綿羊PLC-γ1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

袁利明,陳云蕾,劉素平,丁林玲,吳蘭,賽務(wù)加甫*

(1 石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,新疆 石河子 832000;2 西北農(nóng)林科技大學(xué),陜西 楊凌 712100;3 桐廬無(wú)規(guī)定馬屬動(dòng)物疫病區(qū)管理中心,浙江 杭州 310000)

磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(PLC)是與大多數(shù)細(xì)胞受體激活相關(guān)的常見(jiàn)信號(hào)成分[1]。PLC-γ1作為PLC的一個(gè)亞型,可將磷脂酰肌醇 4,5-二磷酸 (PIP2) 轉(zhuǎn)化為肌醇1,4,5-三磷酸 (IP3) 和甘油二酯 (DAG),由于DAG和IP3各自控制不同的細(xì)胞過(guò)程,也是合成其他重要信號(hào)分子的底物[2];在細(xì)胞增殖與分化[3]、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)[4]、受精過(guò)程中的精卵識(shí)別[5]、淋巴細(xì)胞的活化腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[6]和機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育等生命過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7]。PLC-γ1在PLC中是獨(dú)特的,是由受體酪氨酸激酶(RTK)磷酸化直接激活并在PLC-γ1的 Tyr 783位點(diǎn)上磷酸化,這種磷酸化是刺激磷脂酶活性的典型條件[8]。Hajicek等人[9]構(gòu)建的磷酸化誘導(dǎo)PLC-γ1活化的模型顯示,PLC-γ1的nSH2結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)自抑制酶向活化的受體酪氨酸激酶,以成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1(FGFR1)的激活為例,如圖1所示的募集引起PLC-γ1空間構(gòu)型的改變,從而發(fā)脂肪酶的磷酸化依賴性激活。Ma等[10]通過(guò)敲除斑馬魚胚胎中的morpholino(MO)基因發(fā)現(xiàn)胚胎發(fā)育過(guò)程中PLC-γ1在細(xì)胞生成中具有重要調(diào)控作用。盡管初步研究表明PLC-γ1在早期胚胎發(fā)育具有重要作用,但涉及的分子機(jī)制鮮有報(bào)道。

2A肽(豬圓環(huán)病毒)是一類自剪切序列,稱為“順式作用元件水解酶”,含有18到22個(gè)氨基酸,在翻譯到它的時(shí)候會(huì)斷開(kāi),能夠有效介導(dǎo)核糖體跳躍,通過(guò)自我切割實(shí)現(xiàn)上下游兩個(gè)蛋白單獨(dú)翻譯[11-12];可以把同一條mRNA表達(dá)出的蛋白前后分開(kāi)產(chǎn)生兩個(gè)蛋白,用于構(gòu)建多順?lè)醋虞d體,實(shí)現(xiàn)同一個(gè)啟動(dòng)子控制下的兩蛋白共翻譯,形成非融合性蛋白[13-14]。同時(shí),非融合性蛋白在結(jié)構(gòu)和功能方面會(huì)基本一致,保持原有的免疫原性[15]。在構(gòu)建載體同時(shí),pDsRed2-C1載體上的DsRed2紅色熒光蛋白為之后的轉(zhuǎn)染提供了很好的依據(jù),這為研究該基因的功能提供了更好的工具載體。

因此,本研究擬通過(guò)攜帶紅色熒光蛋白(RFP)報(bào)告功能和2A肽的切割作用構(gòu)建出活性更好的綿羊PLC-γ1非融合性真核表達(dá)載體,從而在不影響蛋白空間功能及活性基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)PLC-γ1蛋白表達(dá),為后續(xù)研究綿羊PLC-γ1基因在綿羊早期胚胎發(fā)育分子機(jī)制研究上提供基礎(chǔ)和便捷。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 載體與細(xì)胞

PUC57-PLC-γ1載體(本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建載體)、帶有紅色熒光蛋白的pDsRed2-C1載體、HEK-293T細(xì)胞,作者已構(gòu)建好的PUC57-PLC-γ1載體,DH5α感受態(tài)細(xì)胞以上皆由動(dòng)物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供。

1.1.2 主要試劑和設(shè)備

質(zhì)粒小提取試劑盒、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒、膠回收試劑盒、Marker II、增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;增強(qiáng)型ECL 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(即用型)購(gòu)置諾唯贊生物科技股份有限公司;Blue Plus? IV Protein Marker (10-180 kDa)購(gòu)置于北京全式金生物科技有限公司;SDS-PAGE上樣緩沖液、2×Taq MasterMix(Dye)購(gòu)置于康為世紀(jì)生物科技有限公司;DL10000 DNA Marker、總提RNA試劑盒、反轉(zhuǎn)錄(Perfect Real Time)試劑盒、HindⅢ酶和SalⅠ酶均購(gòu)置寶日醫(yī)生物科技(北京)有限公司。細(xì)胞裂解液、PMSF、PBS、胰酶、DAPI、HRP標(biāo)記二抗(羊抗兔)、FITC標(biāo)記二抗(羊抗鼠)均購(gòu)置北京索萊寶科技有限公司;QuantStudio 5實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x、Lip 2000、PageRuler? Prestained Protein Ladder(10-180 kDa)購(gòu)置于賽默飛世爾科技公司;PLC-γ1一抗(羊抗兔)、β-actin一抗(羊抗兔)、Flag一抗(羊抗鼠)、SYBR染料、Flag磁珠、磁力架均購(gòu)置于美國(guó)Bimake生物科技有限公司;犢牛血清、DMEM購(gòu)置于BI公司。

1.2 方法

1.2.1 重組PLC-γ1序列的設(shè)計(jì)及合成

基于獲取的綿羊PLC-γ1基因序列,在N端前加入P2A序列及3個(gè)連續(xù)Flag序列,兩端分別加入HindⅢ和SalⅠ 酶切位點(diǎn)粘性末端。根據(jù)pDsRed2-C1載體圖譜,在HindⅢ 酶切位點(diǎn)添加cg兩個(gè)堿基,以保護(hù)蛋白正常翻譯(表1)。將設(shè)計(jì)好的序列及含PUC57-PLC-γ1載體的菌液送至上海生工股份有限公司合成,并連接在PLC-γ1基因兩端并純化至PUC-57載體上。

表1 合成序列

1.2.2 重組pDsRed2-C1-P2A-3×Flag-PLC-γ1表達(dá)載體的構(gòu)建

PUC57-P2A-3×Flag-PLC-γ1載體和pDsRed2-C1載體用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和SalⅠ雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),按照膠回收試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行膠回收并純化。純化后用T4連接酶將P2A-3×Flag-PLC-γ1片段與酶切后的pDsRed2-C1空載質(zhì)粒連接,并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂布在卡那抗性的固體LB平板。16 h后挑單克隆菌株、搖菌并菌液PCR反應(yīng)鑒定,以待檢單克隆菌落為模版,以PUC57-P2A-3×Flag-PLC-γ1為引物。PCR擴(kuò)增體系25 μL:待檢單克隆菌落2 μL,2×Taq MasterMix(Dye)12.5 μL,上、下游引物各0.5 μL,ddH2O 9.7 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性40 s,56 ℃退火30 s;72 ℃延伸 60 s,共30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min,引物如(表2)。將菌液PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,將具有特異性條帶的單克隆菌落保菌送至上海生工股份有限公司測(cè)序。

1.2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞

將測(cè)序正確的pDsRed2-C1-PLC-γ1重組表達(dá)質(zhì)粒和pDsRed2-C1空載質(zhì)粒進(jìn)行菌液活化培養(yǎng),并用天根去內(nèi)毒素大提質(zhì)粒試劑盒進(jìn)行大提質(zhì)粒。用脂質(zhì)體Lip 2000將重組質(zhì)粒和空載質(zhì)粒各4 μg、ddH2O 4 μL轉(zhuǎn)染到HEK-293T細(xì)胞中,24 h后在體視熒光顯微鏡下觀測(cè)轉(zhuǎn)染情況并記錄。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)HEK-293T細(xì)胞中PLC-γ1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量

待轉(zhuǎn)染24 h后用PBS洗滌,并加入500 μL Buffer RL吹打細(xì)胞轉(zhuǎn)移至2 mL無(wú)酶離心管內(nèi),按照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit 說(shuō)明書提取實(shí)驗(yàn)組pDsRed2-C1-PLC-γ1、pDsRed2-C1、ddH2O對(duì)照組細(xì)胞的總RNA。按照TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,并去除基因組DNA。

根據(jù)綿羊β-actin 基因(登錄號(hào):443052)和綿羊P2A-3×Flag-PLC-γ1基因序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量qPCR引物(表3)。實(shí)時(shí)熒光定量qPCR反應(yīng)體系為20 μL,反應(yīng)體系:2×SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL,cDNA 1 μL,PLC-γ1/β-actin-qPCR-F(10 μmol·L-1)0.8 μL,PLC-γ1/β-actin-qPCR-R(10 μmol·L-1)0.8 μL,50×ROX Reference Dye(low Donc)0.4 μL,ddH2O 7 μL;利用Quant StudioTMDesign &Analysis Software軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量qPCR反應(yīng)程序試驗(yàn)采用相對(duì)定量反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃ 1 min 45個(gè)循環(huán),最后95 ℃變性15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃變性15 s以獲得溶解曲線。每組樣品均重復(fù)3次試驗(yàn)。

表3 實(shí)時(shí)熒光定量qPCR引物

1.2.5 Western blot鑒定3×Flag-PLC-γ1蛋白表達(dá)

將轉(zhuǎn)染48 h后的3組細(xì)胞用PBS洗滌3遍,250 μL RIPA(含1 mmol·L-1PMSF)洗脫至1.5 mL離心管中,4 ℃冷卻30 min,14 000 g離心5 min;按照索萊寶BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒將3組蛋白濃度稀釋統(tǒng)一濃度。取16 μL樣品加入4 μL 5×Loading buffer蛋白上樣,混勻后于金屬浴100 ℃煮沸5 min,進(jìn)行SDS-PAGE聚丙烯胺凝膠電泳。將樣品轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉2 h,PBST漂洗濾膜3次,每次10 min,以兔抗PLC-γ1單抗為一抗(1∶1 000倍稀釋)4 ℃過(guò)夜孵育,然后 PBST 漂洗濾膜 3 次,每次10 min,以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記好的羊抗兔HRP-IgG為二抗(1∶10 000倍稀釋)室溫孵育2 h,再用 PBST 漂洗濾膜 3 次,每次10 min,按照說(shuō)明書配制ECL發(fā)光液,點(diǎn)滴在PVDF膜上孵育2 min后在化學(xué)發(fā)光成像儀曝光拍照記錄,按照HRP-DAB底物顯色試劑盒說(shuō)明書對(duì)PVDF膜染色,觀察特異性條帶并拍照記錄。

1.2.6 Co-Immunoprecipitation純化鑒定3×Flag-PLC-γ1蛋白

用移液槍輕柔吹打重懸Anti-Flag免疫磁珠,吸取20 μL磁珠懸液加入到1.5 mL的離心管中;加入500 μL TBS,輕柔吹打重懸的磁珠,于磁力架上靜置10 s后去除上清液,重復(fù)上述步驟2次;在上述沉淀中加入200 μL pDsRed2-C1-PLC-γ1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HEK-293T細(xì)胞蛋白,并輕柔吹打重懸磁珠,室溫孵育2 h;磁力架上靜置10 s后移除上清液,向沉淀中加入500 μL PBST并輕柔吹打重旋磁珠,然后上下翻轉(zhuǎn)樣品5 min。磁性分離后移除上清并回收檢測(cè)非特異性蛋白,重復(fù)上述步驟兩次;所得沉淀中加入50 μL 1×Loading buffer蛋白上樣緩沖液并煮沸5 min,冷卻至室溫并在磁力架上靜置10 s,取上清進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

1.2.7 PLC-γ1蛋白的細(xì)胞亞定位

HEK-293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染前,將細(xì)胞爬片置于六孔板中,轉(zhuǎn)染按照1.2.4試驗(yàn)方法操作。轉(zhuǎn)染48 h后用1×PBS震蕩洗滌3遍,每次5 min(后面每一步前都按照如此操作)。固定:4%多聚甲醛,室溫浸泡20 min;透膜:0.1 %放入Trition-100透化10 min(可在鏡下觀察到細(xì)胞膜打孔的現(xiàn)象);封閉:加入5 % BSA,室溫下封閉1 h;孵育鼠抗Flag-tag一抗(1∶300 倍稀釋):不需要清洗直接加入一抗50 μL,4 ℃孵育過(guò)夜;孵育偶聯(lián)熒光素FITC二抗(1∶500倍稀釋):加入二抗500 μL,37 ℃孵育40 min(避光);染核:DAPI染色10 min(避光);封片:50%甘油取5 μL涂布在載玻片上,小心氣泡(避光),用彎曲的鑷子取出細(xì)胞爬片,將有細(xì)胞的一面朝覆蓋到載玻片上,在激光共聚焦顯微鏡下觀察分析并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量數(shù)據(jù)處理分析

Quant Studio 5實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x反應(yīng)后,將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Quant StudioTMDesign &Analysis Software軟件中,進(jìn)行溶解曲線分析檢測(cè)產(chǎn)物特異性,確定其獲得產(chǎn)物為目的產(chǎn)物。對(duì)PLC-γ1和β-actin基因的溶解曲線具有單峰特異性產(chǎn)物進(jìn)行PLC-γ1基因的定量分析,并將數(shù)據(jù)導(dǎo)出Excel中,采用2-ΔΔCT法計(jì)算,其中ΔCT=目的基因CT-內(nèi)參基因CT,ΔΔCT=實(shí)驗(yàn)組ΔCT-對(duì)照組ΔCT。得到數(shù)據(jù)用SPSS 21進(jìn)行單因素方差分析中LSD檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較分析,P<0.05為差異性顯著,數(shù)據(jù)分析后用Origin作圖。

1.3.2 Images J 分析PLC-γ1蛋白相對(duì)表達(dá)分析

將ECL曝光圖像導(dǎo)入Images J 軟件,對(duì)PLC-γ1條帶和β-actin條帶進(jìn)行灰度值計(jì)算,重復(fù)3次并計(jì)算均值,PLC-γ1條帶灰度值與其相應(yīng)內(nèi)參β-actin比值為相對(duì)灰度值,可表示為該基因相對(duì)表達(dá)。將對(duì)照組ddH2O組相對(duì)灰度值設(shè)置為1,其他組按照相應(yīng)比值進(jìn)行調(diào)整并用SPSS 21軟件分析差異性,Origin軟件繪制柱狀圖。

2 結(jié)果

2.1 重組pDsRed2-C1-P2A-3×Flag-PLC-γ1表達(dá)載體的構(gòu)建

將原有為大小3 886 bp的PLC-γ1基因N端合成添加P2A-3×Flag序列,由上海生工股份有限公司重組構(gòu)建為大小4 022 bp的P2A-3×Flag-PLC-γ1序列,將含該基因的PUC57菌液活化,經(jīng)質(zhì)粒提取,HindⅢ和SalⅠ雙酶切后電泳鑒定結(jié)果如圖2,符合預(yù)期大小。膠回收后連接到pDsRed2-C1真核表達(dá),轉(zhuǎn)化后挑單克隆菌株,經(jīng)2%瓊脂糖電泳菌液PCR鑒定結(jié)果如圖3顯示,將陽(yáng)性菌送至上海生工測(cè)序,測(cè)序結(jié)果成功構(gòu)建了pDsRed2-C1-P2A-3×Flag-PLC-γ1(pDsRed2-C1-PLC-γ1)重組真核表達(dá)載體,載體圖譜如圖4顯示。

M:DL10000 DNA Marker;N,PUC-P2A-3×Flag-PLC-γ1質(zhì)粒;1:PUC-P2A-3×Flag-PLC-γ1質(zhì)粒雙酶切。圖2 PUC-P2A-3×Flag-PLC-γ1質(zhì)粒雙酶切鑒定

M:Marker II;1、2、4,陽(yáng)性;3、5,陰性。圖3 菌液PCR鑒定

圖4 重組質(zhì)粒pDsRed2-C1-P2A-3×Flag-PLC-γ1示意圖

2.2 重組質(zhì)粒pDsRed2-C1-PLC-γ1轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞

復(fù)蘇HEK-293T細(xì)胞后,在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)將實(shí)驗(yàn)組重組質(zhì)粒pDsRed2-C1-PLC-γ1、空載質(zhì)粒pDsRed2-C1、對(duì)照組ddH2O,通過(guò)脂質(zhì)體Lip 2000轉(zhuǎn)染到HEK-293T細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)染24 h后在熒光倒置顯微鏡下經(jīng)綠色熒光激發(fā),結(jié)果如圖5顯示,轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒和空載質(zhì)粒組均可觀察到紅色熒光表達(dá),對(duì)照組無(wú)紅色熒光表達(dá),說(shuō)明重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染到HEK-293T細(xì)胞內(nèi)并表達(dá)。

圖5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞 200×

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)PLC-γ1的mRNA相對(duì)表達(dá)量

待轉(zhuǎn)染24 h后,收集HEK-293T細(xì)胞提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA為模板,β-actin為內(nèi)參。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中PLC-γ1的表達(dá)量,結(jié)果顯示重組質(zhì)粒Pdsred2-C1-PLC-γ1組表達(dá)量極顯著高于其他兩組(P<0.01),其中空轉(zhuǎn)載體與空白對(duì)照組表達(dá)量無(wú)明顯差異,如圖6所示。

圖6 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞的mRNA水平表達(dá)量(**P<0.01)

2.4 Co-Immunoprecipitation鑒定純化3×Flag-PLC-γ1蛋白

對(duì)轉(zhuǎn)染48 h重組pDsRed2-C1-PLC-γ1質(zhì)粒的HEK-293T細(xì)胞裂解,用Flag標(biāo)簽標(biāo)記的免疫磁珠進(jìn)行免疫共沉淀反應(yīng),來(lái)純化3×Flag-PLC-γ1蛋白。經(jīng)SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳,結(jié)果如圖7顯示,蛋白在158 kDa處呈現(xiàn)特異性單一蛋白,IP上清回收液和HEK-293T細(xì)胞蛋白均有蛋白雜帶,表示構(gòu)建含F(xiàn)lag標(biāo)簽的PLC-γ1質(zhì)粒成功構(gòu)建并表達(dá)。

M. 蛋白 Marker;1:純化的3×Flag-PLC-γ1蛋白;2:IP上清回收液;3:HEK-293T細(xì)胞蛋白。圖7 IP鑒定攜帶Flag標(biāo)簽的PLC-γ1蛋白

2.5 Western blot鑒定PLC-γ1蛋白表達(dá)

轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞48 h后,對(duì)轉(zhuǎn)染重組pDsRed2-C1-PLC-γ1質(zhì)粒、空載pDsRed2-C1質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞和對(duì)照組轉(zhuǎn)染ddH2O的細(xì)胞裂解,經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光成像儀曝光,結(jié)果如圖8顯示,轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pDsRed2-C1-PLC-γ1的條帶尤為明顯,用Image J軟件成像分析計(jì)算三組蛋白相對(duì)表達(dá)量,SPSS 21檢驗(yàn)差異性,結(jié)果圖9顯示,轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的PLC-γ1蛋白表達(dá)量與其他兩組有極顯著區(qū)別。

圖9 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞的蛋白水平表達(dá)量(**P<0.01)

2.6 PLC-γ1蛋白的細(xì)胞亞定位

轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞48 h后,對(duì)轉(zhuǎn)染pDsRed2-C1-PLC-γ1重組質(zhì)粒的試驗(yàn)組、pDsRed2-C1質(zhì)粒的對(duì)照組細(xì)胞用PBS清洗并用5 %BSA封閉。經(jīng)抗Flag一抗孵育和熒光素標(biāo)記的二抗孵育并DIPA染核后,在激光共聚焦顯微鏡下,結(jié)果如圖10顯示,轉(zhuǎn)染pDsRed2-C1質(zhì)粒的對(duì)照組可觀察到紅色熒光DsRed2蛋白表達(dá),蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中,但在紅色熒光同一細(xì)胞下無(wú)法觀察到FITC標(biāo)記的綠色熒光PLC-γ1蛋白。轉(zhuǎn)染pDsRed2-C1-PLC-γ1重組質(zhì)粒的試驗(yàn)組均可觀察到FITC標(biāo)記的綠色熒光和紅色熒光DsRed2的蛋白表達(dá),可間接證明PLC-γ1成功表達(dá),并表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中。

圖10 激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)PLC-γ1蛋白在HEK-293T細(xì)胞的亞定位

3 討論

受體酪氨酸激酶(RTK)是由一個(gè)大的細(xì)胞外配體結(jié)合區(qū)、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)細(xì)胞內(nèi)催化激酶結(jié)構(gòu)域組成,RTK可與表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等生長(zhǎng)因子識(shí)別并結(jié)合,其中像配體PLC-γ1的結(jié)合通常誘導(dǎo)RTK上的單體二聚,觸發(fā)C末端酪氨酸殘基的反式自磷酸化,使這些殘基可以作為PLC-γ1等酶的補(bǔ)充位點(diǎn)[16]。由于RTK的內(nèi)在激酶活性,使這些與之相適配的蛋白磷酸化,從而增加單個(gè)受體激活后的信號(hào)通路并使其多樣化[17]。在功能方面上,RTK介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制主要通過(guò)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶ERK 1/2、粘著斑激酶(FAK)、蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶B(Akt)介導(dǎo),從而促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和存活[18-19]。這些研究說(shuō)明PLC-γ1在RTK介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制中扮演重要的角色。盡管在Ma ACH研究中已證實(shí)PLC-γ1在早期胚胎發(fā)育具有重要作用,但只是在小鼠等模式動(dòng)物基因敲除的研究,并且涉及的分子機(jī)制仍不清楚。

因此,本研究在原有PUC57-PLC-γ1載體基礎(chǔ)上,構(gòu)建具有DsRed2紅色蛋白作為示蹤標(biāo)記的pDsRed2-C1載體作為過(guò)表達(dá)真核載體,進(jìn)一步探索上調(diào)水平下PLC-γ1在早期胚胎發(fā)育具體作用機(jī)制。pDsRed2-C1載體不僅對(duì)宿主細(xì)胞不具有毒性,且不會(huì)影響目的蛋白的表達(dá),可以直接在熒光顯微鏡下觀察到融合蛋白表達(dá)和定位情況,故在融合蛋白真核表達(dá)研究中具有不可替代的作用。然而,pDsRed2-C1載體的DsRed2紅色蛋白大小為55.48 kDa,而MCS位點(diǎn)位于DsRed2紅色蛋白之后,使之與目的蛋白形成融合蛋白來(lái)表達(dá)。在常用的2A肽中的P2A與T2A可以使紅色熒光蛋白(RFP)表達(dá)提高1.47倍,并且P2A 可以有效地驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因在細(xì)胞中的表達(dá)[11]。綜上所述,為了不影響其目的蛋白PLC-γ1的空間結(jié)構(gòu)及功能,在構(gòu)建真核表達(dá)載體時(shí),我們選用具有高效切割作用的P2A肽來(lái)連接DsRed2紅色蛋白和PLC-γ1目的蛋白。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)在目的基因上銜接一段Flag標(biāo)簽的真核表達(dá)載體可使用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)技術(shù)更方便的探究上下游信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)及聯(lián)系[20-21]。為了更好地研究PLC-γ1在RTK信號(hào)通路的作用機(jī)制,便在PLC-γ1目的基因N端添加了3×Flag標(biāo)簽成功構(gòu)建了pDsRed2-C1-P2A-3×Flag-PLC-γ1質(zhì)粒。結(jié)果顯示重組質(zhì)粒在HEK-293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染后成功表達(dá)PLC-γ1蛋白,且與DsRed2紅色蛋白分割成功。通過(guò)mRNA和蛋白水平鑒定發(fā)現(xiàn)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK-293T細(xì)胞也能表達(dá)PLC-γ1蛋白,與重組質(zhì)粒差異極顯著(P<0.01),其中PLC-γ1在mRNA水平上表達(dá)與對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01),這可能與基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯調(diào)節(jié)有關(guān),具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。在免疫共沉淀上,我們運(yùn)用Flag標(biāo)簽的免疫磁珠成功分離出含3×Flag標(biāo)簽的PLC-γ1蛋白,蛋白大小為158 kDa,表示該3×Flag標(biāo)簽成功構(gòu)建到目的蛋白上,且在傳統(tǒng)的提純真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)上,Bimake公司的免疫磁珠在提取蛋白上更具操作簡(jiǎn)單、省時(shí)、特異性高等優(yōu)勢(shì)。在亞細(xì)胞定位中我們運(yùn)用免疫熒光技術(shù),通過(guò)使用抗Flag標(biāo)簽的特異性一抗及FITC熒光素標(biāo)記的二抗來(lái)定位PLC-γ1蛋白,結(jié)果顯示DsRed2紅色蛋和PLC-γ1蛋白均分布在細(xì)胞質(zhì)中,同時(shí),也進(jìn)一步驗(yàn)證了3×Flag標(biāo)簽的表達(dá)。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了pDsRed2-C1-P2A-3×Flag-PLC-γ1真核表達(dá)載體,證實(shí)其在P2A肽作用下,目的蛋白PLC-γ1與DsRed2紅色熒光蛋白成功分割,且不影響PLC-γ1蛋白的功能和空間結(jié)構(gòu)。為后續(xù)研究綿羊PLC-γ1基因通過(guò)RTK信號(hào)通路調(diào)控綿羊早期胚胎發(fā)育分子機(jī)制研究上提供基礎(chǔ)和便捷。