基于信號通路探討中醫(yī)藥治療失眠的研究進(jìn)展*

吳成挺，張青萍，吳鵬，周嬌嬌，李果，陳鑫源

1 廣西中醫(yī)藥大學(xué) 廣西南寧 530000

2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 廣西南寧 530000

失眠是一個公共衛(wèi)生問題，最初被認(rèn)為是一種癥狀，現(xiàn)在被定義為一種疾病[1]。其特征是難以入睡或維持睡眠，并伴有清醒時易怒或疲勞等癥狀，且影響到白天的正?；顒印Ｑ芯勘砻鱗2]，大約33%～50%的成年人會出現(xiàn)失眠癥狀。目前失眠的有效治療包括藥物、行為和認(rèn)知等。簡單的行為干預(yù)在初級保健機構(gòu)中是可行的，但缺乏對這些技術(shù)的培訓(xùn)而限制了它們的使用。在藥物干預(yù)中，苯二氮卓受體激動劑藥物使用最多，其次為褪黑素受體激動劑和具有催眠效果的抗抑郁藥物、非典型抗精神病藥物等，但這些藥物均應(yīng)限制在最低必要劑量和最短必要持續(xù)時間[3]。對于現(xiàn)代藥物長期的治療下，患者往往會產(chǎn)生不良反應(yīng)及藥物的耐藥性，且部分藥物停藥后可能發(fā)生撤藥癥狀。然我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對于失眠治療有其獨特的優(yōu)勢，因此本文基于信號通路探討中醫(yī)藥治療失眠，為中醫(yī)藥治療失眠提供更多理論依據(jù)。失眠屬中醫(yī)學(xué)“不寐”“目不瞑” “不得眠”等范疇，其基本病機為陽盛陰衰，陰陽失交，《黃帝內(nèi)經(jīng)》中提到“陰平陽秘，精神乃治”，因此失眠的治療主要以調(diào)和陰陽的平衡為主。

近年來，隨著細(xì)胞信號通路的興起，對與中醫(yī)藥調(diào)控細(xì)胞信號通路治療失眠的作用機制尚缺乏最新的綜述文章。本文重點對這些方面所涉及到的細(xì)胞信號通路予以綜述，整理中醫(yī)藥治療失眠的關(guān)鍵信號通路如，JAK - STAT、cAMP、TLR/NF-κB等，為進(jìn)一步闡明中醫(yī)藥防治失眠提供理論依據(jù)。

JAK/STAT通路

Janus激酶（JAK）/信號換能器和轉(zhuǎn)錄激活劑（STATs）是一組與許多細(xì)胞因子發(fā)揮和整合其功能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可將細(xì)胞外細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄變化，其作用與機體免疫反應(yīng)關(guān)系密切[4-5]。在JAK/STAT信號通路中主要由三個部分組成：①接收信號的酪氨酸激酶相關(guān)受體；②傳遞信號的酪氨酸激酶JAK；③產(chǎn)生效應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子STAT，其中JAK家族有 4 個成員：JAK1、JAK2、JAK3 和 TYK2。STAT家族有7個成員：STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b 和 STAT6[6]。該通路發(fā)揮作用的機制過程如下：（1）配體和受體之間的連接誘導(dǎo) JAK 的轉(zhuǎn)磷酸化；（2）活化的 JAK 導(dǎo)致結(jié)合受體的酪氨酸磷酸化，形成 STAT 的對接位點；（3）在這個對接位點，JAK 磷酸化 STAT，然后 STAT 與受體解離并通過 SH2結(jié)構(gòu)域-磷酸酪氨酸相互作用形成同二聚體或異二聚體；（4）這些二聚體易位至靶基因啟動子，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄[7-8]。而轉(zhuǎn)錄因子STAT 通?？赏ㄟ^以下幾種機制調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄：①STAT 與其 DNA 靶位點結(jié)合以驅(qū)動轉(zhuǎn)錄激活；②STAT蛋白可能與非STAT轉(zhuǎn)錄因子形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，觸發(fā)STAT介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄；③ STAT 與非 STAT DNA 結(jié)合元件結(jié)合，促進(jìn) STAT 依賴性轉(zhuǎn)錄；④STAT 和非 STAT 轉(zhuǎn)錄因子可以通過與獨立的 DNA結(jié)合位點簇結(jié)合來協(xié)同激活轉(zhuǎn)錄[6]。有臨床研究發(fā)現(xiàn)，睡眠不足可導(dǎo)致單核細(xì)胞數(shù)量增加、炎癥因子系統(tǒng)性調(diào)節(jié)、免疫功能障礙加重[7，9-11]。睡眠不足還可以激活自發(fā)性先天免疫和STAT家族蛋白[12]。據(jù)報道，JAK/STAT3 信號通路可在睡眠剝奪患者中被激活，并且可以在微環(huán)境中通過細(xì)胞因子在小膠質(zhì)細(xì)胞中進(jìn)行調(diào)節(jié)，由此可見JAK/STAT3通路直接參與調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞的活性[13-17]。

Li L[18]等人發(fā)現(xiàn)，溫膽湯中主要活性成分柚皮苷（NAR）可通過抑制JAK/STAT3通路活性，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2細(xì)胞的增殖、遷移和炎癥，并增強其吞噬功能，來發(fā)揮保護(hù)BV-2細(xì)胞的作用。對于睡眠不足后免疫功能的紊亂具有一定的治療作用。章程鵬[19]等人發(fā)現(xiàn)睡眠剝奪會激活JAK2/STAT3信號通路，并且發(fā)現(xiàn)該通路的負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞因子SOCS3在睡眠剝奪下出現(xiàn)了顯著下降，而運用了人參-石菖蒲藥液干預(yù)后SOCS3出現(xiàn)了上升，并且抑制了JAK2和STAT3蛋白的磷酸化，一定程度上阻斷了JAK2/STAT3信號通路的激活。說明人參-石菖蒲藥對可能是通過SOCS-3為靶點來調(diào)控JAK/STAT信號通路，起到抑制炎性反應(yīng)，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞達(dá)到促進(jìn)睡眠和改善記憶的作用。

cAMP通路

環(huán)磷酸腺苷（cAMP）是胞內(nèi)的第二信使，由腺甘酸環(huán)化酶 （AC）分解ATP產(chǎn)生，通過磷酸二酯酶（PDE）降解，其作用可以直接調(diào)節(jié)細(xì)胞的各種生物學(xué)過程或行為，包括細(xì)胞代謝、離子通道激活、基因表達(dá)、細(xì)胞生長、分化和凋亡等[20]，在信號傳導(dǎo)中，其上游信號傳導(dǎo)分子主要包括G蛋白、G蛋白偶聯(lián)受體和 AC，而cAMP主要負(fù)責(zé)傳遞 G 蛋白偶聯(lián)受體信號，其下游直接調(diào)控的靶蛋白可分為4類，目前的研究主要集中在cAMP 依賴性蛋白激酶A（PKA）和cAMP活化的交換蛋白（Epca）信號傳導(dǎo)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，cAMP 能夠通過PKA-cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）和 Epac等信號通路，參與睡眠、晝夜節(jié)律調(diào)控和學(xué)習(xí)記憶等多種功能[21-24]。

1 cAMP/PKA

cAMP 依賴性蛋白激酶 PKA 是絲氨酸-蘇氨酸蛋白 AGC 激酶家族的一個特征明確的胞質(zhì)全酶，并且是 cAMP信號傳導(dǎo)的效應(yīng)激酶，在許多細(xì)胞過程中起關(guān)鍵作用，參與控制多種細(xì)胞過程，包括代謝、細(xì)胞生長、基因表達(dá)和細(xì)胞凋亡[25]。有研究表明cAMP/PKA通路不僅參與突觸可塑性和記憶存儲，而且還參與調(diào)節(jié)清醒和快速眼動 （REM） 睡眠[26]。例如，大鼠在清醒時皮質(zhì)、海馬、下丘腦和腦橋中的cAMP水平相對較高，但在非快速眼動 （NREM） 睡眠和 REM 睡眠中水平較低[27]。此外，增加cAMP活性的治療可促進(jìn)覺醒。相反，cAMP 活性降低已被證明會增加果蠅的休息時間[28-29]。

王慧[30]等人實驗發(fā)現(xiàn)氯苯丙氨酸（PCPA）模型失眠大鼠腦內(nèi)5-HT合成障礙，會導(dǎo)致大腦皮質(zhì)中cAMP和PKAmRNA的表達(dá)變化，應(yīng)用酸棗仁湯后可對上述變化產(chǎn)生明顯的干預(yù)作用。李璟怡[31]等人運用慢性夾尾刺激和PCPA腹腔注射復(fù)合因子制造肝郁失眠模型大鼠發(fā)現(xiàn)，造模后模型組大鼠海馬的cAMP及PKA基因及蛋白表達(dá)均明顯降低，而運用了松郁安神方后可提高大鼠海馬的cAMP及PKA基因及蛋白的表達(dá)，發(fā)揮促睡眠作用。同時有實驗證明 PKA的靶標(biāo)CREB的突變也可增加小鼠的睡眠時間[32]。CREB是一種活性依賴性轉(zhuǎn)錄因子，對突觸可塑性和記憶存儲很重要。有證據(jù)表明CREB也可能在哺乳動物的睡眠/覺醒調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。皮質(zhì)中的磷酸化CREB水平在清醒時高于睡眠時，并且在一段時間的睡眠剝奪后升高[33-34]，這表明CREB對于維持清醒很重要。游秋云[35]等人采用改良多平臺水環(huán)境法建立自然老年24月齡Wistar大鼠快速動眼期（REM）睡眠剝奪模型，發(fā)現(xiàn)該模型組大鼠大腦PVN部位cAMP和p-CREB水平均明顯降低，PDE活性明顯增高，而運用酸棗仁湯后的大鼠下丘腦室旁核（PVN）部位cAMP和p-CREB水平均明顯提高，PDE活性明顯降低，提示酸棗仁湯能降低PDE的活性，激活cAMPPKA-CREB信號通路，增加cAMP和p-CREB在大腦下丘腦部位的表達(dá)，發(fā)揮安神健腦的作用。

2 cAMP/Epac

Epac是另一個重要的cAMP下游信號分子[36]。Epac有兩種同工型，Epac1和Epac2，它們充當(dāng)小GTP 酶效應(yīng)蛋白Rap1和Rap2的鳥嘌呤交換因子（GEF）[37-38]。Epac1 在全身表達(dá)，而 Epac2 主要在大腦、垂體、腎上腺和胰腺中表達(dá)[39-40]。有研究表明Epac 參與多種神經(jīng)元功能，包括神經(jīng)遞質(zhì)釋放[41]、神經(jīng)突生長和神經(jīng)元/膠質(zhì)細(xì)胞分化[42-43]，以及更高的認(rèn)知功能，例如記憶、學(xué)習(xí)和社交互動[44]。

SLB[45]等人采用改良多平臺水環(huán)境法建3個月大的雄性 Wistar大鼠睡眠剝奪模型，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)睡眠剝奪后對海馬或紋狀體的EPAC激活沒有影響。而酸棗仁湯治療失眠癥的療效確切，楊婷婷[21]等人為探討酸棗仁湯治療失眠的機制，灌服SPF級雄性成年大鼠不同濃度酸棗仁湯3天后進(jìn)行采血并離心制備其血清，研究其血清對NG2神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）及cAMP/Epac信號通路的影響，發(fā)現(xiàn)30%酸棗仁湯含藥血清組IL-1β，TNF-α，BDNF，cAMP和Epac mRNA的表達(dá)均顯著增加。表明酸棗仁湯可影響NG2細(xì)胞分泌IL-1β，TNF-α和BDNF睡眠相關(guān)的物質(zhì)及cAMP/Epac信號通路參與睡眠調(diào)節(jié)。

從上述兩個實驗可推測，雖然對于睡眠剝奪后的大鼠未發(fā)現(xiàn)對海馬體或紋狀體的EPAC激活的影響，但激活其cAMP/Epac通路而影響其睡眠可能成為治療失眠的機制之一。

TLR/NF-κB通路

Toll樣受體（TLR）是一類跨膜識別受體，在啟動先天性炎癥反應(yīng)和促進(jìn)適應(yīng)性免疫反應(yīng)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[46]。大多數(shù) TLR 通過稱為髓樣分化因子88（MyD88）的銜接蛋白發(fā)出信號，但TLR3和TLR4除外，TLR3通過含有TIR結(jié)構(gòu)域的銜接子誘導(dǎo)干擾素-β（TRIF）發(fā)出信號，TLR4通過兩者發(fā)出信號[47]。MyD88和TRIF途徑都通過激活核因子-κB（NF-κB）和其他轉(zhuǎn)錄因子引發(fā)轉(zhuǎn)錄改變[48]。NF-κB是產(chǎn)生I型干擾素和促炎細(xì)胞因子的主要驅(qū)動因素[49]，因此，TLR信號的啟動會觸發(fā)炎癥并激活先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)[50-52]。但是并非所有的TLR都在細(xì)胞表面表達(dá)。其中識別細(xì)菌和病毒核酸的TLR3、7和9定位于細(xì)胞內(nèi)膜，并在吞噬溶酶體或內(nèi)體中被激活[53]。有研究顯示[54]，成年健康男性25h的睡眠剝奪足以誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子 TNF-α及其R1受體及其介質(zhì)TLR-4的瞬時和可逆基因組表達(dá)。而且免疫反應(yīng)的激活會使免疫物質(zhì)通過復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮睡眠調(diào)節(jié)作用[55]。由此可看出，睡眠剝奪后會引起炎癥反應(yīng)，而炎性物質(zhì)又會影響睡眠，可見免疫反應(yīng)與睡眠是相互影響的。

劉珊等[56]運用PCPA腹腔注射制造睡眠剝奪大鼠模型檢測發(fā)現(xiàn)，睡眠剝奪后的大鼠其外周血NF-κB、TRIF、TNF-α、IL-1水平以及中縫背核TLR4、MyD88的表達(dá)明顯升高，而運用了天王補心丹懸濁液后上述指標(biāo)均明顯下降，并且經(jīng)過天王補心丹干預(yù)后大鼠睡眠潛伏期縮短，睡眠時間延長，由此可推測天王補心丹改善失眠的作用機制可能是通過抑制TLR4通路，減輕機體的炎癥反應(yīng)而實現(xiàn)的。

同時除了中藥方面影響TLR/NF-κB通路，中醫(yī)外治方面也同樣影響該通路，起到治療失眠的作用。郭尚函[57]等人實驗證實腹腔注射PCPA的失眠大鼠脾組織中TLR4信號通路被激活，其關(guān)鍵基因TLR4、NF-κB的mRNA表達(dá)水平升高1倍，經(jīng)耳穴貼壓治療后大鼠睡眠得到恢復(fù)，TLR4信號通路的關(guān)鍵基因表達(dá)水平均有不同程度的下降，提示睡眠剝奪會引起大鼠機體免疫反應(yīng)，耳穴貼壓可能是通過下調(diào)TLR4信號通路關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)水平，抑制炎癥反應(yīng)并間接改善機體睡眠的作用。何華香[58]、陳桂容[59]、張金媛[60]等人運用PCPA造模失眠大鼠，發(fā)現(xiàn)失眠會激活大鼠TLR/NF-κB信號傳導(dǎo)通路，引起炎癥反應(yīng)以及機體的免疫能力下降，經(jīng)電針干預(yù)后，大鼠失眠癥狀緩解，TLR/NF-κB通路相關(guān)基因表達(dá)受到了抑制，降低了炎癥反應(yīng)，其機體的免疫功能也可恢復(fù)至正常。

總結(jié)與展望

目前與失眠相關(guān)的信號通路研究較少，主要涉及的通路為p38 有絲分裂原活化蛋白激（p38MAPK）[61]、TLR/NF-κB、JAK/STAT、cAMP等。從上述文章中可以看出，失眠與機體免疫反應(yīng)關(guān)系較為密切，兩者可相互影響，其中JAK/STAT和TLR/NF-κB通路在機體的免疫反應(yīng)中占據(jù)著主導(dǎo)地位，而中藥及其中醫(yī)外治均可影響以上兩個通路起到調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和治療失眠的作用，但目前關(guān)于JAK/STAT和TLR/NF-κB通路的藥物研究甚少，大多數(shù)研究集中于中醫(yī)外治調(diào)控TLR通路，降低炎癥反應(yīng)，從而治療失眠，望后續(xù)的研究可多集中于藥物，為擴大我國傳統(tǒng)中藥治療失眠提供更多的理論依據(jù)。對于cAMP通路研究較多的下游通路在于cAMP-PKA-CREB，目前已有較多的研究證實了該通路可影響其睡眠，但目前關(guān)于中醫(yī)藥調(diào)節(jié)該通路治療失眠較多停留于cAMP-PKA通路，少數(shù)涉及至CREB轉(zhuǎn)錄因子，而CREB已被證實與睡眠具有一定的相關(guān)性，在后續(xù)的研究中可增多CREB轉(zhuǎn)錄因子相應(yīng)的研究。對于cAMP/Epac通路，雖然對于睡眠剝奪后的大鼠未發(fā)現(xiàn)對海馬體或紋狀體的EPAC激活的影響，但有研究證實含有酸棗仁湯的血清可影響NG2神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-1β，TNF-α和BDNF睡眠相關(guān)的物質(zhì)及cAMP/Epac信號通路參與睡眠調(diào)節(jié)，因此可推測激活其cAMP/Epac通路而影響其睡眠可能成為治療失眠的機制之一，目前對于調(diào)節(jié)該通路治療失眠只是個假設(shè)，希望今后有學(xué)者可證實這一假設(shè)是否成立。在上述的文章中我們可以看出酸棗仁湯可影響多個通路中基因的表達(dá)，也可證明中醫(yī)藥可調(diào)控多個信號通路治療失眠，但與睡眠相關(guān)的信號通路較為復(fù)雜又相互交錯，目前的研究均只是在初步階段，后續(xù)的研究中可先從單一的通路著手，深入研究，以明確各個通路在睡眠的關(guān)鍵作用，最后再將各個相關(guān)通路交錯整合在一起，形成完整的睡眠信號通路網(wǎng)絡(luò)，以便于后期藥物實驗的發(fā)展。