鱘魚表皮粘液抗菌肽的分離鑒定及抑菌活性分析

段曉琳，樊 燕，汪金林，姜曉明，徐新星，張緒清，劉 荔，劉 康, ，趙元暉,

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島 266003；2.衢州鱘龍水產(chǎn)食品科技開發(fā)有限公司，浙江衢州 324002；3.連云港海娃食品有限公司，江蘇連云港 222000）

魚類富含水分、蛋白質、不飽和脂肪酸等營養(yǎng)物質，適宜微生物生長，極易腐敗變質。微生物及其代謝產(chǎn)生的蛋白酶、脂酶等在魚類產(chǎn)品的貯藏過程中共同作用，分解蛋白質、脂質等營養(yǎng)物質，改變肌肉質構特性及營養(yǎng)組成，導致品質劣變[1]。抗生素是抑制微生物繁殖的重要手段。然而隨著抗生素的濫用和對耐藥細菌缺乏有效的治療策略，多重耐藥菌的出現(xiàn)引發(fā)全球關注[2]。耐藥菌目前已在土壤、河流、農(nóng)場附近被發(fā)現(xiàn)，并可能在大氣中及沿著環(huán)境-食物-人類鏈傳播，危害生態(tài)環(huán)境及人類健康[3-4]。目前天然保鮮劑因兼具高效性及安全性在市場上具有更廣泛的需求，但還存在一定的不足，如殼聚糖等自身帶有顏色、氣味或酸堿性，影響水產(chǎn)品品質[5-6]。因此尋找安全高效的天然保鮮劑對水產(chǎn)品保鮮具有重要意義[7]。

在過去的20 年中，抗菌肽被確定為新型抗菌藥物的潛在來源，并因其低耐藥性和高功能性而被視為傳統(tǒng)抗生素的最佳替代品[8]?？咕氖怯缮矬w特定基因編碼并且經(jīng)過外界誘導產(chǎn)生的普遍存在于動植物和微生物中的具有抑菌活性的小分子多肽。魚類在受到病原微生物的侵害時，粘膜表面會分泌抗菌肽等物質以作為防御和殺傷病原微生物的非特異性免疫因子[9]。迄今為止，許多研究人員已經(jīng)成功地從魚粘液中提取了抗菌肽：Go 等[10]從河豚粘液中純化了由23 個氨基酸組成的新型抗菌肽TpHAMP2，Su[11]從黃鯰魚的粘液中獲得了線性抗菌肽Pelteobagrin。然而，關于鱘魚粘液中抗菌肽的提取及應用的研究相對較少，目前僅有對粘液中凝集素等混合物抑菌活性的研究，且抑菌機制尚不清楚[12]。

中國是世界上鱘魚養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的國家，鱘魚作為一種常見的生物資源，具有極高的經(jīng)濟價值和科學研究價值[13]。目前，除了主要產(chǎn)品魚子醬外，其魚肉、魚骨和魚皮已廣泛用于生產(chǎn)膠原蛋白肽、硫酸軟骨素等，而副產(chǎn)物粘液尚未得到有效利用[14-15]。本研究以鱘魚表皮粘液為研究對象，研究了其基本組分及氨基酸組成，制備了表皮粘液抗菌肽粗提物，并應用于三文魚保鮮；成功分離純化并鑒定出兩種新型抗菌肽，驗證了其抑菌活性，旨在為水產(chǎn)品的加工貯藏和人類健康相關應用提供理論依據(jù)，也為低值化水產(chǎn)原料的高值化利用提供了新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

養(yǎng)殖鱘魚（sturgeon） 購自山東省青島市城陽區(qū)水產(chǎn)零售交易批發(fā)市場，選取體重為（1.5±0.5）kg，平均體長為（65±10）cm，活魚充氧保活運至實驗室；鮮切三文魚片 購自藍吉道供應鏈集團有限公司；大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、希瓦氏菌 中國海洋大學水產(chǎn)品高值化利用實驗室保藏；乙腈、三氟乙酸（TFA）（色譜純） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；鹽酸、硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、苯酚、石油醚、檸檬酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、無水乙醇、甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑、乙酸鈉、苯甲磺酰氟（PMSF）、LB 固體培養(yǎng)基、LB 液體培養(yǎng)基 國藥集團化學試劑有限公司；檸檬酸鈉、甘氨酸、Triton X-100 北京索萊寶科技有限公司；合成肽HSETLHDV、PLTDWQL（純度＞98%） 吉爾生化（上海）有限公司；實驗所用其他化學試劑 均為國產(chǎn)分析純。

AB135-S 型天平 瑞士梅特勒公司；GL-21M 型離心機 湘儀離心機儀器有限公司；Kjeltec 8100型全自動凱氏定氮儀、Soxtec8000 全自動脂肪測定儀 福斯分析儀器公司；UV-2550 型紫外可見光光度計 日本島津公司；FDU-1200 型冷凍干燥機 上海愛郎儀器有限公司；DZF-6050 型真空干燥箱 上海海向儀器設備廠；L-8900 型氨基酸自動分析儀日本HITACHI 公司；SpectraMax i3x 型酶標儀 美谷分子儀器（上海）有限公司；WAT036905-Sep-Pak C18固相萃取柱、Q Exactive HF-X 質譜儀 美國ThermoFisher Scientific 公司；?KTA pure25 型蛋白純化儀 美國通用電氣醫(yī)療公司；Agilent 10 Prep-C18液相色譜柱 美國Agilent 公司；YXQ-75SII 型高壓滅菌鍋 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；SJ-CJ-2FDQ 型超凈工作臺 蘇潔醫(yī)療器械（蘇州）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鱘魚表皮粘液的收集和預處理 參考晉高偉[16]的方法進行鱘魚表皮粘液的收集和預處理。先以蒸餾水沖洗鱘魚魚體，再用塑料刮板輕刮鱘魚的背部收集粘液。將收集的粘液離心（4000×g，10 min）后收集上清液，凍干后裝入離心管中密封，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 鱘魚表皮粘液基本成分分析 測定鱘魚表皮粘液凍干粉的基本成分。蛋白質以GB/T 5009.5-2016 自動凱氏定氮儀法測定[16]；脂肪以GB/T 5009.6-2016 酸水解法測定[17]；總糖以苯酚硫酸法測定（y=0.063x+0.013，R2=0.9969）[18]。

1.2.3 氨基酸組成測定 參考GB 5009.124-2016，使用自動氨基酸分析儀測定鱘魚表皮粘液凍干粉中氨基酸的含量及組成[19]。稱取2 mg 凍干粉于水解管中，加入15 mL 6 mol/L 鹽酸溶液（含0.5%巰基乙醇，v/v），充滿氮氣并密封，于110 ℃水解24 h。水解結束后冷卻并過濾至50 mL 容量瓶中，定容至刻度，取1 mL 濾液于試管中，氮吹吹干。用2 mL 0.02 mol/L的鹽酸溶液復溶，過0.22 μm 的膜后上機測定。

1.2.4 鱘魚表皮粘液抗菌肽粗提物的制備 先以蒸餾水沖洗鱘魚魚體，再輕刮鱘魚背部收集粘液于燒杯中。將收集的粘液立即與含0.2 mol/L 乙酸鈉、0.2%Triton X-100 和1 mmol/L PMSF 的萃取液混合，0 ℃攪拌萃取24 h[16]。離心（4 ℃，8000×g，30 min）后收集上清液并凍干，得到鱘魚表皮粘液抗菌肽粗提物，-20 ℃凍藏備用。

1.2.5 抗菌肽粗提物抑菌活性驗證 根據(jù)牛津杯法驗證抗菌肽粗提物的抑菌活性[20]。將1%生長至對數(shù)期的枯草芽孢桿菌接種于LB 固體培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)皿中擺放牛津杯，在培養(yǎng)皿中倒入約15 mL 上述培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固后取出牛津杯。用無菌PBS復溶鱘魚表皮粘液抗菌肽粗提物至質量濃度分別為50、100、200 mg/mL，將樣液分別加入牛津杯孔中，以無菌PBS 緩沖液為陰性對照，蓋上培養(yǎng)皿蓋，28 ℃過夜培養(yǎng)，觀察抑菌圈大小及形態(tài)。

1.2.6 抗菌肽粗提物在三文魚保鮮中的應用

1.2.6.1 樣品處理 取三文魚背脊魚肉，均勻切為約10 g/片的小片，用無菌水清洗并晾干[21]。將魚片浸泡于質量濃度為50 mg/mL 的鱘魚表皮粘液抗菌肽粗提物中10 min，對照組浸泡于無菌PBS 中。浸泡完畢后，將魚片裝入無菌袋中密封，放入4 ℃冰箱中保藏，分別在第0、3、6、9 d 取出并測定相關指標。

1.2.6.2 菌落總數(shù)測定 參考GB 4789.2-2016 測定不同保鮮時間下三文魚菌落總數(shù)[22]。

1.2.6.3 揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）測定 參考GB 5009.228-2016 測定不同保鮮時間下?lián)]發(fā)性鹽基氮含量[21]。

1.2.7 鱘魚表皮粘液抗菌肽的分離純化

1.2.7.1 固相萃取 無菌超純水溶解抗菌肽粗提物凍干粉至質量濃度為10 mg/mL，用10 mL 含0.1%三氟乙酸（TFA）的80%乙腈（ACN）（緩沖液A）激活Sep-Pak C18（1 g，6 cc）柱體，15 mL 含0.1% TFA的水溶液（緩沖液B）清洗萃取柱。樣品進樣至固相萃取柱中，10 mL 緩沖液B 沖洗柱體去除雜質，再用10 mL 緩沖液A 洗脫抑菌成分，收集洗脫液并凍干備用。取部分用于測定凍干粉的抑菌活性。

1.2.7.2 凝膠過濾層析 無菌超純水溶解有抑菌活性凍干粉至質量濃度為10 mg/mL，0.22 μm 濾膜過濾后進樣至Sephacryl S-100 層析柱。流動相為超純水，流速為0.5 mL/min，上樣體積500 μL/次。上樣前用流動相緩沖液平衡層析柱2 倍柱體積。上樣后，在220 nm 下收集各吸收峰并凍干備用。取部分用于測定凍干粉的抑菌活性。

1.2.7.3 反相高效液相色譜 無菌超純水重新溶解具有抑菌活性凍干組分至質量濃度為1 mg/mL，并用0.22 μm 濾膜過濾后進樣至液相色譜。洗脫液為含0.1% TFA 的水溶液（流動相A）和含0.1% TFA的ACN（流動相B）。在10 min 內(nèi)洗脫（20 mL/min），采用（流動相A:流動相B=1:9）的比例等度洗脫，柱溫25 ℃，進樣體積900 μL。在220 nm 下收集各吸收峰并凍干備用，取部分用于測定凍干粉的抑菌活性。

1.2.8 抑菌活性測定 牛津杯法：同1.2.5。

平板計數(shù)法[23]：在已滅菌的2 mL 離心管中加入10 μL 生長至對數(shù)期的枯草芽孢桿菌或大腸桿菌菌液和990 μL PBS 緩沖液，混勻后取50 μL 菌液與溶解的液相色譜純化后抗菌肽凍干粉1:1（v/v）混合。作用1 h 后，取20 μL 混合液加入到980 μL PBS緩沖液中，混勻后從中取20 μL 溶液充分涂板于PCA 培養(yǎng)基中，以無菌PBS 緩沖液作為陰性對照。將PCA 培養(yǎng)基倒置放于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，結束后對菌落進行計數(shù)。

1.2.9 鱘魚表皮粘液抗菌肽結構鑒定 采用LCMS/MS 液質聯(lián)用設備對分離純化所得抗菌肽進行鑒定。HPLC 條件：流動相A 液組成為100%質譜水、0.1%甲酸；流動相B 液組成為80%乙腈、0.1%甲酸；流速600 nL/min，上樣量3 μL；洗脫條件如表1 所示。

表1 液相色譜洗脫條件Table 1 Conditions of LC elution

質譜條件：采用Orbitrap Exploris 480 質譜儀，Nanospray Flex?（NSI）離子源，設定離子噴霧電壓為2.2 kV，離子傳輸管溫度為320 ℃。質譜采用數(shù)據(jù)依賴型采集模式，質譜全掃描范圍為m/z 350～1200，一級質譜分辨率設為60000（200 m/z），AGC為Custom，最大注入時間為50 ms；二級質譜分辨率設為15000（110 m/z），AGC 為Custom，最大注入時間為22 ms，肽段碎裂碰撞能量設為30%。

1.2.10 合成肽樣品純度分析 實驗所用多肽HSETLHDV 和PLTDWQL 由吉爾生化（上海）有限公司人工合成制得。通過高效液相色譜C18柱對多肽樣品的純度進行了測定。稱取200 μg 多肽樣品，溶于200 μL 超純水，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后裝至液相瓶中。流動相A 為體積分數(shù)0.1%的TFA 水溶液，流動相B 為體積分數(shù)0.1%的TFA 乙腈溶液。設置流速為0.5 mL/min，進樣量為20 μL，波長為210～400 nm，時間50 min。通過質譜儀對多肽分子量進行了測定[24]。配制濃度為1 mg/mL 的多肽溶液，取1 μL 多肽溶液與飽和的4-羥基-α-氰基肉桂酸（HCCA）溶液1:1（v/v）混合，將混合溶液滴于基板上，置于通風櫥中自然風干，后將基板放入質譜儀中進行分析。

1.2.11 合成抗菌肽的抑菌活性驗證 紙片法[25]：在無菌培養(yǎng)皿中倒入約15 mL LB 固體培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基冷卻后取50 μL 生長至對數(shù)期的希瓦氏菌均勻涂布于培養(yǎng)基上。用無菌鑷子將已滅菌的濾紙片分別浸入濃度為256 μmol/L 的兩條合成肽溶液中，無菌PBS 為陰性對照，將濾紙片間隔一定距離貼在平板中。將平板倒置于28℃培養(yǎng)箱中，24 h 后觀察抑菌效果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以上所測數(shù)據(jù)均為設置了三次平行實驗的結果，以平均值±標準差方式呈現(xiàn)。多肽疏水性數(shù)值由強耀生物（http://www.chinapeptides.net/tool.aspx）提供技術支持。采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件分別對數(shù)據(jù)進行處理與分析，Origin 9.0 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 鱘魚表皮粘液凍干粉組成

如表2 所示，對鱘魚表皮粘液凍干粉的基本組成進行分析可知，其蛋白質含量為47.44%±0.59%，脂肪含量為3.68%±0.28%，總糖含量為5.21%±0.92%。結果表明，鱘魚表皮粘液凍干粉中蛋白質含量豐富，這與韓慶等[26]對于洞庭湖鯰魚體表黏液營養(yǎng)成分分析結果一致。粘液的組分構成與其抑菌功能密切相關[12]。粘液是魚類抵御外界病原微生物的第一道屏障，含有大量抑菌蛋白類物質如抗菌肽、溶菌酶、凝集素等[27-29]。鱘魚粘液中的大量蛋白質為后續(xù)提取抗菌肽提供了有效的來源。

表2 鱘魚表皮粘液凍干粉的組成（%）Table 2 Composition of lyophilized sturgeon epidermal mucus powder (%)

2.2 鱘魚表皮粘液凍干粉氨基酸組成

對鱘魚表皮粘液凍干粉酸水解后，通過氨基酸自動分析儀對氨基酸組成進行分析，結果如圖1 和表3 所示。粘液凍干粉中含有16 種氨基酸，總量達459.68 mg/g。粘液中賴氨酸、精氨酸、組氨酸三種帶正電荷氨基酸含量較高，占總氨基酸含量的15.82%，高于其在洞庭湖鯰魚體表黏液中的含量（10.32%），后者被證明是一種可靠的抗菌肽來源[16,26]。疏水性氨基酸苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸和蛋氨酸的含量也較高，占總氨基酸含量的34.61%，高于其在鯰魚體表粘液中的含量（26.60%）及其在羅非魚副產(chǎn)物抗菌肽中的含量（27.43%）[26,30]。帶正電荷氨基酸與疏水性氨基酸含量高有利于抗菌肽通過靜電和疏水作用與細菌細胞膜結合并穿越細胞膜磷脂雙分子層，破壞細胞膜正常結構及選擇透過功能，促使細菌死亡，發(fā)揮抑菌作用[31-34]。因此，鱘魚表皮粘液中高含量的帶正電荷氨基酸及疏水氨基酸為進一步提取粘液抗菌肽，發(fā)揮潛在抑菌活性提供了物質基礎，為抵抗病原微生物的侵害提供了堅實保障。

圖1 氨基酸分析色譜圖Fig.1 Chromatogram of amino acid analysis

表3 鱘魚表皮粘液凍干粉氨基酸組成Table 3 Amino acid composition of lyophilized sturgeon epidermal mucus powder

2.3 鱘魚表皮粘液抗菌肽粗提物抑菌活性驗證

通過枯草芽孢桿菌驗證鱘魚表皮粘液抗菌肽粗提物的抑菌活性，結果如圖2 所示。在50、100、200 mg/mL 的濃度梯度下，抗菌肽粗提物對枯草芽孢桿菌均表現(xiàn)了明顯抑菌圈，且抑菌圈直徑隨抗菌肽粗提物質量濃度提高而擴大，呈濃度依賴性。這表明抗菌肽粗提物具有高效抑菌活性，也驗證了抗菌肽粗提物中確含有抑菌活性物質，為粗提物的應用及抗菌肽的純化奠定了基礎。

圖2 鱘魚表皮粘液抗菌肽粗提物抑菌活性Fig.2 Antimicrobial activity of crude extract of antimicrobial peptide from sturgeon epidermal mucus

2.4 鱘魚表皮粘液抗菌肽粗提物對三文魚的保鮮效果

4 ℃貯藏條件下，鱘魚表皮粘液抗菌肽粗提物對三文魚菌落總數(shù)及揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）的影響如圖3 所示。如圖3a 所示，無處理組及鱘魚表皮粘液抗菌肽粗提物處理組三文魚菌落總數(shù)均隨貯藏時間的延長而升高。無處理組三文魚菌落總數(shù)從初始的3.89 lg CFU/g 顯著增加至貯藏結束時的8.32 lg CFU/g，其中貯藏第6 d 菌落總數(shù)已超過ICMSF 1986 規(guī)定的食品微生物限量值（7.0 lg CFU/g）；而抗菌肽粗提物處理組三文魚菌落總數(shù)由第0 d 的4.02 lg CFU/g，緩慢增加至第9 d 的5.51 lg CFU/g，在貯藏結束時仍未超過食品微生物限量值。如圖3b 所示，無處理組及鱘魚表皮粘液抗菌肽粗提物處理組三文魚TVBN 值均隨貯藏時間的延長而升高。GB/T 18108-2019《鮮海水魚通則》規(guī)定，海水魚優(yōu)級品為TVBN≤15 mg/100 g，合格品為15～30 mg/100 g。第0 d新鮮三文魚片的TVB-N 值為7.02±0.04 mg/100 g，屬優(yōu)級品范圍；第3 d 無處理組TVB-N 值為16.41±0.09 mg/100 g，屬合格品范圍，抗菌肽粗提物處理組TVB-N 值為7.24±0.03 mg/100 g，仍屬優(yōu)級品范圍；第9 d 無處理組TVB-N 值為36.39±0.04 mg/100 g，超出了合格品限值，而抗菌肽粗提物處理組TVBN 值為18.37±0.05 mg/100 g，遠低于無處理組，稍超優(yōu)級品范圍。這表明了鱘魚表皮粘液抗菌肽粗提物能夠有效抑制三文魚貯藏期間微生物生長及對蛋白質的分解作用，延緩三文魚變質，延長貨架期。

圖3 抗菌肽粗提物對三文魚菌落總數(shù)（a）和揮發(fā)性鹽基氮（b）的影響Fig.3 Effects of crude extract of antimicrobial peptide on total colony count (a) and volatile basic nitrogen (b) of salmon

2.5 分離純化后抗菌肽抑菌活性

鱘魚表皮粘液抗菌肽的分離純化分為固相萃取、凝膠層析和反相高效液相色譜三個步驟，每步純化后的抑菌活性測定結果如圖4 所示。如圖4a 所示，經(jīng)過固相萃取及凝膠過濾層析后，抗菌肽仍保留明顯抑菌圈，表明純化過程中均保留了抗菌肽抑菌活性。凝膠過濾層析后抑菌圈直徑略有縮小，這是因為固相萃取后抗菌肽中含有具有抑菌作用的溶菌酶或大分子蛋白在凝膠過濾層析后被去除[16]。反相液相色譜純化后抗菌肽抑菌活性如圖4b 所示，為了更加直觀準確地得到抑菌率，使用平板計數(shù)法驗證抑菌活性，液相色譜純化后最高抑菌活性組分對枯草芽孢桿菌的抑菌率達92.40%±4.50%，對大腸桿菌的抑菌率為75.43%±5.02%。這表明，分離純化后的抗菌肽對革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌及革蘭氏陰性菌大腸桿菌的生長均有明顯的抑制作用，對枯草芽孢桿菌的抑制性最佳。

圖4 鱘魚表皮粘液抗菌肽固相萃取及凝膠過濾層析（a）和反相液相色譜（b）純化后的抑菌活性Fig.4 Antimicrobial activities of antimicrobial peptides of sturgeon epidermal mucus purified by solid phase extraction and gel filtration chromatography (a) and reverse phase high performance liquid chromatography (b)

2.6 鱘魚表皮粘液抗菌肽結構鑒定

本實驗采用LC-MS/MS 測定氨基酸序列，得到兩條新型抗菌肽HSETLHDV 和PLTDWQL，二級質譜見圖5。HSETLHDV 的氨基酸序列為組氨酸-絲氨酸-谷氨酸-蘇氨酸-亮氨酸-組氨酸-天冬氨酸-纈氨酸，命名為HV-8。HV-8 的主要碎片離子包括b2+（225.10）、y3+（370.17）、b4+（455.19）、b5+（568.27）、b6+（705.33）、y7+（800.37）。PLTDWQL 的氨基酸序列為脯氨酸-亮氨酸-蘇氨酸-天冬氨酸-色氨酸-谷胱酰胺-亮氨酸，命名為PL-7。PL-7 的主要碎片離子包括b2+（211.14）、y2+（260.17）、b3+（312.19）、y3+（446.24）、y4+（561.26）、b5+（613.29）、y5+（662.31）、b6+（741.37）、y6+（775.39）。

圖5 抗菌肽二級質譜Fig.5 MS/MS of antimicrobial peptides

2.7 人工合成抗菌肽

如圖6 所示，使用液相色譜法驗證人工合成抗菌肽純度，兩條肽分別均只有單峰出現(xiàn)，且通過積分峰面積計算得出兩條多肽純度均大于98%，可用于下一步實驗分析。一級質譜分析結果表示，HV-8 的[M+2H]2+的理論分子量為469.48 Da，實際分子量為469.4 Da，PL-7 的[M+H]+理論分子量為872.97 Da，實際分子量為872.70 Da，兩條肽的理論分子量與實驗所得數(shù)據(jù)一致，表明合成肽確為目標多肽分子。

圖6 HV-8（a）與PL-7（b）多肽反相高效液相色譜圖Fig.6 RP-HPLC of HV-8 (a) and PL-7 (b) peptides

2.8 合成抗菌肽抑菌活性驗證

通過紙片法驗證了兩條新型抗菌肽對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、希瓦氏菌的抑制活性，結果如表4所示。HV-8 和PL-7 對三種受試菌株均表現(xiàn)了明顯抑菌圈。其中，在對希瓦氏菌生長的抑制實驗中，HV-8 抑菌圈直徑更大，抑菌活性更高。抗菌肽抑菌活性與其結構密切相關，帶正電荷氨基酸有助于抗菌肽與細胞膜通過靜電吸引相互靠近，與細胞膜上帶負電荷脂多糖的磷酸基團發(fā)生作用，破壞細胞膜結構，促進細胞死亡；疏水性氨基酸可與細菌細胞膜之間通過疏水相互作用導致細菌細胞膜脂多糖和磷脂大量釋放，改變細菌細胞膜通透性，使細菌死亡[35-37]。HV-8 和PL-7 的結構如圖7 所示，HV-8 疏水性為62%，PL-7 疏水性達71%，二者均具有較高疏水性，可能通過疏水作用促進細菌死亡[38]。同時HV-8 含有2 個帶正電的組氨酸，可通過靜電作用、疏水作用協(xié)同增效抑菌，這可能是其具有更佳抑菌效果的原因[39]。

圖7 合成抗菌肽化學結構Fig.7 Chemical structures of synthetic peptides

表4 合成抗菌肽抑菌圈直徑（mm）Table 4 Diameter of inhibition zone of synthetic antimicrobial peptides (mm)

3 結論

本研究分析了鱘魚表皮粘液的基本組分及氨基酸組成。粘液中主要成分為蛋白質，含量占47.44%±0.59%，且粘液中帶正電荷氨基酸及疏水氨基酸含量高，分別占總氨基酸含量的 15.82%和 34.61%。制備了鱘魚表皮粘液抗菌肽粗提物，發(fā)現(xiàn)其能有效抑制三文魚貯藏期間微生物的增殖及蛋白質降解。同時成功純化并鑒定了兩種新型抗菌肽HSETLHDV（HV-8）和PLTDWQL（PL-7）。結果表明兩種合成抗菌肽對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌及希瓦氏菌均具有顯著抑菌作用。本研究為鱘魚表皮粘液抗菌肽作為抗生素替代物及食品保鮮劑提供支撐，同時也為水生生物資源的開發(fā)和利用開辟新途徑。下一步將利用合成抗菌肽對鱘魚表皮粘液抗菌肽的抑菌機制進行研究。