淫羊藿素對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞CAL-27增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響

曹華嬌, 傅玲玲, 馮紅超,

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院, 貴州 貴陽(yáng), 550001;2. 貴州省貴陽(yáng)市口腔醫(yī)院 口腔頜面外科, 貴州 貴陽(yáng), 550002)

舌鱗狀細(xì)胞癌(TSCC)簡(jiǎn)稱舌鱗癌,是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)生率占口腔鱗癌的50%～60%[1]。舌體淋巴引流豐富且舌運(yùn)動(dòng)頻繁,舌鱗癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較高,患者的5年存活率較低[2-4]。舌鱗癌的主要治療方法是多模式治療,目前中草藥治療的相關(guān)研究仍在持續(xù)進(jìn)行中。淫羊藿抗腫瘤作用較為廣泛[5-6], 研究[7-9]表明,其主要成分淫羊藿素、脫水淫羊藿素也具有抗舌鱗癌作用。作者查閱文獻(xiàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn),淫羊藿素與脫水淫羊藿素的分子式及分子名稱存在一定爭(zhēng)議,有研究[10-11]認(rèn)為淫羊藿素對(duì)應(yīng)分子式為C21H22O7, 水解脫去一分子H2O后變?yōu)槊撍蜣剿?對(duì)應(yīng)分子式為C21H20O6; 也有研究[12]認(rèn)為,淫羊藿素分子式為C21H20O6; 還有研究[13]認(rèn)為,脫水淫羊藿素分子式為C21H20O6。本研究基于查閱文獻(xiàn)及分子對(duì)接結(jié)果選取分子式為C21H22O7的淫羊藿素進(jìn)行實(shí)驗(yàn),擬通過(guò)分子對(duì)接揭示淫羊藿素抗舌鱗癌的藥效及可能的作用機(jī)制,以期為治療人舌鱗癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源

人口腔鱗癌細(xì)胞系CAL-27來(lái)自貴州醫(yī)科大學(xué)頭頸鱗癌生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑與儀器

淫羊藿素(C21H22O7, CAS: 521-45-9; CAT. NO. II0330, 北京索萊寶科技有限公司); 胎牛血清、雙抗(青霉素10 000 U/mL, 鏈霉素10 mg/mL, 以色列BI); 基質(zhì)膠(貨號(hào)0827045, 上海諾娃醫(yī)藥科技有限公司); Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(CAT. No: KGA107, Lot. No. 20220407, 南京凱基生物科技有限公司); Navios流式細(xì)胞儀購(gòu)(美國(guó)Beckman); 超微量分光光度計(jì)(型號(hào)NanoDrop 2000, 美國(guó)Thermo)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng): 將人口腔鱗癌細(xì)胞系CAL-27培養(yǎng)于高糖DMEM培養(yǎng)基中,在培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清, 100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素,放入37 ℃恒溫和CO2濃度為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每2～3 d換1次液,每5 d傳1次代,細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度為80%～90%時(shí),用磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕漂洗2次, 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化5 min, 鏡下觀察細(xì)胞變圓后,用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止消化,將細(xì)胞輕輕吹打成單細(xì)胞懸液,轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中,以1 000轉(zhuǎn)/min離心5 min, 去掉上清液后重懸計(jì)數(shù),根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整成需要的細(xì)胞密度。

1.3.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力: 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人舌鱗癌細(xì)胞CAL-27以每孔3 000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中,設(shè)置實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組,每組5個(gè)復(fù)孔。待24 h后細(xì)胞貼壁、細(xì)胞狀態(tài)良好,加入淫羊藿素,淫羊藿素的終濃度分別為 0(對(duì)照組)、10、20、40 μmol/L(實(shí)驗(yàn)組),繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h后,每孔加入10 μL CCK8溶液,酶標(biāo)儀測(cè)試450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值,并計(jì)算細(xì)胞的抑制率,抑制率(%)=(對(duì)照孔吸光度-實(shí)驗(yàn)孔吸光度)/(對(duì)照孔吸光度-空白孔吸光度)×100%。

1.3.3 光鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察: 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CAL-27單細(xì)胞懸液,以每孔50 000個(gè)細(xì)胞的密度接種至6孔板中,加入培養(yǎng)液, 24 h后加入淫羊藿素,終濃度分別為0、10、20、40 μmol/L, 繼續(xù)培養(yǎng)48 h后于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn): 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CAL-27單細(xì)胞懸液,以每孔500個(gè)細(xì)胞的密度接種至65 mm培養(yǎng)皿中,加入完全培養(yǎng)基至3 mL, “十”字輕輕晃動(dòng)使細(xì)胞分散均勻。將培養(yǎng)皿放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周,每3 d更換1次培養(yǎng)基,至單個(gè)細(xì)胞集落細(xì)胞數(shù)量≥50個(gè)時(shí)終止培養(yǎng)。PBS輕柔清洗2次后,使用4%多聚甲醛固定15 min, 0.4%結(jié)晶紫染色15 min, 雙蒸水清洗2次后干燥,拍照,計(jì)數(shù)。

1.3.5 劃痕實(shí)驗(yàn): 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的CAL-27細(xì)胞以每孔3×106個(gè)細(xì)胞的密度接種至6孔板中,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,待細(xì)胞匯合度達(dá)100%, 用100 μL移液槍槍頭垂直底部橫線劃直線,形成一段寬度約3 mm的無(wú)細(xì)胞空白區(qū)域, PBS洗去劃落的細(xì)胞,分別加入淫羊藿素終濃度為0、10、20、40 μmol/L的不含血清的DMEM培養(yǎng)基。選取劃痕區(qū)域均勻一致的位置做好標(biāo)記并拍照,繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36 h后選取同一區(qū)段進(jìn)行觀察及拍照,最后用Image J軟件分析藥物作用后劃痕愈合情況。

1.3.6 Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn): 8～11 mg/mL基質(zhì)膠解凍分裝后用冷的不含胎牛血清完全培養(yǎng)基以1∶8比例稀釋。侵襲實(shí)驗(yàn)需提前取100 μL稀釋好的基質(zhì)膠置于24孔板Transwell上室內(nèi),置于培養(yǎng)箱中孵育2 h。將密度為每孔1×104個(gè)細(xì)胞的CAL-27接種于上室,在下室內(nèi)放入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基600 μL, 培養(yǎng)24 h后加入淫羊藿素,繼續(xù)48 h后取出培養(yǎng)板,用棉簽輕輕擦去小室內(nèi)的基質(zhì)膠, PBS漂洗3次后,將小室依次置于多聚甲醛及結(jié)晶紫中15 min, PBS漂洗3次,干燥后于顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行拍照及計(jì)數(shù)。

1.3.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CAL-27細(xì)胞凋亡情況: 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CAL-27單細(xì)胞懸液,以每孔3×105個(gè)細(xì)胞的密度接種至6孔板中,藥物干預(yù)48 h, 消化完成后,將上清液、PBS漂洗液和細(xì)胞懸液收集至同一個(gè)離心管中,以1 000轉(zhuǎn)/min離心5 min,計(jì)數(shù),取5×105個(gè)細(xì)胞, PBS洗滌2遍,棄上清液,加入500 μL結(jié)合緩沖液混勻,再依次加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL PI混合,避光孵育15 min后,采用流式細(xì)胞儀上樣檢測(cè),用FlowJo 10.6.2軟件分析計(jì)算CAL-27細(xì)胞凋亡率。

1.3.8 分子對(duì)接預(yù)測(cè)藥物作用效果: 根據(jù)課題組淫羊藿抗舌鱗癌的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析,淫羊藿抗舌鱗癌可能主要與AR、ESR1、PRKACA、PTGS2共4個(gè)靶基因相關(guān)。因此,本實(shí)驗(yàn)在RSCB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)查詢并下載AR、ESR1、PRKACA、PTGS2的3D結(jié)構(gòu); TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中下載淫羊藿素分子結(jié)構(gòu)MOL文件; 在Discovery Studio (2019) 軟件中對(duì)淫羊藿素與4個(gè)靶基因大分子進(jìn)行化學(xué)結(jié)合能的計(jì)算及半柔性對(duì)接。

1.3.9 逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測(cè): 以GAPDH作為內(nèi)參,相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。提取細(xì)胞樣本總RNA, 逆轉(zhuǎn)錄cDNA, 利用qPCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中ESR1、PTGS2、PRKACA、AR基因表達(dá)情況。為了減少誤差,所有檢測(cè)樣本均做3個(gè)平行復(fù)孔,檢測(cè)完成后,取3個(gè)平行復(fù)孔的平均值作為該樣本的最終檢測(cè)數(shù)值。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR 檢測(cè)所用引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 CCK-8檢測(cè)不同濃度淫羊藿素對(duì)CAL-27細(xì)胞增殖的抑制作用

處理24、48 h的細(xì)胞存活率均隨淫羊藿素劑量增加而降低(P< 0.001), 見圖1A; 在同一時(shí)點(diǎn),與0 μmol/L 淫羊藿素相比, 10、20、40 μmol/L淫羊藿素細(xì)胞存活率降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001); 同一濃度下,與處理24 h比較, 48 h的細(xì)胞存活率降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。淫羊藿素對(duì)CAL-27細(xì)胞作用24 h的半數(shù)抑制濃度(IC50)為33.37 μmol/L, 48 h IC50為15.57 μmol/L, 見圖1B。

A: CAL-27細(xì)胞存活率隨淫羊藿素濃度變化柱形圖; B: CAL-27抑制率隨淫羊藿素濃度變化折線圖。與0 μmol/L濃度比較, ***P<0.001; 兩者比較, ###P<0.001。圖1 淫羊藿素作用于CAL-27 24、48 h后的變化

2.2 光鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn),不同濃度淫羊藿素干預(yù)48 h后, CAL-27細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制,且對(duì)形態(tài)學(xué)影響較為明顯,見圖2。

A: 放大倍數(shù)為100倍,比例尺為100 μm; B: 放大倍數(shù)為200倍,比例尺為50 μm。圖2 CAL-27細(xì)胞經(jīng)淫羊藿素干預(yù)48 h后形態(tài)學(xué)變化

0 μmol/L濃度的細(xì)胞貼壁伸展,稍呈梭形,偽足較長(zhǎng); 經(jīng)淫羊藿素影響后,細(xì)胞逐漸皺縮,偽足變短,形態(tài)不規(guī)則,隨著藥物濃度的升高,形態(tài)變化越來(lái)越明顯,在40 μmol/L濃度時(shí)最為明顯,細(xì)胞稍呈圓形。

2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

不同濃度淫羊藿素處理CAL-27后,細(xì)胞增殖受到顯著抑制,形成的單克隆集落大小呈逐漸變小趨勢(shì),見圖3A。與0 μmol/L組比較,淫羊藿素濃度為20 μmol/L時(shí)細(xì)胞集落減少,當(dāng)淫羊藿素濃度為40 μmol/L時(shí)幾乎不存在細(xì)胞集落,見圖3B?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)顯示, 10 μmol/L濃度的克隆形成率為(79.20±5.74)%, 低于0 μmol/L組的(101.00±2.26)%, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與0 μmol/L組克隆形成率比較, 20 μmol/L濃度的克隆形成率(64.73±5.98)%和40 μmol/L濃度的克隆形成率(27.33±7.69)%均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001), 見圖3C。

A: 淫羊藿素處理48 h后, CAL-27單克隆集落形態(tài)觀察,比例尺為100 μm; B: 淫羊藿素處理48 h后, CAL-27的克隆形成。C: 淫羊藿素處理48 h后,各組克隆形成率。兩者比較, *P<0.05, ***P<0.001。圖3 CAL-27的克隆形成實(shí)驗(yàn)

2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)

CAL-27經(jīng)過(guò)不同濃度的淫羊藿素分別作用12、24、36 h后,細(xì)胞水平向內(nèi)遷移,見圖4A。隨著時(shí)間的推移,遷移愈合面積越來(lái)越大, 36 h時(shí)0 μmol/L濃度和10 μmol/L濃度的劃痕恢復(fù)接近100%, 而20 μmol/L濃度和40 μmol/L濃度劃痕未能完全愈合。在0、12、24、36 h時(shí),與0 μmol/L濃度比較, 10、20、40 μmol/L濃度的劃痕區(qū)域遷移率呈下降趨勢(shì),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見圖4B。

A: 淫羊藿素干預(yù)CAL-27細(xì)胞12、24、36 h后劃痕鏡下表現(xiàn),比例尺為100 μm; B: 淫羊藿素干預(yù)CAL-27細(xì)胞12、24、36 h后細(xì)胞遷移率柱形圖。12 h時(shí),與0 μmol/L濃度比較, *P<0.05, **P<0.01; 24 h時(shí),與0 μmol/L濃度比較, #P<0.05, ##P<0.01; 36 h時(shí),與0 μmol/L濃度比較, △P<0.05, △△P<0.01。圖4 淫羊藿素干預(yù)CAL-27細(xì)胞的劃痕實(shí)驗(yàn)

2.5 Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)

CAL-27細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同濃度的淫羊藿素作用48 h后,隨著藥物濃度的增加,遷移和侵襲穿過(guò)小室的細(xì)胞逐漸減少,見圖5A、5B。CAL-27遷移穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)目呈淫羊藿素劑量依賴性減少(P<0.001); CAL-27侵襲穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)目呈淫羊藿素劑量依賴性減少(P<0.05或P<0.001), 見圖5C、5D。

A: CAL-27細(xì)胞各組遷移圖,比例尺為100 μm; B: CAL-27細(xì)胞各組侵襲圖,比例尺為100 μm; C: 各濃度淫羊藿素干預(yù)細(xì)胞遷移數(shù)目統(tǒng)計(jì)分析; D: 各濃度淫羊藿素干預(yù)細(xì)胞侵襲數(shù)目統(tǒng)計(jì)分析。兩者比較, *P<0.05, ***P<0.001。圖5 淫羊藿素干預(yù)CAL-27細(xì)胞48 h后的遷移和侵襲結(jié)果

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

淫羊藿素干預(yù)人舌鱗癌細(xì)胞CAL-27 48 h后,隨著藥物濃度的增加,凋亡細(xì)胞比例增加,見圖6A。0 μmol/L濃度細(xì)胞凋亡率為(4.96±1.92)%, 10 μmol/L濃度細(xì)胞凋亡率為(10.15±2.16)%, 20 μmol/L濃度細(xì)胞凋亡率為(28.96±4.65)%, 40 μmol/L濃度細(xì)胞凋亡率為(45.20±6.80)%。CAL-27細(xì)胞凋亡率呈淫羊藿素劑量依賴性增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.001)。

A: 流式凋亡圖; B: 細(xì)胞凋亡率柱形圖。兩者比較, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001。 流式圖中4個(gè)象限: 左下象限代表正常細(xì)胞群; 左上象限代表機(jī)械損傷細(xì)胞群; 右上象限代表晚期凋亡細(xì)胞; 右下象限代表早期凋亡細(xì)胞; 細(xì)胞凋亡率為右上和右下細(xì)胞占比之和。圖6 淫羊藿素干預(yù)CAL-27細(xì)胞48 h后的凋亡結(jié)果

2.7 淫羊藿素與AR、ESR1、PRKACA、PTGS2進(jìn)行分子對(duì)接

淫羊藿素與AR(1XOW)、ESR1(7BAA)、PRKACA(5N1F)、PTGS2(5F19)進(jìn)行分子對(duì)接的結(jié)合能依次為: -69.457 9、0、-48.798 2、0 kcal/mol。結(jié)合能數(shù)值越低,氫鍵結(jié)合數(shù)目越多,則舌鱗癌受體與淫羊藿素之間的結(jié)合活性越高,結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定,潛在效果就越好。其中,AR、ESR1、PRKACA與淫羊藿素對(duì)接有2個(gè)氫鍵,而PTGS2與淫羊藿素的對(duì)接沒(méi)有氫鍵的結(jié)合,見圖7。

綠色節(jié)點(diǎn)及虛線表示經(jīng)典氫鍵結(jié)合。圖7 淫羊藿素與人舌鱗癌靶點(diǎn)分子對(duì)接二級(jí)結(jié)構(gòu)圖

2.8 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)

分別采用0、10、20、40 μmol/L 濃度的淫羊藿素處理CAL-27 48 h后,檢測(cè)AR、ESR1、PRKACA、PTGS2的表達(dá)情況。與0 μmol/L濃度比較,AR、ESR1、PRKACA、PTGS2的相對(duì)表達(dá)量呈淫羊藿素濃度依賴性降低; 但0 μmol/L濃度和10 μmol/L濃度的PTGS2的相對(duì)表達(dá)量比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 見圖8。

A: 干預(yù)48 h后PRKACA的相對(duì)表達(dá)量; B: 干預(yù)48 h后AR的相對(duì)表達(dá)量; C: 干預(yù)48 h后ESR1的相對(duì)表達(dá)量; D: 干預(yù)48 h后PTGS2的相對(duì)表達(dá)量。兩者比較, **P<0.01, ***P<0.001。圖8 淫羊藿素干預(yù)CAL-27細(xì)胞48 h后AR、ESR1、PRKACA、PTGS2的相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

舌鱗癌預(yù)后較差,淋巴結(jié)陽(yáng)性、腫瘤浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)比率升高是影響存活率的重要預(yù)后因素[14]。目前,舌鱗癌治療方式以手術(shù)為主,輔助放化療、生物治療和康復(fù)治療等進(jìn)行綜合序列治療[15]。研究[16-17]表明,天然化合物如淫羊藿素、白皮杉醇、姜黃素、醋酸棉酚等在舌鱗癌的治療中起著越來(lái)越重要的作用。淫羊藿素又名阿可拉定,有研究[18]表明,其可抑制多條腫瘤增殖信號(hào)通路,提高免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤的殺傷。目前已完成晚期肝癌治療的ⅡB期臨床試驗(yàn),與其他藥物的聯(lián)合應(yīng)用對(duì)晚期或三陰性乳腺癌的臨床實(shí)驗(yàn)一致,均顯示出明確的臨床療效和良好的安全性[19-21]。

本研究采用不同濃度的淫羊藿素干預(yù)人舌鱗癌細(xì)胞CAL-27, 通過(guò)CCK-8測(cè)試、克隆形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)淫羊藿素對(duì)舌鱗癌增殖、凋亡、遷移、侵襲等生物學(xué)性能的影響。本研究結(jié)果表明,隨著藥物濃度的增加, CAL-27生長(zhǎng)受到的抑制越來(lái)越顯著,且呈時(shí)間和劑量依賴性。結(jié)合劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),細(xì)胞向四周移動(dòng)的能力逐漸降低,且流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)和RT-qPCR實(shí)驗(yàn)表明隨著淫羊藿素濃度的增加,細(xì)胞凋亡率越來(lái)越高。

結(jié)合本課題組對(duì)淫羊藿抗舌鱗癌作用的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接分析中發(fā)現(xiàn),AR、ESR1、PRKACA、PTGS2可能為淫羊藿素作用于舌鱗癌的4個(gè)最佳靶點(diǎn)。4個(gè)靶點(diǎn)抗腫瘤作用為:AR被認(rèn)為在癌癥發(fā)生中有促進(jìn)作用,可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,并被認(rèn)為是一種潛在的頭頸鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后標(biāo)記物[22-24]; 研究[25]表明,AR陽(yáng)性的口腔鱗癌患者可能具有低生存率、高復(fù)發(fā)率的風(fēng)險(xiǎn)。ESR1在轉(zhuǎn)錄上調(diào)節(jié)參與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。研究[26-28]表明,ESR1參與了乳腺癌、前列腺癌等癌癥的病理過(guò)程,在頭頸鱗癌中被報(bào)道為潛在的預(yù)后化學(xué)標(biāo)志物。PRKACA被報(bào)道[29]與心血管疾病、腎上腺皮質(zhì)腫瘤以及乳腺癌、纖維板層狀肝細(xì)胞癌等多種癌癥相關(guān)。研究[30]表明,DNAJB1-PRKACA基因融合能與β-連環(huán)蛋白相互作用,顯著促進(jìn)腫瘤的發(fā)生; 研究[31]表明,PRKACA可以通過(guò)其下游底物的磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(dòng),從而減少細(xì)胞內(nèi)的自噬,并誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。PTGS2在腫瘤發(fā)病過(guò)程中也起著至關(guān)重要的作用,其與結(jié)腸癌、前列腺癌、宮頸癌、卵巢癌等多種癌癥相關(guān)[32-35]。生物信息學(xué)分析[36]表明,PTGS2作為頭頸癌免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)之一,在不久的將來(lái)可能成為新的治療靶點(diǎn)。

為進(jìn)一步探究淫羊藿對(duì)舌鱗癌的作用機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AR、ESR1、PRKACA、PTGS2mRNA的相對(duì)表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的增加,其相對(duì)表達(dá)量均呈現(xiàn)不同程度的降低,且下降程度以AR最為顯著,其次為PRKACA, 變化幅度最小的為PTGS2, 變化趨勢(shì)與分子對(duì)接結(jié)合能絕對(duì)值大小依次排序:AR(1XOW)>PRKACA(5N1F)>ESR1(7BAA)= PTGS2(5F19)。

綜上所述,淫羊藿素可促進(jìn)人舌鱗癌細(xì)胞凋亡,并抑制舌鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,具體機(jī)制可能與淫羊藿素和人舌鱗癌細(xì)胞內(nèi)AR、ESR1、PRKACA的特異性結(jié)合,進(jìn)而影響目的基因的表達(dá)量有關(guān),但其具體調(diào)控作用機(jī)制尚不明確,還需進(jìn)一步探討。