紅耳龜Amh基因在溫度依賴型性別決定中的功能

陳佳文 孫 偉 金 琳 惠航博 雷建東 胡佳暄 王宗吉 葛楚天

(1. 浙江萬里學(xué)院動物性別與發(fā)育重點研究所, 寧波 315100; 2. 浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院, 寧波 315100)

在一些缺少性染色體的爬行動物(如紅耳龜Trachemys scripta)中, 子代的性別由胚胎發(fā)育過程中外界的環(huán)境溫度決定, 這種性別決定方式被稱作溫度依賴型性別決定(Temperature-dependent sex determination, TSD)[1—5]。與哺乳類、鳥類等動物的遺傳型性別決定(Genetic sex determination, GSD)不同, TSD的調(diào)控機制更為復(fù)雜, 且研究較為滯后。最近TSD機制研究獲重大突破, 揭示了紅耳龜性別決定的上游調(diào)控通路——“溫度-Ca2+-pSTAT3-表觀因子Kdm6b”[6,7]。盡管TSD和GSD這兩種性別決定方式的上游調(diào)控機制顯著不同, 但對TSD動物性腺進行轉(zhuǎn)錄組測序及基因表達分析表明,Amh、Dmrt1、Sox9、Foxl2和Cyp19a1等與GSD動物性別決定和性腺分化緊密關(guān)聯(lián)的調(diào)控基因同樣存在于TSD系統(tǒng)中, 并且在胚胎性腺中呈現(xiàn)性別二態(tài)性表達分布[8—10], 這提示這些基因在TSD動物的性別分化通路中很可能仍然扮演著關(guān)鍵的調(diào)控角色。因此, 通過功能鑒定實驗驗證這些保守存在的基因在TSD中的具體功能, 成為解析TSD分子機理的一個突破口。

Amh(Anti-Müllerian Hormone), 抗繆勒氏管激素, 是轉(zhuǎn)化生長因子β(The transforming growth factor beta, TGF-β)超家族的成員之一。在脊椎動物中,Amh基因因其在雄性性別決定/性別分化中的廣泛作用而受到關(guān)注。目前, 從魚類至哺乳類等不同進化地位的物種中都發(fā)現(xiàn)了Amh基因[11—15], 該基因是通過與受體AmhrII結(jié)合形成受體聚合物, 從而激活下游靶基因[16,17]。在哺乳動物中,Amh是由雄性胚胎性腺的sertoli細(xì)胞分泌, 負(fù)責(zé)誘導(dǎo)雄性繆勒氏管的退化, 而在雌性胚胎的發(fā)育過程中未檢測到Amh表達, 繆勒氏管分化成輸卵管等雌性特有結(jié)構(gòu)[16,18,19]。在雞的胚胎性腺中,Amh基因呈現(xiàn)雌雄二態(tài)性表達分布(雄性高表達), 能夠誘導(dǎo)雄雞兩個繆勒氏管的退化[20]。在兩棲動物(如日本粗皮蛙)中,Amh基因在性別分化階段的雄性睪丸中高度表達[14,21]。與高等脊椎動物不同, 大多數(shù)硬骨魚缺少繆勒氏管, 它們以更多樣化的方式表達Amh, 但在不同發(fā)育階段的兩性性腺中同樣能夠檢測到該基因的性別二態(tài)性表達[22—25]。值得關(guān)注的是在一些魚類中,Amhy和Amhr2基因被認(rèn)為是雄性性別決定的主控基因, 其缺失會導(dǎo)致性反轉(zhuǎn)[26—33]。在爬行動物上, 課題組先前通過表達分析以及功能缺失和獲得研究, 明確了Amh為GSD動物中華鱉早期雄性性別分化必需且充分的上游調(diào)控基因[34]。與GSD動物Amh的研究深度相比, 該基因在TSD中的相關(guān)報道主要集中在克隆和表達分析上, 尚未涉及功能研究。在美洲短吻鱷和紅耳龜中, 研究發(fā)現(xiàn)在性腺的性別分化開始前,Amh的表達已經(jīng)呈現(xiàn)性別二態(tài)性(MPT性腺高表達)[13,35], 提示該基因可能同樣參與TSD過程, 但缺乏直接的功能鑒定數(shù)據(jù)來證明。

為了明確Amh基因在TSD系統(tǒng)中的生物學(xué)功能, 本研究以TSD典型物種紅耳龜為實驗對象, 在分析Amh在胚胎性腺中的表達模式和細(xì)胞定位的基礎(chǔ)上, 采用慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾和過表達技術(shù), 揭示了Amh在TSD中必需的關(guān)鍵調(diào)控角色, 為解析TSD分子調(diào)控級聯(lián)網(wǎng)絡(luò)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 胚胎孵化及組織收集

實驗所需紅耳龜受精卵采自養(yǎng)殖場, 將龜卵埋入孵化介質(zhì)蛭石中后, 置于恒溫恒濕孵化箱中進行孵化。孵化箱溫度設(shè)置為26℃(產(chǎn)雄溫度)或32℃(產(chǎn)雌溫度), 利用霧化加濕器控制濕度(濕度: 75%—85%)。待胚胎孵育至第14期時, 分別將100枚龜卵從26℃或32℃移至32℃或26℃后繼續(xù)孵化, 進行溫度置換實驗。在孵化過程中, 根據(jù)各時期紅耳龜胚胎特征[36], 鑒別并收集特定發(fā)育時間點的胚胎, 用于分離性腺或性腺-中腎復(fù)合體。

1.2 Amh慢病毒干擾載體的構(gòu)建及龜胚侵染

針對紅耳龜Amh基因的CDS(Coding sequence)序列, 設(shè)計特異性shRNA序列, 構(gòu)建Amh干擾的慢病毒載體(LV-U6-Amh-shRNA), 該載體攜帶綠色熒光蛋白GFP編碼序列作為報告基因。由上海吉瑪公司生產(chǎn)高滴度病毒濃縮液(×109units/mL)。紅耳龜受精卵在以上恒溫恒濕環(huán)境下孵化至第14期時,利用微量進樣器向MPT胚胎注入5 μLAmh-shRNA慢病毒液, 實驗中, 在26℃和32℃孵化溫度下分別設(shè)置空白載體對照組(LV-NC-shRNA)。處理組及對照組注射龜卵各500枚。收集第21、第25期胚胎,分離性腺(每組60對性腺: 20對為1個重復(fù), 3個生物學(xué)重復(fù))和性腺-中腎復(fù)合體分別用于RNA提取和組織切片染色。

1.3 Amh慢病毒過表達載體的構(gòu)建及龜胚侵染

根據(jù)紅耳龜AmhORF(Open Reading Frame)序列, 設(shè)計構(gòu)建過表達Amh的慢病毒載體(LV-EF1a-Amh-overexpression(OE)), 并生產(chǎn)高滴度的病毒濃縮液(×109units/mL, 上海吉瑪公司)。使用上述注射方法對第14期FPT胚胎進行Amh-OE慢病毒液侵染處理, 實驗中分別在32℃和26℃孵化溫度下設(shè)空白載體對照組(LV-empty), 每組處理500枚龜卵。組織采集及用途同上。

1.4 RNA提取和實時熒光定量PCR

利用TRIzol試劑(Invitrogen, 美國)提取胚胎性腺中的總RNA, 按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(K1622, Thermo Scientific, 美國)的操作說明, 合成cDNA, 用于基因mRNA水平的表達分析。以合成的cDNA為模板,按如下比例配制25 μL PCR反應(yīng)體系: SYBR?Premix (來源于SYBR?Premix ExTaqTMⅡ試劑, TaKaRa)12.5 μL, 上下游引物各 0.5 μL, cDNA 2 μL, dH2O 9.5 μL。設(shè)置以下參數(shù)在ABI 7500 Real-time PCR儀(Appiled Biosystems, 美國)進行PCR反應(yīng): 預(yù)變性95℃, 30s; 變性95℃, 5s; 退火58℃, 20s; 共40個cycles。每個實驗至少3個生物學(xué)重復(fù)(n≥3), 并設(shè)空白對照, 內(nèi)參基因為Gapdh, 目的基因的相對表達量利用2-??Ct方法計算。所得數(shù)據(jù)均表示為均值±SD,使用SPSS軟件進行單因素方差分析及Duncan氏多重比較,P值<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義(*P<0.05;**P<0.01; ***P<0.001)。所用引物序列信息見表1。

1.5 石蠟切片和蘇木素-伊紅染色

利用4%多聚甲醛保存剛分離的性腺-中腎復(fù)合體組織, 根據(jù)組織塊大小于4℃下固定約24h后, 用50%酒精置換固定液, 2h后置于70%酒精中進行組織包埋或長期保存。將待包埋組織先后經(jīng)70%、80%、90%、95%和100%的梯度酒精進行逐級脫水處理, 二甲苯透明后, 進行石蠟包埋。待石蠟冷卻凝固后進行連續(xù)切片, 厚度設(shè)置5—6 μm。將烘干后的切片置于二甲苯中完全脫蠟后, 依次置于濃度由高到低的梯度酒精中進行水分滲透, 后經(jīng)蘇木素和伊紅先后染色, 封片后于Nikon正置顯微鏡下觀察拍照。

1.6 免疫組織化學(xué)染色

將完全脫蠟后的切片樣品依次浸入由高到低的梯度酒精中后, 使用抗原修復(fù)液(10 mmol/L檸檬酸鈉溶液)進行樣品修復(fù), 95℃以上維持30min。待切片冷卻至室溫, 滴加足量封閉液于組織上, 室溫下孵育1h。吸去封閉液, 滴加適量一抗稀釋液于組織上, 4℃過夜。次日, 用洗脫液清洗3次, 每次至少10min。在室溫避光環(huán)境下, 針對一抗物種來源滴加適量的熒光二抗和DAPI染液, 孵育2h后, 清洗3次, 每次至少10min。洗脫干凈后加抗熒光淬滅劑封片, 于共聚焦熒光顯微鏡(Nikon, A1 Plus)下觀察拍照。本實驗所用的一抗信息如下: 兔抗AMH(1﹕200, 華安生物制備)、鼠抗CTNNB1(1﹕250,Sigma, 美國)、兔抗VASA (1﹕500, Abcam, 英國)、兔抗SOX9(1﹕500, Millipore, 美國)、羊抗FOXL2(1﹕500, 華安生物制備)和鼠抗AROMATASE(1﹕250, 華安生物制備); 對應(yīng)的二抗信息如下: 驢抗兔IgG594(1﹕250, Invitrogen)、驢抗鼠IgG488(1﹕250,Invitrogen)、驢抗羊IgG488(1﹕250, Invitrogen)。

2 結(jié)果

2.1 Amh基因的溫度依賴型表達模式

為了解析Amh在紅耳龜TSD中的調(diào)控作用, 本研究首先分析了Amh基因在早期胚胎性腺中的表達規(guī)律。qRT-PCR結(jié)果顯示, 在性腺分化啟動前的第15期時,Amh在產(chǎn)雄溫度(MPT)性腺中的表達量顯著高于產(chǎn)雌溫度(FPT)性腺。隨著胚胎發(fā)育,Amh在MPT性腺中的表達量逐步增加, 且在性別決定及隨后的性別分化關(guān)鍵時期始終呈現(xiàn)MPT性腺特異性高表達(圖1A)。同時, AMH蛋白的免疫熒光染色結(jié)果顯示, 在性腺分化之前的第15—19期MPT性腺中, AMH蛋白表達信號逐漸增強, 定位在體細(xì)胞中, 而在FPT性腺中始終未檢測到明顯的熒光信號。紅耳龜性腺發(fā)育至第21期時, 雌雄性腺結(jié)構(gòu)差異分化明顯。此時, AMH蛋白大量分布在MPT性腺性索上的sertoli前體細(xì)胞中, 生殖細(xì)胞未見表達(圖1B)。此外, qRT-PCR結(jié)果顯示在成體(1齡)雌雄紅耳龜?shù)牟煌M織中,Amh在睪丸組織中高度表達, 顯著高于卵巢、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉和小腸中的表達量(圖2A); 免疫熒光染色亦證實AMH蛋白在卵巢中幾乎不表達, 在睪丸中主要分布于曲細(xì)精管基部的sertoli細(xì)胞上(圖2B)。

圖2 Amh在紅耳龜成體組織中的表達分布Fig. 2 Expression distribution of Amh in adult tissues of T. scripta

為了進一步驗證Amh基因這種溫度依賴型表達模式, 本研究在第14期時進行了溫度置換實驗,觀察Amh表達是否發(fā)生變化以及變化速率。qRTPCR結(jié)果顯示, 與MPT性腺相比, MPT→FPT性腺中Amh的表達量在第15期時就已急劇下調(diào)(圖1C), 說明Amh能夠迅速響應(yīng)新的FPT孵化溫度。相反地,FPT→MPT置換后,Amh的表達則迅速上調(diào)(圖1D)。以上結(jié)果表明,Amh的表達方式屬于溫度依賴型,且能夠快速響應(yīng)溫度的變化, 提示Amh基因可能與TSD早期雄性分化高度關(guān)聯(lián)。

2.2 Amh基因的功能缺失研究

為了進一步確定Amh在TSD中的調(diào)控角色, 本研究利用實驗室先前在紅耳龜上建立的基因功能在體鑒定技術(shù)[37], 向第14期MPT胚胎注射了攜帶LV-Amh-shRNA干擾片段的慢病毒液, 開展了Amh基因的功能缺失研究。首先, 通過qRT-PCR檢測了Amh-RNAi處理后MPT性腺中Amh的表達變化, 結(jié)果顯示在注射后的第15期,Amh的表達就已明顯受到抑制, 這種表達下降趨勢在第16期更為顯著(圖3A),表明此慢病毒載體系統(tǒng)能夠高效敲低MPT性腺中Amh基因的表達量。

圖3 慢病毒表達載體的有效性分析Fig. 3 Effectiveness analysis of lentivirus expression vectors

而后, 本研究通過觀察性腺外形和內(nèi)部結(jié)構(gòu)以及生殖細(xì)胞的分布情況對敲低Amh基因后的MPT性腺進行了性逆轉(zhuǎn)分析。第25期MPT(雄性)性腺外形呈粗短狀(圖4A); 而FPT(雌性)性腺則相對細(xì)長扁平(圖4C)。敲低Amh后的MPT胚胎性腺外形與雌性性腺類似, 明顯變得細(xì)長(圖4B)。HE染色顯示, MPT性腺的皮質(zhì)區(qū)嚴(yán)重退化, 形成單細(xì)胞層, 髓質(zhì)區(qū)高度發(fā)育, 其間布滿由sertoli細(xì)胞圍繞生殖細(xì)胞形成的原始性索結(jié)構(gòu)(圖4D和4D’); 而FPT性腺皮質(zhì)區(qū)高度發(fā)育, 分布有大量生殖細(xì)胞, 髓質(zhì)區(qū)退化明顯, 形成空腔(圖4F和4F’)。敲低Amh后的MPT性腺內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化, 主要體現(xiàn)在皮質(zhì)區(qū)發(fā)育變厚, 有大量生殖細(xì)胞出現(xiàn), 而在髓質(zhì)區(qū)未見性索, 此時性腺出現(xiàn)雄性向雌性完全性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象(圖4E和4E’)。生殖細(xì)胞特異性VASA蛋白的免疫熒光染色進一步顯示, 生殖細(xì)胞主要分布于MPT性腺髓質(zhì)區(qū)性索上和FPT性腺的皮質(zhì)區(qū)內(nèi)(圖4G—G”、4I—I”), 而在Amh敲低后MPT胚胎性腺中, 生殖細(xì)胞呈現(xiàn)完全類雌性的皮質(zhì)區(qū)分布模式(圖4H—H”), 進一步證明了性逆轉(zhuǎn)的發(fā)生。

圖4 敲低Amh后胚胎性腺的形態(tài)組織學(xué)變化Fig. 4 The morphological changes of embryonic gonads after Amh knockdown

為了進一步驗證雄轉(zhuǎn)雌性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象的發(fā)生, 本研究還分析了Amh敲低對雄性分化因子Sox9及雌性分化因子Foxl2和Cyp19a1表達及分布的影響。qRT-PCR結(jié)果顯示, 在第21期MPT性腺中,Sox9mRNA大量表達,Foxl2和Cyp19a1mRNA表達較低;而在FPT性腺中,Sox9僅微弱表達,Foxl2和Cyp19a1高度表達。在敲低Amh后, MPT性腺中Sox9基因的表達量出現(xiàn)顯著下調(diào), 而Foxl2和Cyp19a1基因的表達量則明顯上調(diào)(圖5A)。同時, 本研究通過免疫熒光染色檢測了Amh基因敲低后第25期胚胎性腺中SOX9、FOXL2和CYP19A1(Aromatase, AROM)蛋白的分布情況(圖5B)。結(jié)果顯示在MPT性腺中,SOX9蛋白在髓質(zhì)區(qū)性索上的sertoli細(xì)胞核中豐富表達, 未見FOXL2和AROM的表達; 而在FPT性腺中, FOXL2和AROM蛋白高度表達, 分別定位于性腺體細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中, 并未檢測到SOX9蛋白的熒光信號。MPT性腺經(jīng)過Amh基因敲低后, SOX9蛋白表達量急劇下調(diào), 幾乎檢測不到其表達信號, FOXL2和AROM蛋白則被誘導(dǎo)出現(xiàn)表達(圖5B)。

圖5 敲低Amh后雌雄特異性基因和蛋白的表達分布變化及性逆轉(zhuǎn)率Fig. 5 The expression and distribution changes of male- and female-specific genes and proteins after Amh knockdown and sex reversal rate

通過以上性腺組織學(xué)和分子、蛋白水平的研究證明, 敲低Amh基因確實能夠?qū)е录t耳龜MPT性腺向雌性逆轉(zhuǎn)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果顯示, 對照組MPT胚胎100%(36/36)發(fā)育為雄性, 對照組FPT胚胎100%(35/35)分化為雌性, 而在LV-Amh-shRNA處理后的MPT胚胎中, 92.86%(26/28)逆轉(zhuǎn)為雌性, 性逆轉(zhuǎn)率極高(圖5C)。

2.3 Amh基因的功能獲得研究

以上功能缺失實驗表明,Amh在紅耳龜早期雄性性腺形成中是必需的關(guān)鍵基因, 其缺失會導(dǎo)致徹底的雄性向雌性性逆轉(zhuǎn)。相反地, 為了確定Amh基因能否單獨啟動紅耳龜早期雄性分化過程, 本研究向第14期FPT胚胎注射了攜帶LV-Amh-OE過表達片段的慢病毒液, 開展了Amh基因的功能獲得研究。在注射后的第15期, FPT性腺中Amh表達明顯上升, 至16期時表達水平甚至超過了對照組MPT性腺(圖3)。

基于Amh過表達FPT胚胎模型的成功建立, 本研究同樣通過觀察性腺表型以及檢測雌雄特異性基因和蛋白的表達分布變化, 從而判斷性腺原先的雌性分化方向是否被阻斷而轉(zhuǎn)向雄性分化。結(jié)果顯示,Amh過表達后的第25期FPT性腺變得粗短, 向雄性方向發(fā)育(圖6B和6C); 大部分過表達Amh后的FPT性腺內(nèi)部結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了顯著變化, 髓質(zhì)區(qū)分化出雄性性索結(jié)構(gòu), 同時檢測到大量VASA蛋白表達信號, 此時性腺具有典型的雄性特征, 性逆轉(zhuǎn)徹底(圖6G、6G’和6K—K’’); 但在一部分性腺的髓質(zhì)區(qū), 盡管也存在少量性索, 但皮質(zhì)區(qū)并未完全退化,且生殖細(xì)胞在皮質(zhì)區(qū)和髓質(zhì)區(qū)均有分布, 性逆轉(zhuǎn)不徹底, 此時性腺成為卵睪丸(圖6F、F’和6J—J’’)。分子水平的研究結(jié)果顯示Amh過表達后, 第21期FPT性腺中的Sox9mRNA表達上升,Foxl2和Cyp19a1mRNA表達下降(圖7A); 在Amh過表達后的FPT性腺中, SOX9蛋白被誘導(dǎo)大量表達, 甚至與對照組MPT性腺中的表達量相當(dāng), 而FOXL2和AROM蛋白表達量則顯著下降, 在性逆轉(zhuǎn)徹底的性腺中未見這兩個蛋白的表達信號, 而在性逆轉(zhuǎn)不徹底的卵睪丸中, 同時檢測到了SOX9、FOXL2和AROM這三種蛋白的熒光信號, 但始終SOX9表達水平更高(圖7B)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示, 在LV-Amh-OE處理后的FPT胚胎中,66.67%(26/39)向雄性分化(圖7C)。以上功能獲得實驗表明, 過表達Amh基因能夠充分激活紅耳龜早期雄性分化通路。

圖6 過表達Amh后胚胎性腺的形態(tài)組織學(xué)變化Fig. 6 The morphological changes of embryonic gonads after Amh overexpression

圖7 過表達Amh后雌雄特異性基因和蛋白的表達分布變化及性逆轉(zhuǎn)率Fig. 7 The expression and distribution changes of male- and female-specific genes and proteins after Amh overexpression and sex reversal rate

3 討論

溫度依賴型性別決定(TSD)自發(fā)現(xiàn)至今, 挖掘能夠調(diào)控二態(tài)性(未分化)性腺向睪丸或卵巢分化的關(guān)鍵因子, 尤其是那些位于性別決定通路上游的調(diào)控基因, 一直是解析TSD分子機理的關(guān)鍵科學(xué)問題之一。越來越多的研究提示, 在TSD系統(tǒng)中可能存在與GSD類似的分子調(diào)控通路。聚焦GSD關(guān)鍵調(diào)控基因在TSD中的功能研究, 已成為破譯上述科學(xué)問題的一個突破口。

本研究以脊椎動物雄性分化高度關(guān)聯(lián)基因Amh為切入點, 以TSD動物紅耳龜為實驗對象, 成體(1齡)組織表達分布結(jié)果顯示在被檢組織中, 該基因僅在睪丸中高度表達, 提示Amh基因在紅耳龜后期睪丸發(fā)育過程中可能仍發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。Amh這種睪丸特異性高表達特征在GSD動物中華鱉中同樣存在[38]。而在青鳉中,Amh基因僅呈現(xiàn)性腺(精巢和卵巢)組織特異性表達, 且在性別決定和分化階段, 該基因自出現(xiàn)表達后始終在兩性性腺中均存在豐富表達[15]。本研究發(fā)現(xiàn),Amh基因在紅耳龜胚胎早期就已在MPT性腺中高表達, 且這種雄性特異性分布貫穿了性別決定和性腺分化的關(guān)鍵時期; 此外, 當(dāng)孵化溫度由FPT置換為MPT時,Amh迅速上調(diào)表達量, 強烈提示Amh基因與紅耳龜TSD雄性分化高度關(guān)聯(lián)。類似地, 在另一個TSD爬行動物美洲短吻鱷中, 同樣觀察到了Amh這種溫度依賴型表達模式(MPT性腺高表達)[13]。在人類、雞、中華鱉、熱帶爪蟾及一些魚類等GSD動物胚胎的不同發(fā)育階段(性別決定和/或性別分化), 也分別檢測到了Amh基因的性別二態(tài)性表達[18,20,26,27,34,39]。以上研究結(jié)果表明, 在不同進化地位和不同性別決定方式物種的性腺發(fā)育過程中,Amh基因的表達特征有所不同。

迄今,Amh基因在性別決定和性別分化中的功能鑒定研究主要集中在GSD動物上, 而在TSD系統(tǒng)中尚未見相關(guān)報道。為了明確Amh基因在TSD中的具體作用, 本研究在性別分化啟動前將LV-AmhshRNA和LV-Amh-OE載體系統(tǒng)通過龜卵注射技術(shù)分別引入產(chǎn)雄溫度(MPT)和產(chǎn)雌溫度(FPT)下的紅耳龜胚胎中, 成功獲得了Amh敲低的MPT龜胚和Amh過表達的FPT龜胚模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 敲低Amh后的MPT性腺外形及內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)明顯雌性化, 生殖細(xì)胞呈現(xiàn)類雌性性腺的皮質(zhì)區(qū)分布模式, 出現(xiàn)了雄性向雌性完全性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象; 相反地, 過表達Amh后的FPT性腺則轉(zhuǎn)向雄性方向分化。以上正反功能驗證實驗表明,Amh基因在紅耳龜雄性性腺形成過程中是必需的, 且能夠充分啟動早期睪丸分化過程。在兩種硬骨魚(銀漢魚和尼羅羅非魚)中, 通過敲低位于雄性性染色體(Y)上的Amhy基因證明了該基因在雄性決定和分化中是必需的, 被確定為這兩個物種雄性性別決定的主控基因[26,27]。而研究發(fā)現(xiàn)小鼠的初級性別決定和睪丸發(fā)育并不需要Amh,但Amh通路的突變會導(dǎo)致雄性性別發(fā)育障礙[40,41];敲低雞ZZ胚胎中的Amh后, 性腺的性別分化方向并沒有發(fā)生改變[42]。在同屬龜鱉目的GSD動物中華鱉上, 本團隊前期通過相同的基因操縱方法同樣驗證了Amh在早期雄性分化中必要且充分的調(diào)控角色。此外, 本研究發(fā)現(xiàn)過表達Amh能顯著上調(diào)Sox9的表達量, 同時抑制了Cyp19a1和Foxl2的表達, 提示在紅耳龜雄性分化通路中Amh基因位于Sox9上游。在雞和美洲短吻鱷中,Amh的表達早于Sox9,可能作用于Sox9上游[13,43]。而在哺乳動物中,Amh則位于Sox9下游,Sox9通過激活A(yù)mh表達, 誘導(dǎo)繆勒氏管退化, 同時抑制了Cyp19a1表達[44]。本團隊之前研究發(fā)現(xiàn), 過表達紅耳龜Dmrt1后Amh基因表達上升, 提示Amh位于Dmrt1下游[37]。在中華鱉中, 同樣發(fā)現(xiàn)Amh作用于Sox9上游, 且受到Dmrt1調(diào)控[34,45]。因此, 與Amh在一些魚類中扮演性別決定基因的角色不同, 該基因在紅耳龜中并不是性別決定和分化最上游的啟動因子, 而是受到外界溫度及生物體內(nèi)一系列調(diào)控因子直接或間接的影響, 通過被動改變轉(zhuǎn)錄水平從而參與性別分化過程。與GSD動物中華鱉相似, 雄性分化級聯(lián)通路“Dmrt1-Amh-Sox9”在紅耳龜TSD系統(tǒng)中可能同樣存在, 盡管它們最上游的調(diào)控者顯然不同。上述研究表明, 在脊椎動物雄性分化分子調(diào)控通路上,Amh在不同進化地位動物中的具體作用和調(diào)控位置是不同的, 而在具有不同性別決定方式的龜鱉動物中, 該基因可能高度保守。

綜上所述, 本研究利用團隊前期在龜鱉動物上建立的基因功能鑒定技術(shù), 首次對TSD體系中Amh的調(diào)控作用進行了功能驗證。研究發(fā)現(xiàn)了Amh在紅耳龜性別決定和分化的關(guān)鍵時期呈現(xiàn)雄性特異性高表達, 且能夠快速響應(yīng)溫度變化; 明確了Amh基因是紅耳龜早期雄性分化的必需且充分的調(diào)控因子, 位于TSD雄性發(fā)育級聯(lián)通路的上游位置。為了徹底解釋TSD的調(diào)控機制, 我們下一步關(guān)注重點是溫度如何將信號傳入胚胎, 即TSD機制研究的核心問題——溫度感受機制, 進而轉(zhuǎn)化為生物信號啟動雌雄分化的?