可逆性腎動(dòng)脈狹窄大鼠模型的建立與評(píng)估

周 爽 ，李學(xué)東*，付鴻江，孔宣柱

（1.承德醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，河北 承德 067000；2.泰達(dá)國(guó)際心血管病醫(yī)院血管外科，天津 300457）

腎血管性高血壓（renovascular hypertension, RVH）通常是由腎動(dòng)脈閉塞或腎動(dòng)脈狹窄（renal artery stenosis,RAS）而引起腎臟灌注壓下降，激活腎素 - 血管緊張素 - 醛固酮系統(tǒng)（RAAS），最終導(dǎo)致血壓升高。RAS 引起的RVH 是繼發(fā)性高血壓最常見(jiàn)的病因，其中動(dòng)脈粥樣硬化性腎動(dòng)脈狹窄（atherosclerotic renal artery stenosis,ARAS）是引起RAS 最主要的病因，約占RAS 患者的80%[1-2]。兩腎一夾腎性高血壓大鼠（2K1C-RHR）模型是研究腎血管性高血壓最常見(jiàn)的動(dòng)物模型之一，最初有研究應(yīng)用不同尺寸的銀夾縮窄狗的腎動(dòng)脈進(jìn)行模型的制作，從而為RVH 產(chǎn)生的機(jī)制及對(duì)其他器官影響的研究奠定了基礎(chǔ)[3-4]。然而，由于傳統(tǒng)的銀夾材質(zhì)軟，易變形，內(nèi)徑容易發(fā)生改變，且容易脫落，往往會(huì)造成模型的成功率下降。基于此，本研究使用食品級(jí)硅膠管縮窄腎動(dòng)脈，既可保證RAS 程度一致，又可以避免RAS 的材料脫落，從而提高模型重建成功率。在2K1C-RHR 大鼠模型建立成功后，還需恢復(fù)狹窄的腎動(dòng)脈，以滿足腎動(dòng)脈血運(yùn)可以復(fù)通的條件，本研究模擬臨床中的腎動(dòng)脈血運(yùn)重建的過(guò)程，并探究模型的可逆性，為今后研究降壓藥與支架置入術(shù)對(duì)大鼠血壓的影響奠定基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物55 只體質(zhì)量為250~300 g 的健康Sprague Dawley（SD）雄性大鼠，SPF 級(jí)，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2017-0005，飼養(yǎng)于天津市濱海新區(qū)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案均符合泰達(dá)國(guó)際心血管病醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定與條例。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將大鼠置于帶有墊料的鼠籠，并置于專門(mén)飼養(yǎng)大鼠的屏障中，自由進(jìn)食、飲水，室溫保持在25 ℃左右，對(duì)大鼠進(jìn)行至少1 周的適應(yīng)性喂養(yǎng)。將50 只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為狹窄3 d組（10 只）、狹窄5 d 組（10 只）、狹窄7 d 組（10 只）、狹窄14 d 組（10 只）和狹窄21 d 組（10 只），將另5 只同類大鼠作為假手術(shù)組。除了假手術(shù)組外，其他統(tǒng)稱為模型組。術(shù)前3 d 所有大鼠均灌胃阿司匹林腸溶片（石家莊康力藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H13024364，規(guī)格：25 mg/片），劑量為9 mg/kg 體質(zhì)量，1 次/d，連續(xù)使用3 d。

1.2.2 模型構(gòu)建及解除腎動(dòng)脈狹窄方法 術(shù)前禁食12 h后，使用裝有異氟烷（天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司，獸藥字020037015，規(guī)格：100 mL/瓶）的小動(dòng)物麻醉機(jī)（天津德鴻盛生物科技有限公司，型號(hào)：DHS-MS-3）對(duì)大鼠進(jìn)行吸入麻醉。將大鼠置于37 ℃的恒溫加熱墊上，固定四肢，剃除腹部毛發(fā)，碘伏消毒術(shù)區(qū)皮膚。于肋弓下腹正中線外側(cè)偏左0.5~1 cm 處作一長(zhǎng)2~3 cm 的切口縱行切開(kāi)，用組織剪將肌肉剪開(kāi)相應(yīng)大小的開(kāi)口，充分暴露腹腔后，用紗布將左側(cè)的結(jié)腸和小腸推至右側(cè)顯露左側(cè)腎臟，將左側(cè)腎動(dòng)脈與腎靜脈分離，管徑較細(xì)的為腎動(dòng)脈，粗的為腎靜脈，如圖1-A 所示。在靠近主動(dòng)脈處的腎動(dòng)脈上套入內(nèi)徑為0.30 mm，厚約1 mm 的食品級(jí)硅膠管，如圖1-B 所示。手術(shù)結(jié)束后，取出腹腔內(nèi)的紗布，處理干凈滲液，仔細(xì)檢查腹腔內(nèi)無(wú)出血和腸管損傷后，恢復(fù)腸管的生理位置，然后用5-0 絲線依次間斷縫合關(guān)閉腹膜、肌肉及皮膚。假手術(shù)組的大鼠除了沒(méi)有進(jìn)行腎動(dòng)脈縮窄外，其他操作均與模型組相同。術(shù)后繼續(xù)灌胃使用阿司匹林至解除狹窄的前1 天，劑量同術(shù)前。模型組的大鼠分別于術(shù)后3、5、7、14、21 d 時(shí)拆除軟管，均再次打開(kāi)腹腔，仔細(xì)分離腎動(dòng)脈周?chē)M織并取出置入的硅膠管，其中狹窄7 d 組大鼠取出硅膠管后腎動(dòng)脈如圖1-C 所示。各模型組大鼠取出硅膠管后，仔細(xì)檢查腹腔內(nèi)無(wú)出血和腸管損傷后，恢復(fù)腸管的生理位置，然后用5-0 絲線依次間斷縫合關(guān)閉腹膜、肌肉及皮膚，術(shù)后觀察1 h，然后單獨(dú)飼養(yǎng)，允許自由進(jìn)食和飲水。每次手術(shù)結(jié)束后，各大鼠均肌肉注射頭孢呋辛鈉（深圳信立泰藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20000410，規(guī)格：0.75 g/支），劑量為0.2 g/kg 體質(zhì)量，3 次/d，連續(xù)使用3 d。

圖1 模型構(gòu)建及解除腎動(dòng)脈狹窄示意圖

1.2.3 血壓測(cè)量方法 清醒狀態(tài)下的大鼠，在腎動(dòng)脈狹窄模型建立前、解除腎動(dòng)脈狹窄前、解除腎動(dòng)脈狹窄后分別用小動(dòng)物無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量?jī)x（北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司，型號(hào)：ZS-BPIV）測(cè)量收縮壓（SBP）。測(cè)量前，將保溫桶調(diào)節(jié)至適當(dāng)溫度，并誘導(dǎo)大鼠進(jìn)入溫度適宜且具有黑暗環(huán)境的保溫桶中，用鼠袋裹住保溫筒，將測(cè)壓氣囊置于鼠尾根部，待其安靜至少10 min 再進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量3 次SBP，取平均值。

1.3 觀察指標(biāo)①比較假手術(shù)組和模型組大鼠腎動(dòng)脈狹窄前后SBP 差值（ΔSBP）。②比較假手術(shù)組和模型組大鼠解除腎動(dòng)脈狹窄前后ΔSBP。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料經(jīng)S-W 法檢驗(yàn)均符合正態(tài)分布且方差齊，以(±s)表示，兩組間比較行t檢驗(yàn)，多組間比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 假手術(shù)組與模型組大鼠腎動(dòng)脈狹窄前后ΔSBP 比較狹窄3 d 組和狹窄14 d 組的大鼠在狹窄術(shù)后各死亡1 只，狹窄21 d 組大鼠解除狹窄后死亡2 只。與狹窄前比，解除狹窄前模型組各組大鼠SBP 均顯著升高，且狹窄14 d 前隨著狹窄時(shí)間的延長(zhǎng)，SBP 升高越明顯，狹窄14 d 后SBP 升高緩慢，狹窄14 d 組狹窄前后ΔSBP 顯著高于其他各組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表1、圖2。

表1 假手術(shù)組與模型組大鼠狹窄前后SBP 及ΔSBP 比較(mmHg，±s)

表1 假手術(shù)組與模型組大鼠狹窄前后SBP 及ΔSBP 比較(mmHg，±s)

注：與狹窄前SBP 值比，*P＜0.05；與狹窄3 d 組比，#P＜0.05；與狹窄5 d 組比，△P＜0.05；與狹窄7 d 組比，▲P＜0.05。SBP：收縮壓。1 mmHg=0.133 kPa。

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圖2 假手術(shù)組與模型組大鼠狹窄前后ΔSBP

2.2 假手術(shù)組與模型組大鼠解除狹窄前后ΔSBP 比較與解除狹窄前比，解除狹窄后模型組各組大鼠SBP均顯著下降；與狹窄3 d 組比，狹窄5 d 組、狹窄7 d 組大鼠的ΔSBP 均顯著升高；狹窄7 d 組大鼠ΔSBP 顯著高于狹窄21 d 大鼠，且狹窄21 d 組低于狹窄5 d 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)圖3、表2。

表2 假手術(shù)組與模型組大鼠解除狹窄前后ΔSBP 比較(mmHg，±s)

表2 假手術(shù)組與模型組大鼠解除狹窄前后ΔSBP 比較(mmHg，±s)

注：與解除狹窄前SBP 值比，□P＜0.05；與狹窄3 d 組比，#P＜0.05；與狹窄5 d 組比，△P＜0.05；與狹窄7 d 組比，▲P＜0.05。

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3 討論

雖然2K1C-RHR 大鼠模型已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各項(xiàng)研究中，但有文獻(xiàn)報(bào)道，用血管夾制作的2K1C-RHR 大鼠和小鼠的模型成功率低[5-6]，其原因是各種材質(zhì)的血管夾均存在一定的缺陷。制作2K1C-RHR 大鼠模型的銀夾，銀是最早應(yīng)用于2K1C-RHR 大鼠模型的材料[7]，由于銀的延展性好，易于變形，操作過(guò)程中會(huì)由于術(shù)者的力度不均，導(dǎo)致RAS 的程度不能保持一致，結(jié)果將會(huì)導(dǎo)致得到的大鼠SBP值不準(zhǔn)確。如果狹窄程度輕，則血壓上升緩慢，甚至血壓可能不會(huì)發(fā)生明顯改變；如果變形嚴(yán)重，將會(huì)導(dǎo)致其在動(dòng)物體內(nèi)極易滑脫，導(dǎo)致模型的失敗率增高。戴勇等[8]用絲線和針灸針縮窄腎動(dòng)脈，將針灸針與腎動(dòng)脈平行放置，用絲線將兩者系在一起，然后撤出針灸針，造成腎動(dòng)脈狹窄。理論上針灸針去除后能夠留出部分空隙，使腎動(dòng)脈縮窄為理想直徑，實(shí)際上，絲線結(jié)扎的力度無(wú)法保持一致，結(jié)扎力度大，狹窄程度大，結(jié)扎力度小，狹窄程度??；另一方面，動(dòng)脈管壁具有較大彈性，即使撤除針灸針，管壁也無(wú)法恢復(fù)到理想狀態(tài)，若結(jié)扎過(guò)緊會(huì)導(dǎo)致腎動(dòng)脈閉塞。絲線的表面是粗糙的，使用絲線結(jié)扎腎動(dòng)脈會(huì)損壞血管壁，易形成血栓，有可能導(dǎo)致腎動(dòng)脈完全閉塞，模型失敗率增大。用鈦夾和針頭縮窄腎動(dòng)脈同樣存在弊端，當(dāng)針頭與腎動(dòng)脈并行放置時(shí)，由于鈦夾呈V 形，使用鈦夾將腎動(dòng)脈和針頭一起夾住時(shí)，夾子會(huì)留有一定的空隙，腎動(dòng)脈也許會(huì)滑到空隙中，并不能確保腎動(dòng)脈被均勻的縮窄成理想中的程度[9-10]；用鈦夾制作2K1C-RHR 大鼠模型，會(huì)損傷血管壁，破壞管壁彈性，導(dǎo)致腎動(dòng)脈無(wú)法順利地恢復(fù)血運(yùn)。

綜合以上模型的不足，本研究最終決定采用一種內(nèi)壁光滑的圓形內(nèi)徑材料，可以均勻地收縮腎動(dòng)脈，而且不會(huì)對(duì)腎動(dòng)脈管壁造成傷害，受操作者手法的影響小。本研究采用內(nèi)徑為0.30 mm 的食品級(jí)硅膠管收縮腎動(dòng)脈，大鼠SBP升高明顯。結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，在狹窄3 d 時(shí)SBP 開(kāi)始升高，并且在狹窄14 d 左右達(dá)到高峰，事實(shí)證明此方法可以在相對(duì)短時(shí)間內(nèi)成功制作RVH 模型。根據(jù)研究結(jié)果可知，SBP不會(huì)隨著狹窄時(shí)間的延長(zhǎng)無(wú)限增高，本實(shí)驗(yàn)?zāi)I動(dòng)脈只有一側(cè)狹窄，考慮另一側(cè)健康的腎臟會(huì)起到代償?shù)淖饔茫蚨I動(dòng)脈狹窄到一定時(shí)間時(shí)，SBP 不會(huì)再繼續(xù)明顯升高，反而會(huì)有輕度下降的趨勢(shì)，但基本不會(huì)下降到正常范圍，腎動(dòng)脈狹窄程度不同，大鼠SBP 升高程度也不同。

拆除硅膠管后，肉眼可見(jiàn)腎動(dòng)脈管腔內(nèi)有血流通過(guò)，動(dòng)脈搏動(dòng)和管壁彈性仍然存在。選擇肉眼觀察有一定局限性，因此本研究仍然通過(guò)血壓變化判斷腎動(dòng)脈血運(yùn)是否恢復(fù)。由本研究表2 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，拆除硅膠管后，即腎動(dòng)脈狹窄解除之后，大鼠SBP 下降。使用硅膠管縮窄腎動(dòng)脈，不僅可以使血壓升高，對(duì)腎動(dòng)脈管壁不會(huì)造成明顯的損傷，而且還可以使狹窄后的腎動(dòng)脈恢復(fù)正常血運(yùn)。此外，狹窄7 d 內(nèi)SBP 均容易恢復(fù)，而狹窄14 d 及21 d 組的SBP 很難恢復(fù)到術(shù)前的水平，說(shuō)明狹窄時(shí)間越長(zhǎng)，大鼠的SBP 越不容易恢復(fù)。因此RAS 后應(yīng)該盡早干預(yù)，不應(yīng)該單純將狹窄程度作為手術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。

綜上，對(duì)于2K1C-RHR 模型大鼠，在狹窄7 d 內(nèi)解除RAS 其SBP 容易恢復(fù)，狹窄時(shí)間越長(zhǎng)，大鼠的SBP 越不容易恢復(fù)，因此建立可逆性腎動(dòng)脈狹窄大鼠模型是可行的，此模型的建立為今后探索最佳腎動(dòng)脈血運(yùn)重建的時(shí)機(jī)奠定了基礎(chǔ)。本研究不足之處是無(wú)法真正模擬臨床中RAS 形成的過(guò)程，在RAS 的病因中最常見(jiàn)的ARAS 形成是一個(gè)緩慢的過(guò)程，今后的實(shí)驗(yàn)中我們擬使用一種可以緩慢膨脹的材料，使大鼠的腎動(dòng)脈呈一種緩慢狹窄的狀態(tài)。