中華鱉生殖細(xì)胞對(duì)性腺分化的影響

王金霓 吳 俁 王子嘉 黃 安 樓靈媛 莊天依 孫 偉 錢國(guó)英 郭 銀 * 葛楚天 *

(1. 浙江萬里學(xué)院動(dòng)物性別與發(fā)育重點(diǎn)研究所, 寧波 315500; 2. 浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院, 寧波 315500;3. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306)

生殖細(xì)胞負(fù)責(zé)將父母的遺傳信息傳遞給下一代, 在有性繁殖的生物中必不可少。胚胎中的原始生殖細(xì)胞(Primordial germ cell, PGC)在性腺以外的地方產(chǎn)生, 經(jīng)歷增殖、遷移、最終定植于生殖嵴上,在性腺發(fā)育的過程中, 雌性性腺中的生殖細(xì)胞會(huì)大量增殖, 而雄性性腺中的生殖細(xì)胞進(jìn)入了有絲分裂靜止期[1]。

性腺主要由生殖細(xì)胞和體細(xì)胞組成, 其性別決定是個(gè)復(fù)雜的過程。在環(huán)境依賴型性別決定(Environmental-dependent sex determination, ESD)物種中, 性別決定受環(huán)境條件影響; 在基因型性別決定中(Genetic sex determination, GSD)物種中, 性別由受精時(shí)基因差異決定[2]。哺乳類、魚類、鳥類、兩棲類和爬行類動(dòng)物在性別決定后, 雌性性腺皮質(zhì)區(qū)高度發(fā)育, 髓質(zhì)區(qū)退化最終發(fā)育為卵巢; 雄性性腺皮質(zhì)區(qū)退化, 髓質(zhì)區(qū)發(fā)育最終發(fā)育為精巢。生殖細(xì)胞一般分布于雌性性腺的皮質(zhì)區(qū), 周圍由顆粒細(xì)胞環(huán)繞; 分布于雄性性腺的髓質(zhì)區(qū), 周圍由支持細(xì)胞環(huán)繞。生殖細(xì)胞周圍的體細(xì)胞能夠影響其分化和發(fā)育, 生殖細(xì)胞對(duì)于體細(xì)胞的作用以及對(duì)性別分化的影響因物種而異。在魚類中, 青鳉和斑馬魚在消除生殖細(xì)胞后, 后代出現(xiàn)全雄的現(xiàn)象[3,4]。在小鼠中, 將胚胎期的生殖細(xì)胞消除后, 未發(fā)生性別逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象[5]。在雞中消除原始生殖細(xì)胞后, 體細(xì)胞在沒有生殖細(xì)胞存在的情況下進(jìn)行正常的性分化[6]。在西班牙勒突螈中, 生殖細(xì)胞完全消除后, 性腺性別并未發(fā)生逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象[7]。爬行動(dòng)物在脊椎動(dòng)物進(jìn)化中處于承前啟后的關(guān)鍵地位, 其生殖細(xì)胞對(duì)于性別的影響尚未明晰。目前僅在溫度依賴型性別決定(Temperature-dependent sex determination, TSD)物種紅耳龜中發(fā)現(xiàn)消除生殖細(xì)胞后, 其性腺形態(tài)沒有明顯改變, 但是未對(duì)其性別進(jìn)行鑒別。

中華鱉存在微小性染色體(Z/W), 屬于GSD物種[8], 是我國(guó)名特優(yōu)水產(chǎn)養(yǎng)殖品種。中華鱉存在典型的雌雄性別二態(tài)性: 雄鱉比雌鱉的生長(zhǎng)速度快,個(gè)體大, 裙邊寬厚, 營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和價(jià)格更高, 因此開發(fā)全雄苗種是提升中華鱉現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要方面。目前, 中華鱉的性別決定機(jī)制尚未明確, 生殖細(xì)胞對(duì)于中華鱉性腺分化的影響研究未見報(bào)道。本研究通過白消安消除了中華鱉的生殖細(xì)胞, 利用組織學(xué)觀察、蛋白熒光免疫染色及基因的熒光定量分析鑒定了生殖細(xì)胞消除后其性腺性別。

1 材料與方法

1.1 中華鱉胚胎孵化

本實(shí)驗(yàn)所需的中華鱉受精卵均采自紹興大畈水產(chǎn)專業(yè)合作社。中華鱉受精卵的采集時(shí)間嚴(yán)格控制在中華鱉產(chǎn)卵后12h內(nèi), 孵化方式采用全裸無接觸式。將采集的中華鱉受精卵放置于孵化盤的定位孔中, 動(dòng)物極裸露于空氣中, 孵化箱的溫度保持在29.5—30℃, 濕度保持在80%—85%。中華鱉的采集時(shí)期按照中華鱉胚胎發(fā)育時(shí)期[9]進(jìn)行。

1.2 白消安處理

將白消安(Sigma, 美國(guó))溶解于DMSO中, 濃度分別為4、20和50 mg/kg。中華鱉胚胎發(fā)育至14期時(shí), 將其分為4組, 對(duì)照組(DMSO)、白消安4 mg/kg組(4Bu)、白消安20 mg/kg組(20Bu)、白消安50 mg/kg組(50Bu), 每組400枚約為5 g重量的中華鱉受精卵,往中華鱉受精卵中注射5 μL的各個(gè)濃度的白消安以及DMSO。ZW(注射DMSO的ZW胚胎)、ZW+4Bu(注射4 mg/kg白消安的ZW胚胎)、ZW+20Bu(注射20 mg/kg白消安的ZW胚胎)、ZW+50Bu(注射50 mg/kg白消安的ZW胚胎); ZZ(注射DMSO的ZZ胚胎)、ZZ+4Bu(注射4 mg/kg的白消安的ZZ胚胎)、ZZ+20Bu(注射20 mg/kg白消安的ZZ胚胎)、ZZ+50Bu(注射50 mg/kg白消安的ZZ胚胎), 以上是處理后的各個(gè)組別。在處理完成后, 置于相同環(huán)境下繼續(xù)孵化。

1.3 樣品收集

中華鱉胚胎孵化至18期、21期和25期時(shí), 收集各處理組胚胎的中腎性腺?gòu)?fù)合物(Gonad and mesonephros complex, GMC)于4%PFA中, 固定24h后用PBS清洗10min, 50%乙醇浸泡2h, 最后置于70%乙醇, 4℃保存。收集21期性腺于TRIzol (Thermo Fisher Scientific, 美國(guó))中, -80℃保存。

1.4 石蠟包埋切片和蘇木素&伊紅染色

70%乙醇保存的GMC樣品依次經(jīng)過乙醇濃度由低至高梯度脫水, 二甲苯透明, 石蠟包埋。連續(xù)切片厚度為6 μm, 收集石蠟切片在65℃烘箱中烘干, 經(jīng)過二甲苯脫蠟, 乙醇濃度由高至低梯度復(fù)水,蘇木素&伊紅(碧云天, 中國(guó))染色, 最后用普通光學(xué)顯微鏡(Nikon, 日本)觀察, 拍照。

1.5 免疫熒光染色

石蠟切片經(jīng)過二甲苯脫蠟、復(fù)水后, 置于檸檬酸鈉中, 96℃水浴, 抗原修復(fù)20min, 冷卻后用封閉液(10%驢血清, 3%牛血清白蛋白, 0.3% Triton X-100)孵育1h, 加入一抗, 兔抗VASA(1﹕250, Abcam,英國(guó)), 鼠抗β-catenin(1﹕500, Sigma, 美國(guó)), 兔抗SOX9(1﹕1000, Millipore, 美國(guó)), 羊抗(FOXL2, 1﹕300, Abcam, 英國(guó)), 鼠抗DMRT1(1﹕50, Millipore, 美國(guó)), 鼠抗CYP19A1(1﹕50, 杭州華安生物技術(shù)有限公司, 中國(guó)), 兔抗PCNA(1﹕400, Cell Signaling Technology,美國(guó)), 4℃過夜; 第2天用PBST清洗3次, 每次15min,避光加入二抗, Alexa Fluor 594驢抗兔IgG(1﹕500,Invitrogen, 美國(guó)), Alexa Fluor 594驢抗鼠IgG(1﹕500,Invitrogen, 美國(guó)), Alexa Fluor 488驢抗羊IgG(1﹕500,Invitrogen, 美國(guó)), Alexa Fluor 488驢抗鼠IgG(1﹕500,Invitrogen, 美國(guó))和DAPI(1﹕500, Sigma, 美國(guó)), 37℃孵育2h, 后用PBST清洗3次, 每次15min, PBS: 甘油(1﹕3)封片, 最后用激光共聚焦顯微鏡(Zeiss, 德國(guó))觀察, 拍照。

1.6 RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR

按照TRIzol試劑盒(Thermo Fisher Scientific, 美國(guó))方法提取RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Fisher Scientific, 美國(guó))步驟合成cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用的引物列于表1。以GAPDH為內(nèi)參, 使用比較閾值循環(huán)(Ct)方法[10]計(jì)算樣品中的相對(duì)mRNA水平。

表1 熒光定量PCR分析的基因及其引物序列Tab. 1 Genes and peimer sequence of Real-time PCR

1.7 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。數(shù)據(jù)分析利用軟件SPSS20.0的單因素方差分析(*P<0.05; **P<0.01;***P<0.001), 所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果

2.1 白消安處理后性腺內(nèi)生殖細(xì)胞變化

為了有效地消除中華鱉的生殖細(xì)胞, 我們?cè)O(shè)置了4個(gè)濃度的白消安(0、4、20和50 mg/kg)。在中華鱉胚胎期14期注射白消安, 18期至21期統(tǒng)計(jì)的死亡率分別為: 7.87%、8.52%、9.89%和59.6%。進(jìn)一步利用生殖細(xì)胞特異性抗體VASA蛋白進(jìn)行免疫熒光染色, 結(jié)果顯示: 在ZW中, 20Bu中VASA的熒光信號(hào)(紅色)顯著性地低于4Bu和DMSO(圖1); 同樣的, 在ZZ性腺中, 20Bu中VASA的熒光信號(hào)(紅色)顯著性地低于4Bu和DMSO(圖1)。因此本研究采用20 mg/kg白消安作為消減中華鱉生殖細(xì)胞的最終濃度。

圖1 白消安處理后性腺內(nèi)部的VASA染色情況Fig. 1 Immunofluorescence of VASA in internal gonad after busulfan-treatment

為了進(jìn)一步明確ZW或ZZ性腺中生殖細(xì)胞消除情況, 我們分別對(duì)發(fā)育至21期的胚胎性腺進(jìn)行橫向石蠟切片并對(duì)生殖細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光顯色, 隨后隨機(jī)選取4張切片進(jìn)行生殖細(xì)胞數(shù)量分析。結(jié)果顯示, 在ZW性腺中, 皮質(zhì)區(qū)有大量的VASA紅色信號(hào)(圖2A), ZW+20Bu中未見到VASA蛋白熒光信號(hào)(圖2B), 生殖細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)不到; 在ZZ性腺中, 髓質(zhì)區(qū)的性索中有大量的VASA紅色信號(hào)(圖2C), ZZ+20Bu中僅統(tǒng)計(jì)到1個(gè)VASA蛋白熒光信號(hào)(圖2D)。4張切片統(tǒng)計(jì)的生殖細(xì)胞數(shù)量顯示: 在20 mg/kg白消安處理后, ZW、ZZ中的平均生殖細(xì)胞數(shù)量不足1個(gè)(圖2E)。熒光定量PCR結(jié)果顯示: 20 mg/kg白消安處理后, ZW和ZZ性腺中生殖細(xì)胞特異性基因Ddx4(圖2F)和Dazl(圖2G)的mRNA表達(dá)量急劇降低。以上結(jié)果表明, 在中華鱉胚胎期20 mg/kg的白消安注射能夠有效地消除ZZ和ZW性腺中的生殖細(xì)胞。

圖2 白消安處理后, 性腺生殖細(xì)胞數(shù)量變化以及生殖細(xì)胞特異性基因表達(dá)的變化Fig. 2 The change of the number of germ cells and germ cell-specific genes expression after busulfan-treatment

2.2 生殖細(xì)胞消除后對(duì)性別分化的影響

通過組織形態(tài)學(xué)分析來研究生殖細(xì)胞消除對(duì)中華鱉性別分化的影響。組織形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn):ZZ+20Bu的性腺粗且短(圖3B), ZZ的形態(tài)也是粗且短(圖3A); ZW+20Bu的性腺長(zhǎng)且扁平(圖3D), ZW的性腺也呈現(xiàn)長(zhǎng)且扁平的狀態(tài)(圖3C), 說明性腺外部在形態(tài)上沒有逆轉(zhuǎn)的變化。同時(shí), 組織切片的蘇木素&伊紅染色顯示, ZZ的性腺成橢圓狀, 髓質(zhì)區(qū)的性索中存在生殖細(xì)胞, 支持細(xì)胞圍繞著生殖細(xì)胞生長(zhǎng)(圖3E), ZZ+20Bu性腺形態(tài)呈現(xiàn)橢圓狀, 性腺髓質(zhì)區(qū)的性索中不存在生殖細(xì)胞(圖3F), 整體形態(tài)呈現(xiàn)雄性狀態(tài); ZW性腺形態(tài)成傘狀, 皮質(zhì)區(qū)分布著大量的生殖細(xì)胞, 皮質(zhì)區(qū)較厚(圖3G), ZW+20Bu性腺呈現(xiàn)傘狀, 皮質(zhì)區(qū)的大量生殖細(xì)胞丟失, 皮質(zhì)區(qū)變薄(圖3H), 整體形態(tài)呈現(xiàn)雌性狀態(tài)。我們進(jìn)一步分析了性別特異性蛋白FOXL2、DMRT1的表達(dá)變化, 免疫熒光染色結(jié)果顯示, 在18期(圖4A)、21期(圖4E)和25期(圖4I)的ZW中, FOXL2信號(hào)集中在髓質(zhì)區(qū)大量表達(dá), 在18期(圖4B)、21期(圖4F)和25期(圖4J)的ZW+20Bu中, FOXL2信號(hào)也集中在髓質(zhì)區(qū)表達(dá), 且未見DMRT1蛋白的熒光信號(hào); 在18期(圖4C)、21期(圖4G)和25期(圖4K)的ZZ中, DMRT1信號(hào)集中在性索上的支持細(xì)胞中表達(dá), 在18期(圖4D)、21期(圖4H)和25期(圖4L)的ZZ+20Bu中,DMRT1信號(hào)集中在性索支持細(xì)胞上, 與ZZ的蛋白表達(dá)位置沒有區(qū)別, 且未見FOXL2的信號(hào)。同時(shí)我們還進(jìn)行了性別特異性基因Foxl2和Dmrt1的熒光定量分析, 熒光定量分析結(jié)果顯示, 在ZW中,Foxl2基因高表達(dá),Dmrt1基因表達(dá)量較低, ZW+20Bu中Foxl2基因的表達(dá)量上升,Dmrt1的表達(dá)量未發(fā)生變化。在ZZ中,Dmrt1基因高表達(dá),Foxl2基因表達(dá)量較低, ZZ+20Bu中Dmrt1基因表達(dá)量有上升趨勢(shì), 但不具有顯著性,Foxl2表達(dá)量升高, 但遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于ZW(圖5B和5D)。以上結(jié)果表明在生殖細(xì)胞減少后,中華鱉胚胎性腺的性別分化沒有發(fā)生逆轉(zhuǎn)。

圖3 生殖細(xì)胞消除后的組織形態(tài)學(xué)觀察以及性腺組織結(jié)構(gòu)的變化Fig. 3 Change of external and internal morphology of gonad after busulfan-treatment

圖4 生殖細(xì)胞消除后的性別特異性蛋白FOXL2和DMRT1的表達(dá)情況Fig. 4 The expression of sex-specific protein FOXL2 and DMRT1 after germ-cell-depletion

圖5 生殖細(xì)胞消除后的性別特異性基因的表達(dá)變化Fig. 5 Changes of sex-specific genes expression after busulfantreatment

2.3 生殖細(xì)胞減少后對(duì)體細(xì)胞的影響

為了研究生殖細(xì)胞減少后對(duì)體細(xì)胞的影響, 通過體細(xì)胞特異性蛋白CYP19A1和SOX9的免疫熒光染色來說明生殖細(xì)胞減少后對(duì)體細(xì)胞的影響。免疫熒光染色結(jié)果顯示, 在ZW中, 18期的CYP19A1的蛋白表達(dá)量不高(圖6A), 同樣在ZW+20Bu中, 18期的CYP19A1蛋白的表達(dá)量也很少(圖6B); 另外ZW+20Bu的21期(圖6F)、25期(圖6J)的CYP19 A1蛋白表達(dá)區(qū)域和ZW的21期(圖6E)、25期(圖6I)的表達(dá)區(qū)域一致, 均集中在髓質(zhì)區(qū)中大量表達(dá); ZZ+20Bu的各個(gè)時(shí)期SOX9蛋白表達(dá)區(qū)域(圖6D, 6H和6L)和ZZ(圖6C, 6G和6K)中的表達(dá)區(qū)域一致, 均集中在髓質(zhì)區(qū)支持細(xì)胞中表達(dá)。同時(shí), 特異性基因Cyp19a1和Sox9熒光定量分析結(jié)果顯示, 在ZW中,Cyp19a1基因大量表達(dá),Sox9表達(dá)量較低, ZW+20Bu中的Cyp19a1表達(dá)量升高,Sox9的表達(dá)量升高但遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于ZZ; ZZ+20Bu的Sox9大量表達(dá),Cyp19a1表達(dá)量較低,Sox9表達(dá)量有上升趨勢(shì), 但不具有顯著性,Cyp19a1的表達(dá)量沒變化(圖5A和5C)。以上結(jié)果表明, 生殖細(xì)胞減少后對(duì)體細(xì)胞未產(chǎn)生影響。

圖6 生殖細(xì)胞消除后的體細(xì)胞中表達(dá)的蛋白CYP19A1和SOX9的表達(dá)情況Fig. 6 The expression of sex-specific protein CYP19A1 and SOX9 after germ-cell-depletion

3 討論

本研究首次利用白消安處理胚胎期的中華鱉,有效地消除了中華鱉性腺中的生殖細(xì)胞, 獲得了中華鱉生殖細(xì)胞消除模型。隨后分析了生殖細(xì)胞消除后性別和體細(xì)胞變化, 發(fā)現(xiàn)消除中華鱉的生殖細(xì)胞后, 其性腺形態(tài)未發(fā)生明顯改變, 利用性別特異性蛋白和標(biāo)記基因分析顯示其性別未發(fā)生明顯改變。我們的研究表明: 消除中華鱉生殖細(xì)胞后對(duì)其性腺的形態(tài)及性別沒有顯著性影響, 同時(shí)也表明在爬行動(dòng)物中, 生殖細(xì)胞在性別分化過程中沒有決定性作用。

白消安作用于分裂期的細(xì)胞, 可使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和核酸被烷基化[11], 其細(xì)胞毒性可造成生物的不育性[12], 被廣泛應(yīng)用于脊椎動(dòng)物中生殖細(xì)胞的消除, 成體及胚胎期小鼠[13]、胚胎期鵝[14]、成體黃姑魚[15]和胚胎期紅耳龜[16]中都曾應(yīng)用過。除此之外,消除生殖細(xì)胞可以通過敲低生殖細(xì)胞特異性基因,如通過敲低青鳉的Cxcr4基因得到了生殖細(xì)胞消除的青鳉個(gè)體[17]; 敲除斑馬魚的Dnd基因后, 其原始生殖細(xì)胞被消除[18]。

生殖細(xì)胞在脊椎動(dòng)物性別分化中的作用因物種而異。斑馬魚的生殖細(xì)胞的數(shù)量與性別分化存在相關(guān)性, 所有早期斑馬魚幼體性腺中都會(huì)有一定數(shù)量的卵母細(xì)胞存在, 在后續(xù)的發(fā)育過程中, 雌性的卵母細(xì)胞正常發(fā)育, 在雄性中出現(xiàn)生殖細(xì)胞凋亡現(xiàn)象[19], 而在斑馬魚幼體發(fā)育的第一天將所有生殖細(xì)胞消除會(huì)導(dǎo)致全雄性發(fā)育[18]; 青鳉的生殖細(xì)胞在消除后, XX的雌性青鳉往雄性方向發(fā)展, 外形結(jié)構(gòu)呈雄性, 支持細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)Dmrt1和Foxl2[20]。而雞和小鼠的生殖細(xì)胞在消除后, 雌雄性腺的組織學(xué)形態(tài)未發(fā)生改變, 性別沒有發(fā)生逆轉(zhuǎn), 在爬行動(dòng)物中, DiNapoli和Capel[16]僅對(duì)消除生殖細(xì)胞后的紅耳龜性腺形態(tài)進(jìn)行了觀察, 而對(duì)生殖細(xì)胞在爬行動(dòng)物性別分化中的作用未做深入研究。本研究在性腺形態(tài)、基因表達(dá)和蛋白表達(dá)上發(fā)現(xiàn)消除生殖細(xì)胞后中華鱉雌雄性別未發(fā)生變化; 在白消安處理導(dǎo)致生殖細(xì)胞減少后, ZW、ZZ性腺的形態(tài)學(xué)未發(fā)生變化, 性別特異性蛋白表達(dá)的區(qū)域未發(fā)生變化。此結(jié)果與在小鼠、雞和西班牙勒突螈中一致。在XX小鼠中, 生殖細(xì)胞消除后顆粒細(xì)胞沒有發(fā)生轉(zhuǎn)分化的現(xiàn)象[13]。西班牙勒突螈的胚胎中, ZW性腺在白消安處理導(dǎo)致生殖細(xì)胞消除后保持明顯的卵巢特征:明顯的空腔及Cyp19a1高表達(dá); 生殖細(xì)胞消除后ZZ性腺的Cyp19a1表達(dá)量仍舊是低表達(dá), 說明生殖細(xì)胞的減少?zèng)]有影響性腺分化[7]。在雞中, 去除早期雞胚中的新月區(qū)導(dǎo)致生殖細(xì)胞減少, 組織形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)處理組的睪丸及處理組卵巢的性腺形態(tài)發(fā)育均與對(duì)照組結(jié)果一致, 說明雞中生殖細(xì)胞的減少?zèng)]有導(dǎo)致性別的逆轉(zhuǎn)[6]; 在紅耳龜中, 胚胎期生殖細(xì)胞減少后, 卵巢皮質(zhì)區(qū)高度發(fā)育, 髓質(zhì)區(qū)退化, 而睪丸髓質(zhì)區(qū)高度發(fā)育, 皮質(zhì)區(qū)退化, 結(jié)果說明在紅耳龜中生殖細(xì)胞的減少并未造成性別的逆轉(zhuǎn)[16]。以上結(jié)果說明, 在性腺發(fā)育的過程中, 生殖細(xì)胞的消除不影響性腺的分化。然而, 有研究報(bào)道不同階段的生殖細(xì)胞可以影響不同發(fā)育階段的性別分化,在小鼠中, 當(dāng)XY胚胎中存在減數(shù)分裂的生殖細(xì)胞時(shí), 內(nèi)皮細(xì)胞遷移和睪丸索的形成被破壞[13]; 在小鼠出生后卵母細(xì)胞因輻射而丟失后, 發(fā)現(xiàn)后續(xù)卵泡細(xì)胞在增殖和分化中向雄性支持細(xì)胞方向發(fā)展[13];當(dāng)XX的體細(xì)胞和XY體細(xì)胞重組時(shí)發(fā)現(xiàn)睪丸索的結(jié)構(gòu)正常生成, 但當(dāng)XX的生殖細(xì)胞和XY的體細(xì)胞重組時(shí)發(fā)現(xiàn)睪丸索的結(jié)構(gòu)被破壞[21], 這說明處于減數(shù)分裂時(shí)生殖細(xì)胞能夠抑制睪丸通路進(jìn)而促進(jìn)卵巢的發(fā)育。在中華鱉中, 減數(shù)分裂標(biāo)記基因Stra8在18期開始在雌性中高表達(dá), 而此時(shí)胚胎也進(jìn)入了性別分化階段, 因此, 減數(shù)分裂后的生殖細(xì)胞是否在中華鱉甚至爬行動(dòng)物的性別分化中發(fā)揮作用有待進(jìn)一步闡明。所以本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 在中華鱉減數(shù)分裂前, 消除生殖細(xì)胞不會(huì)影響其性腺性別的分化。白消安的處理對(duì)中華鱉胚胎的整體發(fā)育的影響是非常值得關(guān)注的, 白消安的安全劑量因物種而異, 我們的實(shí)驗(yàn)也設(shè)計(jì)了幾個(gè)不同濃度用來確定實(shí)驗(yàn)的最佳濃度。在20 mg/kg的濃度處理下, 出現(xiàn)了整體GMC大小處理組小于對(duì)照組的現(xiàn)象, 但整個(gè)形態(tài)沒有發(fā)生變化。此結(jié)果與紅耳龜和牙鲆中類似: 白消安處理胚胎期的紅耳龜后, 處理組中的胚胎比對(duì)照組中的要小, 但處理組的四肢和內(nèi)臟和對(duì)照組的未發(fā)現(xiàn)明顯差異[16]; 成體牙鲆經(jīng)過白消安處理后,睪丸和卵巢都縮小, 但整體的形態(tài)并沒有發(fā)生改變[22]。這說明合適濃度的白消安并不會(huì)影響胚胎的整體發(fā)育, 也不會(huì)影響組織的形態(tài)發(fā)育。

在大鼠中, 白消安處理后生殖細(xì)胞數(shù)量減少,睪丸中的支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少, 支持細(xì)胞的直徑變小, 但間質(zhì)細(xì)胞的直徑?jīng)]變化, 睪丸的直徑也未發(fā)生改變, 黃體生成素和促卵泡激素的水平升高, 睪酮的水平降低[23]。在紅耳龜中, 白消安處理導(dǎo)致生殖細(xì)胞減少后, 雄性胚胎中支持細(xì)胞的數(shù)量變多, 雌性中的顆粒細(xì)胞的數(shù)量未發(fā)生明顯變化[16]。在本研究中, 利用白消安消除中華鱉生殖細(xì)胞后,CYP19A1和SOX9在雌雄中的表達(dá)區(qū)域未發(fā)生改變。但Cyp19a1和Foxl2表達(dá)量在白消安處理后顯著性升高。隨后進(jìn)行了增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen, PCNA)的染色, 在25期時(shí),ZW+20Bu中的髓質(zhì)區(qū)的CYP19A1和PCNA信號(hào)集中在一個(gè)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(圖7B), 這結(jié)果和ZW中的一致(圖7A), 另外還進(jìn)行了FOXL2和CYP19A1的共定位染色, 免疫熒光染色顯示: 在25期時(shí), FOXL2和CYP19A1的蛋白在ZW和ZW+20Bu中都定位在了同一細(xì)胞中(圖7C和圖7D)。此結(jié)果說明在性腺中, 體細(xì)胞并沒有發(fā)生異常的增殖。因此, 我們認(rèn)為Foxl2和Cyp19a1表達(dá)量升高是由于生殖細(xì)胞數(shù)量的減少導(dǎo)致皮質(zhì)區(qū)和髓質(zhì)區(qū)區(qū)域的細(xì)胞比例發(fā)生較大的變化引起的。

圖7 生殖細(xì)胞消除后PCNA和CYP19A1共染觀察細(xì)胞增殖的變化以及FOXL2和CYP19A1的蛋白表達(dá)共定位情況Fig. 7 Immunofluorescence of PCNA and CYP19A1 to observe the change of proliferation after germ-cell-depletion and immunofluorescence of FOXL2 and CYP19A1 to observe the expression distribution

生殖細(xì)胞消除的模型主要應(yīng)用于生殖細(xì)胞的移植。在小鼠中, 生殖細(xì)胞消除模型主要應(yīng)用于精原干細(xì)胞的移植使精子重生[24]; 在魚類中, 消除受體的內(nèi)源性生殖細(xì)胞可以顯著提高外源生殖細(xì)胞的移植效率, 更高效率地達(dá)到“胚胎移植”的目的[15]。對(duì)于中華鱉的生殖細(xì)胞消除模型建立, 后續(xù)可以實(shí)現(xiàn)移植體外成熟的生殖細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)“轉(zhuǎn)基因中華鱉”。在本實(shí)驗(yàn)中, 應(yīng)用白消安處理中華鱉成功地獲得了中華鱉生殖細(xì)胞消除的模型, 得出了胚胎期中華鱉減數(shù)分裂前的生殖細(xì)胞消除不會(huì)影響性腺性別分化的結(jié)論。