柚皮苷對更年期抑郁癥模型小鼠絕望行為的影響及神經(jīng)保護(hù)機(jī)制研究

蘇 婷，王麗紅，于 浩，崔 悅，張 寧，趙德萍，徐紅丹，雷 霞，2

（1.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.無錫市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 無錫 214071；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱150040；4.無錫衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，江蘇 無錫 214071）

更年期抑郁癥是一種以情緒低落、絕望、焦慮為主要臨床特征的精神疾病，海馬神經(jīng)元損傷是其主要病理特征之一［1］。絕經(jīng)后女性腦內(nèi)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞缺乏雌激素的保護(hù)作用，更加難以應(yīng)對壓力事件，是導(dǎo)致女性絕經(jīng)后易感抑郁的重要原因［2］。研究表明，壓力刺激會造成前額葉皮層谷氨酸大量釋放，引起神經(jīng)元興奮毒損傷，造成海馬神經(jīng)元細(xì)胞過度凋亡，細(xì)胞數(shù)量減少［3］。

柚皮苷（4，5，7-三羥基黃烷酮-7-鼠李糖苷），是一種分布較廣的黃酮類化合物，其在骨碎補(bǔ)中含量較高，具有植物雌激素樣結(jié)構(gòu)［4］。Jung 等［5］研究表明，柚皮苷易通過血腦屏障，并具有較強(qiáng)的抗細(xì)胞凋亡作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，柚皮苷對神經(jīng)元細(xì)胞的抗凋亡作用依賴于激活雌激素受體（estrogen receptor，ER）［6，7］。柚皮苷是否 通過促進(jìn)更 年期抑郁癥（OVX+CUMS）模型小鼠腦內(nèi)的ER 受體表達(dá)而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用？本文主要探究柚皮苷對OVX+CUMS 模型小鼠海馬雌激素受體及神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 動物 SPF 級昆明小鼠，雌性，體重（23±2）g，購自昌盛生物科技有限公司，合格證號：SCXK（遼）2019-0001。所有方案均經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)（許可證號：NO.2019-002）。每只鼠籠（42 cm×30 cm×27 cm）飼養(yǎng)和馴化5 只小鼠，并將其飼養(yǎng)于溫度為（21±2）℃、相對濕度為（62±2）%、光照12 h 晝夜交替環(huán)境下。實(shí)驗(yàn)期間自由飲食、飲水。

1.1.2 藥品和主要試劑 柚皮苷（純度≥98%，貨號：B21594），購自上海源葉生物科技有限公司；ICI182780，（貨號：531042），購自Sigma；雌二醇（純度98%，S30633），購于源葉生物；BCA 蛋白定量試劑盒（貨號：20201ES76），購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；PVDF 膜和 Immobilon Western HRP 底 物（貨 號：10600023，WBKLS0100），購 自Whatman 公司；ERα、ERβ、GluR2、CAMK Ⅱ、NMDAR1、β-actin、山羊抗兔IgG H&L（HRP）（貨號：ab22595，ab22595，ab52180，ab181052，ab17345，ab8227，ab6721），購自Abcam 公司；Bad、Bcl-2、Caspase3（貨號：BM4241，BA0412，BA2142），購自博士德生物；抗體稀釋液（貨號：E-IR-R106），購自Elabscience。

1.1.3 主要儀器 光學(xué)顯微鏡（型號：BX41，奧林巴斯）；化學(xué)成像系統(tǒng)（型號：A44116，Thermo）；酶標(biāo)儀（型號：5187149，Thermo）；水平搖床（型號：WD9405B，北京市六一儀器廠）；電泳儀（型號：MiniPROTEANTetra Cell，BIO-RAD 公 司）；半 干轉(zhuǎn) 膜 儀（型 號：Trans-Blot SD Cell，BIO-RAD 公司）；超純水制備系統(tǒng)（型號：RsearchUV UF，上海和泰公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組

54 只小鼠隨機(jī)分為6 組（n=9），即空白組、模型（OVX+CUMS）組、假手術(shù)組（SHAM 組）、雌二醇組（E2組）、柚 皮 苷 組 和 柚 皮 苷+ER 阻 斷 劑（ICI182780）組。

1.2.2 OVX+CUMS 模型復(fù)制及給藥

適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后，按馮鈺［8］手術(shù)操作方法對空白組外其他各組小鼠進(jìn)行雙側(cè)卵巢摘除手術(shù)。每只雌性小鼠均用2%異氟烷后，在其背部區(qū)域做一個(gè)切口，找到卵巢周圍的脂肪，拉出卵巢，切除卵巢并剪去余線，隨后將子宮角送回原位。假手術(shù)按上述操作進(jìn)行，但只剪去等體積脂肪塊。

手術(shù)結(jié)束14 d 后，對除空白組和SHAM 組外其余各組小鼠按吳熠等［9］應(yīng)激方式進(jìn)行刺激。每天隨機(jī)進(jìn)行一種應(yīng)激刺激，但不連續(xù)使用同一種應(yīng)激方式，連續(xù)刺激21 d。

21 d 刺激結(jié)束后，空白組、SHAM 組和OVX+CUMS 組每天灌胃0.2 mL 蒸餾水，E2組、柚皮苷組每天分別灌胃等體積E（220.090 mg·kg-1·d-1）、柚皮苷（100 mg·kg-1·d-1），柚皮苷+ICI182780 組先腹腔注 射ICI182780（0.075 mg·kg-1·d-1），15 min 后 灌 胃等體積柚皮苷（100 mg·kg-1·d-1），柚皮苷給藥劑量基于實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果確定最佳給藥劑量［10］。連續(xù)給藥21 d 后，第22 天進(jìn)行懸尾實(shí)驗(yàn)，第23 天進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 懸尾實(shí)驗(yàn) 將每只小鼠用膠帶使其懸浮在桌面上方58 cm 處的架子邊緣，并將其放置在離尾巴尖端大約1 cm 的地方，懸掛保持6 min，并在測試的最后4 min 記錄靜止時(shí)間。靜止時(shí)間判定標(biāo)準(zhǔn)為小鼠被動地且完全靜止不動時(shí)，即視為靜止。

1.2.3.2 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 將每只小鼠單獨(dú)放置在一個(gè)玻璃聚碳酸酯圓柱體中（高度：25 cm；直徑：10 cm），深度為10 cm，水溫保持恒溫，保持6 min，并在測試的最后4 min 記錄靜止時(shí)間。靜止時(shí)間判定標(biāo)準(zhǔn)如“1.2.3.1”。

1.2.4 腦組織收集

行為學(xué)結(jié)束后，戊巴比妥（80 mg/kg）麻醉后，經(jīng)心臟灌注適量生理鹽水，其中各組3 只小鼠繼續(xù)經(jīng)心臟灌注4%多聚甲醛，立即摘除腦組織，并沿中縫分為半腦，隨后用生理鹽水沖洗表面，用濾紙吸干體表水份，稱重。隨后將3 只灌注多聚甲醛的小鼠腦組織放入4%多聚甲醛固定24 h，其余小鼠腦組織分離海馬后，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 HE 染色觀察小鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)變化

將“1.2.4”小鼠腦組織經(jīng)脫水、包埋、切片（厚度為4 μm）、烘片后，對切片進(jìn)行HE 染色，并于顯微鏡下觀察。

1.2.6 免疫組化檢測海馬區(qū)ERα 和ERβ 的陽性細(xì)胞表達(dá)

按云海龍等［11］步驟進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)操作，一抗ERα（1∶200）、ERβ（1∶200）和 二抗HRP（1∶500）按相應(yīng)比例用抗體稀釋液稀釋后進(jìn)行孵育，最后采用Image J 軟件對每個(gè)切片5 個(gè)不同視野中的陽性細(xì)胞進(jìn)行分析計(jì)算。

1.2.7 蛋白免疫印跡（WB）法檢測海馬中ERβ、GluR2、CAMKⅡ、NMDAR1、Bad、Bcl-2、Caspase3蛋白表達(dá)

取出海馬，按耿娜［12］方法進(jìn)行提蛋白、上樣、蛋白含量檢測等操作，經(jīng)上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、抗體孵育等操作后，使用成像系統(tǒng)通過ECL 化學(xué)發(fā)光檢測信號顯影成像，最后應(yīng)用Image J 軟件對清晰條帶進(jìn)行分析。各抗體用抗體稀釋液按ERβ（1∶200）、GluR2（1∶500）、CAMK Ⅱ（1∶200）、NMDAR1（1∶500）、Bad（1∶500）、Bcl-2（1∶500）、Caspase3（1∶500）、β-actin（1∶1 000）比例對抗體進(jìn)行稀釋。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 懸尾實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與空白組相比，OVX+CUMS 組小鼠靜止時(shí)間顯著增加（P＜0.01）；與OVX+CUMS 組相比，SHAM 組、E2組和柚皮苷組小鼠靜止時(shí)間顯著減少（P＜0.01）；與柚皮苷組相比，柚皮苷+ICI182780 組小鼠靜止時(shí)間明顯增加（P＜0.05）。結(jié)果見圖1。

圖1 各組小鼠對懸尾實(shí)驗(yàn)的影響（n=9，）Fig 1 Effect of each group of mice on the suspended tailexperiment（n=9，）

2.1.2 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與空白組相比，OVX+CUMS 組小鼠靜止時(shí)間顯著增加（P＜0.01）；與OVX+CUMS 組相比，SHAM 組、E2組和柚皮苷組小鼠靜止時(shí)間顯著減少（P＜0.01）；與柚皮苷組相比，柚皮苷+ICI182780 組小鼠靜止時(shí)間明顯增加（P＜0.05）。結(jié)果見圖2。

圖2 各組小鼠對強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)的影響（n=9，）Fig 2 Effect of each group of mice on the forced swim experiment （n=9，）

2.2 HE 染色觀察各組小鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)變化結(jié)果

如圖3 所示，空白組小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞正常，排列緊密；模型組小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞排列稀疏，細(xì)胞固縮，胞體減?。慌c模型組相比，SHAM 組、E2組及柚皮苷組小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞完整，排列相對緊密；柚皮苷+ICI182780 組神經(jīng)元細(xì)胞與模型組細(xì)胞變化相似，胞體減小，細(xì)胞排列松散。

圖3 各組小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)變化（n=9，）Fig 3 Cell morphological changes of hippocampal neurons in each mouse group （n=9，）

2.3 免疫組化檢測海馬區(qū)ERa 和ERβ 的陽性細(xì)胞表達(dá)結(jié)果

與空白組相比，OVX+CUMS 組小鼠ERa 表達(dá)降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），ERβ 表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；與OVX+CUMS 組相比，SHAM組、E2組和柚皮苷組小鼠ERa 表達(dá)升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），ERβ 表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與柚皮苷組相比，柚皮苷+ICI182780 組小鼠ERa 和ERβ 表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果見圖4。

圖4 各組小鼠海馬中ERα 和ERβ 的陽性細(xì)胞表達(dá)的影響（n=9，）Fig 4 Effect of positive cell expression of ERα and ERβ in the hippocampus of each mouse group（n=9，）

如圖5 所示，空白組小鼠海馬區(qū)ERα 蛋白表達(dá)細(xì)胞排列緊密；模型組小鼠海馬區(qū)ERα 蛋白表達(dá)細(xì)胞減少，核固縮；SHAM 組、E2組及柚皮苷組小鼠較模型組小鼠海馬區(qū)細(xì)胞增多，細(xì)胞排列稍整齊；柚皮苷+ICI182780 組較柚皮苷組海馬區(qū)細(xì)胞減少，且與模型組小鼠細(xì)胞形態(tài)相似。

圖5 各組小鼠ERα 蛋白表達(dá)（免疫組化，×200）Fig 5 Expression of ERα protein in each group of mice （immunohistochemical，×200）

如圖6 所示，空白組小鼠海馬區(qū)ERβ 蛋白表達(dá)細(xì)胞正常、排列緊密；模型組小鼠海馬區(qū)ERβ 蛋白表達(dá)細(xì)胞減少，排列松散；SHAM 組、E2組及柚皮苷組較模型組小鼠海馬區(qū)細(xì)胞增多；柚皮苷+ICI182780 組較柚皮苷組海馬區(qū)細(xì)胞減少，且與模型組小鼠細(xì)胞形態(tài)相似。

圖6 各組小鼠ERβ 蛋白表達(dá)（免疫組化，×200）Fig 6 Expression of ERβ protein in each group of mice （immunohistochemical，×200）

2.4 WB 檢 測 海 馬 中ERβ、GluR2、NMDAR1、CAMKⅡ及凋亡因子Bad、Bcl-2 和Caspase3 的表達(dá)結(jié)果

2.4.1 WB 檢測海馬中ERβ 表達(dá)結(jié)果 與空白組相比，OVX+CUMS 組小鼠ERβ 表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；與OVX+CUMS 組相比，SHAM 組、E2組和柚皮苷組小鼠ERβ 表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與柚皮苷組相比，柚皮苷+ICI182780 組小鼠ERβ 表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果見圖7。

圖7 各組小鼠海馬中ERβ 表達(dá)結(jié)果（n=3，）Fig 7 Results of ERβ expression in the hippocampus of each mouse group （n=3，）

2.4.2 WB 檢 測 海 馬 中NMDAR1、GluR2、CAMKⅡ表達(dá)結(jié)果 與空白組相比，OVX+CUMS 組小鼠CAMKⅡ表達(dá)顯著升高（P＜0.01）、NMDAR1 表達(dá)明顯升高（P＜0.05）、GluR2 表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；與OVX+CUMS 組 相 比，SHAM 組 小 鼠GluR2、CAMKⅡ表達(dá)明顯升高（P＜0.05），E2組小鼠CAMKⅡ表達(dá)顯著下降（P＜0.01）、NMDAR1 表達(dá)明顯下降（P＜0.05）、GluR2 表達(dá)顯著升高（P＜0.01），柚皮苷組小鼠CAMKⅡ表達(dá)明顯下降（P＜0.05）、NMDAR1 表達(dá)顯著下降（P＜0.01）、GluR2表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與柚皮苷組相比，柚皮苷+ICI182780 組小鼠CAMKⅡ、NMDAR1 表達(dá)明顯升高（P＜0.05），GluR2 表達(dá)降低（P＞0.05）。結(jié)果見圖8。

2.4.3 WB 檢測海馬中凋亡因子Bad、Bcl-2 和Caspase3 的表達(dá)結(jié)果 與空白組相比，OVX+CUMS組 小 鼠Bad、Caspase3 表 達(dá) 顯 著 升 高（P＜0.01），Bcl-2 表 達(dá) 極 顯 著 降 低（P＜0.001）；與OVX+CUMS 組 相 比，SHAM 組、E2組 和 柚 皮 苷 組 小 鼠Bad 和Caspase3 表達(dá)顯著降低（P＜0.01），Bcl-2 表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與柚皮苷組相比，柚皮苷+ICI182780 組小鼠Bad、Caspase3 表達(dá)升高（P＜0.01，P＜0.05），Bcl-2 表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖9。

圖9 各組小鼠海馬中凋亡因子Bad、Bcl-2 和Caspase3 的表達(dá)結(jié)果（n=3，）Fig 9 Results of expression of apoptotic factors Bad，Bcl-2 and Caspase3 in the hippocampus of mice in each group（n=3，）

3 討論

采用OVX 聯(lián)合CUMS 的抑郁癥模型，能合理地模擬雌激素撤退和遭受壓力性刺激的雙重致病因素［13］。OVX+CUMS 模型可以誘導(dǎo)出抑郁樣行為以及典型的海馬神經(jīng)元過度凋亡，在更年期抑郁癥的機(jī)制研究中是較為理想的模型［14，15］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型小鼠懸尾不動時(shí)間與游泳靜止時(shí)間均顯著增加，小鼠產(chǎn)生絕望行為，說明OVX+CUMS方法復(fù)制的更年期抑郁癥模型小鼠表現(xiàn)人類抑郁的核心癥狀，出現(xiàn)了意志力減弱或情緒低落［1，9］。經(jīng)E2或柚皮苷給藥干預(yù)后，小鼠靜止時(shí)間均有不同程度的減短，說明柚皮苷能夠減輕小鼠絕望行為。在ER 阻斷劑的作用下，柚皮苷對模型小鼠行為的恢復(fù)作用被逆轉(zhuǎn)，說明ER 可能是介導(dǎo)柚皮苷發(fā)揮作用的重要靶點(diǎn)。

谷氨酸受體分為離子型受體（NMDAR）和代謝型 受 體（mGLuRs）［16］。研 究 表 明，抑 郁 狀 態(tài) 下，NMDA 受體主要調(diào)控鈣調(diào)蛋白/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶（CaM/CaMKⅡ）通路，GluR2 亞基的高表達(dá)會促進(jìn)Ca2+內(nèi)流，大量內(nèi)流的Ca2+會在線粒體內(nèi)快速沉積，造成線粒體功能喪失，進(jìn)一步增加一氧化氮合酶的活性，從而增加NO 的合成［17-19］。因此，當(dāng)神經(jīng)元含有大量的離子型NMDA 受體時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，會導(dǎo)致大量神經(jīng)元因興奮性毒性而過度凋亡［20］。海馬神經(jīng)元細(xì)胞突觸結(jié)構(gòu)、數(shù)量和功能的缺失正是造成抑郁樣行為的重要原因。本研究發(fā)現(xiàn)，模型小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞會出現(xiàn)胞體減小、核固縮等變化，柚皮苷給藥可改善海馬區(qū)病理變化，且能夠上調(diào)GluR2 蛋白表達(dá)，抑制海馬區(qū)NMDA 受體蛋白表達(dá)，下調(diào)CAMKⅡ表達(dá)，從而減輕細(xì)胞因興奮毒而死亡。在ER 阻斷劑干預(yù)下，也反向驗(yàn)證了柚皮苷抑制谷氨酸受體調(diào)節(jié)的鈣超載作用依賴于ER 受體。

本文通過對海馬區(qū)ERα 和ERβ 蛋白表達(dá)進(jìn)行半定量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)柚皮苷上調(diào)了模型小鼠海馬ERβ蛋白的表達(dá)，但對ERα 無明顯影響，與文獻(xiàn)結(jié)論一致［21］，提示柚皮苷主要激活海馬區(qū)ERβ，而非ERα（主要調(diào)節(jié)外周激素分泌水平）。張陽等［22］證實(shí)了ERβ 對海馬神經(jīng)元細(xì)胞有保護(hù)作用。ERβ 激活下游信號，主要通過調(diào)節(jié)核移位發(fā)揮基因組效應(yīng)，促進(jìn) 抗 凋 亡 因 子Bcl-2 的 合 成［7］。Bcl-2 家 族 和Caspase3 家族不斷激活可發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用［6］，但是動物在遭受反復(fù)刺激后，往往出現(xiàn)Bcl-2/Bad 比值極顯著降低，預(yù)示著大腦相應(yīng)區(qū)域的細(xì)胞過度凋亡。柚皮苷具有抗細(xì)胞凋亡作用，但在ICI182780作用下其抗凋亡作用明顯降低，說明柚皮苷可能通過激活海馬區(qū)ERβ 減少神經(jīng)元細(xì)胞過度凋亡。

4 結(jié)論

柚皮苷可能通過激活更年期抑郁癥模型小鼠海馬區(qū)ERβ，抑制谷氨酸受體激活引起的神經(jīng)元興奮毒，減少海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，改善絕望行為。

作者貢獻(xiàn)度說明：

蘇婷、于浩、崔悅、趙德萍：建立模型、指標(biāo)檢測、數(shù)據(jù)整理與分析、撰寫論文；王麗紅、張寧、徐紅丹：指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)、修改論文；雷霞：基金支持、論文審閱。

所有作者不存在利益沖突關(guān)系。