，為蟲(chóng)草屬（Cordyceps）大型真菌[1]。蛹蟲(chóng)草與冬蟲(chóng)夏草同屬異種、同功效，屬珍稀菌類，因其含有多糖、核苷類、蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸等多種活性成分，使其具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用、抗氧化和延緩衰老的作用、抑菌作用、抗腫瘤作用、神經(jīng)保護(hù)作用、降血脂保肝作用和降血糖作用等多種生理活性[2-5]。蟲(chóng)草多糖是蛹蟲(chóng)草中含量最豐富的活性成分之一，大量存在于蛹蟲(chóng)草的菌絲體和發(fā)酵液中，因其具有顯著的抗氧化、抗腫瘤和降低血糖等活性，在醫(yī)藥、食品和保健品等領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊[6-8]。

水提醇沉法為多糖提取的常用方法，但此方法存在生產(chǎn)周期長(zhǎng)，醇沉后的液體制劑容易產(chǎn)生沉淀，易導(dǎo)致有效成分流失等缺點(diǎn)[9]。殼聚糖為甲殼素的脫乙酰基產(chǎn)物，在昆蟲(chóng)，甲殼類動(dòng)物的外殼中廣泛存在，因其兼具吸附和絮凝作用及良好的生物相容性，被廣泛用于醫(yī)藥、食品、化工和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[10-12]。許昕等[13]對(duì)比了殼聚糖絮凝法和水提醇沉法對(duì)牛蒡多糖的純化效果，結(jié)果表明殼聚糖絮凝法制備的多糖純度更高，對(duì)DPPH 自由基清除能力更強(qiáng)，對(duì)氧化應(yīng)激酵母細(xì)胞的保護(hù)作用更強(qiáng)，說(shuō)明殼聚糖絮凝法制備的牛蒡多糖具有更好的抗氧化活性。侯靜宇等[14]分別采用殼聚糖絮凝法和傳統(tǒng)水提醇沉法制備了黑木耳多糖，對(duì)比了二者生物活性，發(fā)現(xiàn)殼聚糖絮凝法制備的黑木耳多糖具有更高的降血糖和抗腫瘤活性。王學(xué)軍等[15]對(duì)杜仲葉水提液進(jìn)行殼聚糖絮凝法純化，該方法制備的多糖，對(duì)藥效組分具有較高的保留率，所得藥液的澄清度較好。此外殼聚糖絮凝法已用于香菇多糖、灰樹(shù)花多糖和金針菇多糖等食用菌多糖制備過(guò)程中，且此法制備的多糖在純度、多糖損失率、蛋白質(zhì)清除率等方面均明顯優(yōu)于傳統(tǒng)水提醇沉法[16-18]。但殼聚糖絮凝法制備所得食用菌多糖，其理化特性與生物學(xué)活性是否優(yōu)于傳統(tǒng)水提醇沉法，國(guó)內(nèi)外鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室前期侯靜宇等[19]優(yōu)化了殼聚糖絮凝法制備蛹蟲(chóng)草多糖工藝參數(shù)，然而此法制備的多糖與傳統(tǒng)水提醇沉法制備多糖在表觀特征、結(jié)構(gòu)和生物活性方面是否存在差異，還有待深入對(duì)比研究。

本研究以蛹蟲(chóng)草發(fā)酵后菌絲體為材料，通過(guò)殼聚糖絮凝法和水提醇沉法分別制備蛹蟲(chóng)草多糖，從多糖得率、結(jié)構(gòu)特性、粒徑、復(fù)溶性和體外抗氧化、降血糖及抗腫瘤活性等方面進(jìn)行了對(duì)比分析，研究結(jié)果可為蛹蟲(chóng)草多糖的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛹蟲(chóng)草菌株 現(xiàn)保藏于河北師范大學(xué)應(yīng)用真菌實(shí)驗(yàn)室；纖維素酶（11000 U/mg）、木瓜蛋白酶（0.5～2 U/mg）、α-葡萄糖苷酶（0.35 U/mL）、殼聚糖（脫乙酰度＞90%）、阿卡波糖、順鉑 索萊寶生物科技有限公司；人肝癌細(xì)胞HepG2（1×106cells/T25 培養(yǎng)瓶） 上海弘順生物科技有限公司；GK5011 BCA 法蛋白定量試劑盒 上海捷瑞生物工程有限公司；其他試劑 國(guó)產(chǎn)分析純。

YH-M10000 型電子天平 瑞安市英恒電器有限公司；1510-03461 型酶標(biāo)儀 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；Heraeus Fresco 21 型離心機(jī) 賽默飛科技有限公司；90 Plus Zeta 型粒度分析儀 美國(guó)布魯克海文儀器公司；VERTEX 70 型紅外光譜儀 布魯克（北京）科技有限公司；S-4800 型掃描電子顯微鏡日立（中國(guó)）有限公司；UV2501pc 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 島津（上海）實(shí)驗(yàn)器材有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛹蟲(chóng)草多糖的制備方法 將在固體培養(yǎng)基（PDA 斜面培養(yǎng)基，其配方為：馬鈴薯 20%，葡萄糖2%，瓊脂 2%，MgSO40.1%，KH2PO40.1%）中生長(zhǎng)的蛹蟲(chóng)草接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基（配方：葡萄糖 2%，蛋白胨 1.5%，KH2PO40.5%，MgSO40.1%），采用500 mL搖瓶發(fā)酵，裝液量200 mL，初始pH6.5，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，培養(yǎng)溫度23 ℃，發(fā)酵周期為18 d。發(fā)酵后菌液用40 目濾網(wǎng)過(guò)濾，超純水反復(fù)沖洗3 次。冷凍干燥箱中進(jìn)行干燥，至恒重，收獲菌絲體。

1.2.1.1 菌絲體多糖提取 參照侯靜宇等[19]建立的方法，將上述凍干后的菌絲體粉碎后，過(guò)40 目篩，取20 g 加入5%的復(fù)合酶水溶液800 mL（木瓜蛋白酶：纖維素酶=2:1），在50 ℃下浸提2 h 后，再置于70 ℃下超聲輔助提取70 min，離心，取上清液濃縮5 倍，即可得到蛹蟲(chóng)草菌絲體粗多糖浸提液，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 殼聚糖絮凝法制備蛹蟲(chóng)草多糖 取粗多糖浸提液，加入1%殼聚糖-醋酸溶液，殼聚糖用量為1.4 mL/g，在絮凝溫度為55 ℃，絮凝70 min，得到蛹蟲(chóng)草粗多糖純化液，經(jīng)55 ℃減壓濃縮后，冷凍干燥，即得絮凝多糖XDT[19]。

1.2.1.3 水提醇沉法制備蛹蟲(chóng)草多糖 取粗多糖浸提液，加入無(wú)水乙醇，至其終濃度為80%，4 ℃靜置過(guò)夜，真空抽濾得到粗多糖，隨后用Sevag 法去蛋白3 次，冷凍干燥后得到醇沉多糖CDT[19]。

1.2.2 蛹蟲(chóng)草多糖主要成分測(cè)定 取適量上述方法制備好的XDT 和CDT 兩種多糖樣品，采用苯酚-硫酸法測(cè)定樣品中總糖含量[14]，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為Y=0.005X+0.0469，Y 表示490 nm 波長(zhǎng)下吸光度值，X 表示葡萄糖濃度（μg/mL），R2=0.999；采用BCA 法檢測(cè)樣品中蛋白含量，測(cè)定步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)，蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為Y=0.0037X+0.034，Y 表示595 nm 波長(zhǎng)下吸光度值，X 表示蛋白質(zhì)濃度（μg/mL），R2=0.9991；采用咔唑-硫酸法[20]測(cè)定樣品中糖醛酸含量，糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為Y=7.6856X+0.005，Y 表示523 nm 波長(zhǎng)下吸光度值，X 表示糖醛酸濃度（mg/mL），R2=0.9989；參考GB/T 5009.4-2016 測(cè)定樣品中灰分含量[21]。

1.2.3 蛹蟲(chóng)草多糖微觀形態(tài)及結(jié)構(gòu)特性分析

1.2.3.1 蛹蟲(chóng)草多糖掃描電鏡分析 取制備的XDT和CDT 兩種多糖樣品粉末粘于樣品座的導(dǎo)電膠上后吹去浮樣、噴金，進(jìn)行冷場(chǎng)掃描電鏡觀察[22]。

1.2.3.2 蛹蟲(chóng)草多糖粒徑測(cè)定 取制備的XDT 和CDT 兩種多糖樣品利用 Nano Brook 90Plus Zeta 儀測(cè)定多糖顆粒的粒徑。

1.2.3.3 蛹蟲(chóng)草多糖傅里葉紅外光譜分析 取制備的XDT 和CDT 兩種多糖樣品各1 mg 與適量KBr混合研磨，真空壓片制樣，放入儀器中在4500～0 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描。

1.2.3.4 蛹蟲(chóng)草多糖構(gòu)象分析 取適量1.2.1 制備的XDT 和CDT 兩種多糖樣品配成濃度1 g/L 多糖溶液，并與剛果紅溶液（5×10-6mol/L）和不同濃度的NaOH 溶液按體積比1:1:2 混合并搖勻。在室溫靜置30 min 后用分光光度計(jì)于400～600 nm 范圍下掃描，確定樣品的最大吸收波長(zhǎng)。結(jié)果分別以最大波長(zhǎng)、NaOH 濃度為縱、橫坐標(biāo)作圖[23]。

1.2.4 兩種蛹蟲(chóng)草多糖的復(fù)溶性比較 稱取1.2.1制備的XDT 和CDT 兩種多糖樣品各0.1 g 研磨成細(xì)粉，過(guò)40 目篩，置于1 mL 70 ℃蒸餾水中，熱水浴保持溫度，每1 min 觀察兩種多糖溶解情況并上下振搖10 s，直至無(wú)肉眼可見(jiàn)顆粒即為完全溶解[14,24]。

1.2.5 兩種蛹蟲(chóng)草多糖體外生物活性對(duì)比分析

1.2.5.1 抗氧化活性測(cè)定 分別配制濃度為1、2、4、6 和8 mg/mL 的XDT 和CDT 多糖溶液，陽(yáng)性對(duì)照組以VC代替多糖溶液，配制成相同濃度（現(xiàn)用現(xiàn)配）。

a.DPPH 自由基清除能力的測(cè)定：參考國(guó)利超等[25]建立的方法，分別向樣品溶液中加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液振蕩混勻，避光反應(yīng)30 min，測(cè)定樣品在517 nm 波長(zhǎng)處吸光度記為Ai；樣品溶液中加入2 mL 無(wú)水乙醇，測(cè)定吸光度記為Aj；DPPH-乙醇溶液和無(wú)水乙醇各2 mL 混合，測(cè)定吸光度記為A0。

b.羥自由基清除能力的測(cè)定：參考Govindan 等建立的方法[26]，取樣品溶液1.0 mL，加入6 mmol/L的FeSO4溶液、6 mmol/L 的H2O2溶液、6 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液各1 mL，37 ℃水浴1 h 后在510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值記為Ai；蒸餾水代替樣品溶液記為A0；用蒸餾水代替H2O2溶液記為Aj。

c.超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定：參考Najafabad 等建立的方法[27]，分別取100 μL 樣品溶液，加入100 μL 濃度為50 mmol/L Tris-HCl （pH8.2）緩沖液，置于25 ℃水浴加熱20 min，取出后加入鄰苯三酚-HCl（30 mmol/L），精確反應(yīng)6 min，立即滴入7 μL 濃度為4 mol/L HCl 終止反應(yīng)，在325 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，記為Ai。以0.1 mol/L HCl 代替鄰苯三酚溶液，測(cè)定325 nm 吸光值，記為Aj。以蒸餾水代替樣品溶液作對(duì)照組在325 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，記為A0，按下式計(jì)算清除率：

1.2.5.2 抑制α-葡萄糖苷酶活性測(cè)定 取適量1.2.1制備的兩種多糖樣品復(fù)溶，以阿卡波糖作為陽(yáng)性對(duì)照，參照侯靜宇等[14]建立的方法進(jìn)行α-葡萄糖苷酶活性測(cè)定，并計(jì)算抑制率。按下列公式計(jì)算α-葡萄糖苷酶活性抑制率：式中以A1表示加入樣品的反應(yīng)液的吸光值；A2表示不加樣品的反應(yīng)液的吸光值；A 表示為加入樣品但不加酶的反應(yīng)液的吸光值。

1.2.5.3 抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性測(cè)定 參照侯靜宇等[14]建立的方法，以順鉑作為陽(yáng)性對(duì)照，采用CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活性。根據(jù)下列公式計(jì)算處理后的細(xì)胞抑制率（%）。公式中，Ac表示對(duì)照孔吸光度；As表示實(shí)驗(yàn)孔吸光度；Ab表示空白孔吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 及SPSS17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan 檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種方法制備的蛹蟲(chóng)草多糖得率和主要成分含量分析

對(duì)兩種方法制備的蛹蟲(chóng)草多糖得率進(jìn)行分析，結(jié)果表明殼聚糖絮凝法制備所得絮凝多糖（XDT）得率可達(dá)3.58%，是醇沉多糖（CDT）的1.91 倍，兩者具有顯著性差異（P＜0.01）（圖1a），這與文獻(xiàn)中報(bào)道的，殼聚糖絮凝法制備的牛蒡多糖和黑木耳多糖得率顯著高于水提醇沉法的結(jié)果類似[13-14]。可能是由于殼聚糖具有的電中和及吸附架橋作用，可有效去除多糖溶液中的雜質(zhì)，使多糖得率顯著提高[14]。

圖1 兩種方法制備的蛹蟲(chóng)草多糖得率和各組分含量Fig.1 Yield and component content of XDT and CDT

對(duì)兩種蛹蟲(chóng)草多糖中主要成分含量進(jìn)行分析可知，XDT 和CDT 兩種方法制備多糖主要成分均為總糖、蛋白質(zhì)和灰分，三者總含量分別占據(jù)總質(zhì)量的95.31%和88.39%。其中，XDT 的總糖含量為70.02%，是CDT 的1.16 倍，通過(guò)方差分析可知兩者差異極其顯著（P＜0.001） （圖1b），但是糖醛酸含量（圖1b）相較于CDT 有所降低，可能是由于殼聚糖中含有一定量的活性氨基，為天然存在的堿性多糖，容易與糖醛酸中的酸性基團(tuán)產(chǎn)生靜電吸引作用而產(chǎn)生絮凝[28]，以沉淀形式析出，使其含量降低。XDT 的蛋白質(zhì)含量為19.83%，而CDT 的蛋白質(zhì)含量為17.66%，兩者差異較為顯著（P＜0.05）；XDT 和CDT 中灰分含量分別為7.63%和10.37%，兩者差異顯著（P＜0.01）（圖1b）。絮凝法制備的蛹蟲(chóng)草多糖中含有一定量的蛋白組分和灰分等成分，仍屬于粗多糖，若無(wú)法滿足純度需求，可通過(guò)葡聚糖凝膠層析法、二乙氨基乙基纖維素52（DEAE-52）柱層析等方法進(jìn)一步純化，提高多糖純度[9]。綜上，與醇沉法相比較，絮凝法能夠顯著提高蛹蟲(chóng)草多糖的得率和多糖成分中的總糖含量占比。

2.2 兩種蛹蟲(chóng)草多糖結(jié)構(gòu)特性分析

2.2.1 蛹蟲(chóng)草多糖掃描電鏡形態(tài)觀察 在掃描電鏡下，XDT（圖2）顆粒規(guī)整，表面光滑，具有鱗片紋路，結(jié)構(gòu)緊密無(wú)明顯褶皺；而CDT（圖2）表面褶皺明顯，具有疏松的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，二者在掃描電鏡下形態(tài)差異明顯，可能由于兩種多糖中各組分的含量占比不同，CDT中的蛋白類和糖醛酸含量低，多糖顆粒間的相互作用點(diǎn)較少，顆粒相互作用較小，使得多糖顆粒間的聚集程度降低，從而呈現(xiàn)出無(wú)規(guī)則的顆粒狀態(tài)[29]。

2.2.2 蛹蟲(chóng)草多糖傅里葉紅外光譜分析 XDT 和CDT 紅外圖譜基本吻合，說(shuō)明殼聚糖絮凝法和醇沉法制備的多糖的官能團(tuán)沒(méi)有明顯差異（圖3）。具體分析圖譜可知，3500～3000 cm-1的一組峰是O-H 和N-H 的伸縮振動(dòng)；3000～2800 cm-1的一組峰是糖類C-H 伸縮振動(dòng)。1700 cm-1附近的吸收峰為羧基的酯鍵C=O 的伸縮振動(dòng)；1600 cm-1附近的吸收峰是由酰胺基的C=O 伸縮振動(dòng)、N-H 變角振動(dòng)引起的；1400～1200 cm-1的一組峰是由糖類化合物的亞甲基、甲基C-H 以及羧基C-O、O-H 變角振動(dòng)引起；1200～1000 cm-1的一組峰是吡喃糖環(huán)醚鍵、羥基以及環(huán)內(nèi)醚C-O 伸縮振動(dòng)引起的。1100～1000 cm-1的一組峰為多糖的一級(jí)羥基變角、二級(jí)羥基變角振動(dòng)；750 和800 cm-1附近的吸收峰分別為吡喃環(huán)對(duì)稱伸縮振動(dòng)和C-H 變角振動(dòng)，兩種方法制備的多糖在FT-IR 光譜中測(cè)得的峰形相似，均具有多糖的特征吸收峰[7]。

圖3 兩種方法制備的蛹蟲(chóng)草多糖傅里葉紅外圖譜Fig.3 Fourier infrared spectra of XDT and CDT

2.2.3 蛹蟲(chóng)草多糖構(gòu)象分析 剛果紅分子能夠與多糖三螺旋結(jié)構(gòu)中的β-葡聚糖結(jié)合，最大吸收峰由493 nm遷移至更高吸收波長(zhǎng)，即發(fā)生紅移，且三螺旋結(jié)構(gòu)的含量與吸收值的增加呈現(xiàn)量效關(guān)系[30]。在0～0.8 mol/L范圍內(nèi)，XDT 和CDT 兩種多糖最大吸收波長(zhǎng)隨NaOH濃度的改變而變化，兩者均產(chǎn)生紅移現(xiàn)象，說(shuō)明兩種多糖均具有規(guī)則的三螺旋結(jié)構(gòu)（圖4）。與CDT 相比，XDT 的紅移現(xiàn)象更明顯，說(shuō)明其比CDT 存在更多的三螺旋結(jié)構(gòu)[30]。研究表明，三螺旋結(jié)構(gòu)能夠影響多糖的抗腫瘤、抗菌和免疫調(diào)節(jié)等方面生物活性[31-32]。剛果紅實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，XDT 比CDT 具有更多的三螺旋結(jié)構(gòu)，預(yù)示著XDT 可能具有更高的生物活性[30]。

2.3 兩種蛹蟲(chóng)草多糖的粒徑分析

兩種方式得到的多糖在水溶液中的平均粒徑具有顯著差異，其中XDT 的平均粒徑為18.72±0.58 μm，而CDT 的平均粒徑為20.38±0.53 μm（圖5）。多糖粒徑的大小直接影響流變學(xué)性質(zhì)、消化特性、改性效果和熱力學(xué)性質(zhì)，平均粒徑作為體系內(nèi)所有顆粒的均一值具有重要的參考意義，XDT 平均粒徑減少可能是由于在絮凝操作過(guò)程中，破壞了多糖分子間的氫鍵或范德華力，導(dǎo)致分子間相互作用減弱，從而使其粒徑減小[33]。

圖5 兩種方法制備的蛹蟲(chóng)草多糖平均粒徑分析Fig.5 Average particle sizes analysis of XDT and CDT

2.4 兩種蛹蟲(chóng)草多糖的復(fù)溶性分析

0～1 min 時(shí)，XDT 顆粒開(kāi)始溶解并逐步向周圍擴(kuò)散，而CDT 顆粒散布于溶液中，未發(fā)生明顯溶解；2～3 min 時(shí)，XDT 基本溶解，CDT 顆粒開(kāi)始溶解，但相較于XDT 溶解速度低；到6 min 時(shí)，XDT 完全溶解，溶解后顏色為淺黃色，液體清澈透亮；CDT 復(fù)溶后溶液為灰色，液體渾濁，透光性差（圖6）。與侯靜宇等[14]制備的絮凝黑木耳多糖優(yōu)于醇沉黑木耳多糖的結(jié)果類似。綜上所述，XDT 的復(fù)溶速度、復(fù)溶后溶液顏色和澄清度優(yōu)于CDT。

圖6 兩種方法制備的蛹蟲(chóng)草多糖復(fù)溶性分析Fig.6 Solubility analysis of XDT and CDT

2.5 兩種蛹蟲(chóng)草多糖體外生物活性對(duì)比分析

2.5.1 體外抗氧化能力分析 以維生素C 為陽(yáng)性對(duì)照，研究了XDT 和CDT 對(duì)DPPH 和超氧陰離子和羥自由基的清除能力。兩種多糖對(duì)三種自由基的清除能力隨處理濃度的增加而逐漸升高，呈明顯的量效關(guān)系。在處理濃度為1 mg/mL 時(shí)，兩種多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力無(wú)明顯差異，在其余相同的處理濃度下，對(duì)三種自由基清除能力均表現(xiàn)為XDT＞CDT。XDT 在處理濃度為8 mg/mL 時(shí)，對(duì)超氧陰離子的清除率達(dá)到最高值75.54%±0.73%，而CDT 為69.93%±0.64%；在濃度為8 mg/mL 時(shí)，XDT 對(duì)羥自由基的清除作用達(dá)到最高值為71.17%±0.25%，高于CDT的66.67%±0.71%；XDT 和CDT 對(duì)于DPPH 自由基的清除能力相比前兩者較弱，在相同處理濃度下，XDT為72.17%±0.25%，而CDT 為67.67%±0.65%（圖7）。蛹蟲(chóng)草多糖的抗氧化活性與其還原力密切相關(guān)，還原力一般是由分子中具有供氫能力的物質(zhì)提供，推測(cè)其機(jī)理為，具有還原性的物質(zhì)可將其分子中的氫原子提供給DPPH 和羥自由基，從而使其轉(zhuǎn)變?yōu)榉亲杂苫a(chǎn)物，從而消除其對(duì)機(jī)體的損害，多糖中的糖醛酸，通過(guò)激發(fā)多糖鏈中端基碳的氫原子，使其具有較強(qiáng)的供氫能力，絮凝多糖中的糖醛酸含量明顯高于醇沉多糖，可能使其具有更高的還原力，因此具有更強(qiáng)的抗氧化活性[8]。

圖7 XDT 和CDT 的體外抗氧化能力Fig.7 Antioxidant ability of XDT and CDT in vitro

2.5.2 體外α-葡萄糖苷酶抑制活性分析 以阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照，研究了XDT 和CDT 對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性。兩種多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性隨處理濃度的增加而逐漸升高，呈明顯的量效關(guān)系。在0.2 和0.4 g/L 濃度時(shí)，兩者的抑制率沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05），而隨著濃度的增加，在相同濃度條件下，XDT 的抑制活性明顯強(qiáng)于CDT。當(dāng)濃度達(dá)到0.8～1.0 g/L 時(shí)，兩者具有極其顯著的差異（P＜0.001）（圖8）。α-葡萄糖苷酶是調(diào)控餐后血糖的重要靶點(diǎn)，抑制α-葡萄糖苷酶活性可有效降低餐后血糖，多糖的結(jié)構(gòu)與其降血糖活性密切相關(guān)，其中高級(jí)結(jié)構(gòu)、分子量和單糖組成均會(huì)影響其降血糖活性，如黃精多糖、豬苓多糖和馬尾藻多糖中含有的三螺旋結(jié)構(gòu)，與其降糖活性密切相關(guān)，而XDT 比CDT 含有更多的三螺旋結(jié)構(gòu)，可能使XDT 具有更強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性[34]。此外，提取方法也會(huì)影響多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響其生物活性，絮凝法操作步驟簡(jiǎn)單，不需要使用氯仿、酒精等有機(jī)試劑，可能有助于保持多糖的高級(jí)結(jié)構(gòu)，保留其活性，使絮凝法制備的多糖具有較高的α-葡萄糖苷酶抑制活性[14]。

圖8 XDT 和CDT 的體外α-葡萄糖苷酶抑制能力Fig.8 α-Glucosidase inhibitory ability of XDT and CDT in vitro

2.5.3 體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖能力分析 以順鉑為陽(yáng)性對(duì)照，研究了XDT 和CDT 對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖的抑制能力。兩種多糖對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖的抑制能力隨著處理濃度的增大而升高，除低濃度50 mg/L以外，在相同處理濃度條件下對(duì)HepG2 細(xì)胞的增殖抑制作用均為XDT＞CDT，兩者具有顯著性差異（P＜0.05），在200 和800 mg/L 下達(dá)到了極其顯著的差異，最大濃度800 mg/L 時(shí)，XDT 對(duì)HepG2 細(xì)胞的抑制率達(dá)到最大值62.56%±0.73%（圖9）。研究表明，三螺旋結(jié)構(gòu)能夠影響多糖的抗腫瘤活性[32-33]，前人從蛹蟲(chóng)草菌絲體和子實(shí)體中分離的兩種多糖（CMPSII 和CBPS-II）可以通過(guò)上調(diào)凋亡因子的表達(dá)，并下調(diào)增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，這兩種多糖均具有三螺旋骨架結(jié)構(gòu)[7]，XDT 比CDT 具有更強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞增殖能力，可能是由于XDT 中具有更多的三螺旋結(jié)構(gòu)。

圖9 XDT 和CDT 體外抑制HepG2 細(xì)胞增殖能力Fig.9 Inhibitory ability of XDT and CDT on HepG2 cells proliferation in vitro

3 討論與結(jié)論

本研究采用殼聚糖絮凝法和傳統(tǒng)水提醇沉法分別制備了蛹蟲(chóng)草多糖，對(duì)兩種多糖的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征、復(fù)溶性和體外抗氧化、抗腫瘤及降糖活性等進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，與醇沉法相比較，絮凝法能夠顯著提高多糖的得率和多糖成分中的總糖含量占比；兩種多糖物理特征上具有明顯差異，掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，XDT 顆粒大小、顏色均一度等指標(biāo)顯著優(yōu)于CDT，粒徑分析和多糖復(fù)溶性分析進(jìn)一步地證實(shí)，XDT 相較于CDT 平均粒徑更小，復(fù)溶速度更快；兩種多糖的紅外圖譜沒(méi)有明顯差異，但XDT 比CDT 具有更多的三螺旋結(jié)構(gòu)；XDT 的體外抗氧化活性、α-葡萄糖苷酶抑制活性和抗腫瘤活性均優(yōu)于CDT。

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們對(duì)比分析了絮體（殼聚糖與多糖溶液絮凝后產(chǎn)生的沉淀）和殼聚糖顆粒的紅外光譜圖，初步發(fā)現(xiàn)與殼聚糖顆粒相比，絮體在1500～1100 cm-1附近處的吸收峰發(fā)生了明顯偏差，這一區(qū)域出現(xiàn)的吸收峰，主要是由糖類化合物的亞甲基、甲基C-H 以及羧基C-O 變角等振動(dòng)引起，這說(shuō)明殼聚糖分子確實(shí)參與了絮凝作用[7]，但具體的絮凝機(jī)制，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究?jī)H對(duì)比了XDT 和CDT 的體外生物活性，但XDT 在體內(nèi)的生物活性是否優(yōu)于CDT，還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。綜上，殼聚糖絮凝法制備蛹蟲(chóng)草多糖具有良好的應(yīng)用前景，研究結(jié)果為蛹蟲(chóng)草多糖在抗氧化、抗腫瘤和降血糖等功效產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。