犬博卡病毒流行病學(xué)調(diào)查及基因序列分析

程 群，韓宏曉，郁達(dá)義，趙秋華，孫安幫，馬福余，陳美松，王海根，孫 清

（上海市閔行區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201109）

博卡病毒（Bocavirus,BoV）為無囊膜的線性單鏈DNA病毒，屬于細(xì)小病毒亞科（Parvovrinae）。博卡病毒最初于20世紀(jì)60年代在犬中發(fā)現(xiàn)，隨后在人、大猩猩、豬、奶牛、貓等多種哺乳動(dòng)物中檢測(cè)到博卡病毒的存在[1-6]。博卡病毒感染后能引起呼吸道和消化道癥狀，其中消化道的癥狀以引起人或動(dòng)物的腹瀉為主，博卡病毒的流行與傳播對(duì)人或其他哺乳動(dòng)物的健康構(gòu)成較大的威脅。

犬博卡病毒（Canine bocavirus,CBoV）屬于博卡病毒亞家族的成員之一，其基因組大小約為5.4 kb，含有3個(gè)開放閱讀框，分別編碼NS1、NP1和VP1/2蛋白[7]。近年來，中國(guó)、德國(guó)、美國(guó)、意大利、韓國(guó)和日本等多個(gè)國(guó)家相繼報(bào)道了犬博卡病毒的存在，并發(fā)現(xiàn)犬博卡病毒包含CBoV1、CBoV2和CBoV3三種基因型[8-10]。然而，犬博卡病毒的流行情況及遺傳演化情況仍不清楚，因此，我們對(duì)上海地區(qū)犬糞便中的犬博卡病毒感染及病毒的遺傳演化情況進(jìn)行分析，揭示犬博卡病毒在上海犬中的存在情況，為犬博卡病毒的致病性相關(guān)研究及潛在的犬博卡病毒傳染病的預(yù)警和防控提供科學(xué)依據(jù)和理論參考。

1 材料與方法

1.1 糞便樣品采集 自2019年6月至2019年12月，從上海市分別采集犬新鮮糞便206份，糞便樣品凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑 PBS磷酸鹽緩沖液購自Thermo公司；DNA提取試劑盒TIANamp Virus DNA/RNA Kit購自天根生化科技（北京）有限公司；PCR所用試劑購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒Gel Extraction Kit購自O(shè)MEGA公司。

1.3 糞便樣品處理 取-80℃保存的糞便樣品置于冰上融化，按照質(zhì)量體積比為1∶10的比例加入PBS磷酸鹽緩沖液，糞便懸液于渦旋儀劇烈震蕩5 min，然后4℃條件下12 000 ×g離心5 min，吸取200 μL上清液置于新的無菌1.5 mL離心管中，以備后續(xù)提取核酸使用。

1.4 DNA提取及反轉(zhuǎn)錄 糞便樣品按照DNA提取試劑盒TIANamp Virus DNA/RNA Kit試劑盒說明書提取病毒DNA，提取出的DNA用60 μL的無RNase水溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCR擴(kuò)增 根據(jù)參考文獻(xiàn)[8]合成能夠特異性擴(kuò)增CBoV1、CBoV2和CBoV3三種基因型的通用引物，CBoV-F：5'-AARAGRAARCTYTATTTTGC-3'，CBoV-R：5'-TGCCAGTCTTGWGGHGARAA-3'。以糞便cDNA樣品為模板對(duì)CBoV片段進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增CBoV1、CBoV2和CBoV基因片段大小分別為377、386、404 bp。PCR反應(yīng)體系（50 μL）為：dNTP Mixture（2.5 mmol/L）8 μL，10× LATaqbuffer 5 μL，LATaq0.5 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 33.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，56℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，共32個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化，膠回收產(chǎn)物送生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序鑒定。

1.6 CBoV全基因擴(kuò)增 根據(jù)NCBI公布的基因序列（GenBank登錄號(hào)：KY038922）設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物（表1），擴(kuò)增陽性樣品中CBoV的全基因序列。根據(jù)SMART RACE cDNA Amplification Kit試劑盒說明書擴(kuò)增CBoV基因組的5' RACE和3' RACE。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化，膠回收產(chǎn)物送生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序鑒定。

表1 PCR擴(kuò)增引物Table 1 The primers of the PCR amplification

1.7 序列分析 PCR擴(kuò)增序列經(jīng)SeqMan軟件組裝成完整的CBoV基因組，利用NCBI的ORF Finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）查找病毒基因組開放閱讀框，通過MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與討論

2.1 CBoV PCR檢測(cè) 采集的206份糞便處理后經(jīng)PCR擴(kuò)增后發(fā)現(xiàn)其中有3份樣品呈現(xiàn)CBoV陽性，對(duì)擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示擴(kuò)增出的核酸片段為CBoV序列。對(duì)序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，3條序列間的同源性為94.5%～99.9%，由此推測(cè)擴(kuò)增出的3種CBoV屬于同一種屬。以上結(jié)果表明所采集的犬糞便中含有CBoV，CBoV的陽性率約為1.5%。

2.2 CBoV全基因擴(kuò)增 為了進(jìn)一步了解CBoV基因組特性，我們根據(jù)NCBI公布的基因序列（GenBank登錄號(hào)：KY038922）設(shè)計(jì)并合成了3對(duì)特異性擴(kuò)增引物，擴(kuò)增CBoV的全基因序列。擴(kuò)增的PCR序列經(jīng)3次重復(fù)驗(yàn)證無誤后，利用SeqMan軟件組裝成完整的CBoV基因組。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)CBoV基因組全長(zhǎng)5246 bp，包含249 bp的5' UTR，4853 bp的開放閱讀框和144 bp的3' UTR（圖1）。CBoV基因組中A+T的含量占50.3%，G+C的含量占49.7%。通過ORF Finder查找CBoV的主要開放閱讀框發(fā)現(xiàn)，CBoV主要編碼三種蛋白：非結(jié)構(gòu)蛋白（non-structural protein,NS）編碼基因位于基因組250～2631 bp，核衣殼蛋白（nucleoprotein,NP）編碼基因位于基因組2396～2983 bp，病毒衣殼蛋白（VP1/2）編碼基因位于基因組2967～5102 bp。

圖1 CBoV基因組結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic representation of CBoV genome organization

2.3 CBoV基因進(jìn)化樹分析 為了進(jìn)一步比較檢測(cè)出的CBoV與其他種屬CBoV的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，我們把CBoV基因組全長(zhǎng)、NS1基因、NP1基因和VP1基因分別與已報(bào)道的其他博卡病毒基因組進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增出的CBoV基因型屬于CBoV2（圖2）。從系統(tǒng)進(jìn)化樹中可以看出擴(kuò)增出的CBoV與香港（JQ692591）、韓國(guó)（KP281720）和廣州（KY038922）等亞洲分離株親緣關(guān)系較近，處于同一個(gè)分支，同屬于CBoV2。

圖2 CBoV進(jìn)化樹分析Fig.2 Phylogenetic analysis of CBoV

近年來，新發(fā)和再現(xiàn)的病毒性傳染病不斷出現(xiàn)，嚴(yán)重威脅著人類與動(dòng)物的健康，逐漸成為全球關(guān)注的重要公共衛(wèi)生問題。尤其是近幾年對(duì)人類健康造成重大威脅的人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus,HIV）、埃博拉病毒（Zaire Ebola virus,EBOV）、嚴(yán)重急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrome coronavirus-2,SARS-CoV）、中東呼吸綜合征病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV）以及2019年底暴發(fā)的新型冠狀病毒SARS-CoV-2等[11-13]，這些病毒性傳染病的最初宿主都是動(dòng)物，病毒在其不斷的遺傳演化過程中逐漸突破物種屏障，通過與人類接觸，最終感染人類。犬作為人類的伴侶動(dòng)物，與人接觸比較頻繁，其攜帶的病原體容易對(duì)人的健康造成潛在的威脅，因此及時(shí)對(duì)犬?dāng)y帶病毒進(jìn)行調(diào)查，掌握病毒的遺傳變異情況，能夠?yàn)榉揽貪撛诘娜磦魅静√峁﹨⒖肌?/p>

博卡病毒能夠感染人、犬、貓、豬、牛和大猩猩等多種哺乳動(dòng)物，感染宿主較為廣泛。人博卡病毒的感染與呼吸道癥狀相關(guān)，在2016—2018年廣州地區(qū)急性呼吸道感染（acute respiratory tract infection,ARTIs）兒童中的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，博卡病毒的總檢出率為4.24%，而≤2歲患兒感染率為86.98%，表明了博卡病毒是誘發(fā)部分嬰幼兒喘息性疾病的重要病原體[14]。2014—2015年黑龍江牡丹江地區(qū)腹瀉犬糞便樣品中CBoV的陽性率高達(dá)20%，推測(cè)犬博卡病毒可能與犬病毒性腹瀉相關(guān)[15]，然而也有學(xué)者從健康犬中檢測(cè)到CBoV的存在[8]，因此對(duì)于犬博卡病毒的流行情況與治病情況還有待于進(jìn)一步研究。我們?cè)谏虾５貐^(qū)犬糞便樣本中檢測(cè)到CBoV，通過基因組比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)檢測(cè)出的CBoV屬于CBoV2，與其他亞洲分離株親緣關(guān)系較近，處于同一個(gè)分支。CBoV的流行病學(xué)調(diào)查和基因組特征分析有助于監(jiān)測(cè)CBoV在犬中的流行情況，評(píng)估對(duì)于犬健康的潛在威脅，為CBoV的致病性研究及潛在的傳染病預(yù)警和防控提供科學(xué)依據(jù)和理論參考。