戊型肝炎病毒研究進(jìn)展

李獲朋，胡重重，鄭 宇，田月薇，陳昭慧，劉 波，楊憶斐，劉天龍，佘銳萍，米榮升，石蕊寒，尹文嬌，肖 鵬，田紀(jì)景

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193；2.北京市房山區(qū)新農(nóng)村建設(shè)服務(wù)中心，北京 102488；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；4.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100097；5.中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，北京 102206；6.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，昆明 650201）

戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus,HEV）是一種重要的人畜共患病原，也是全球范圍內(nèi)引起急性病毒性肝炎的主要原因。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球每年約有2000萬人感染HEV，其中約有330萬臨床病例，導(dǎo)致4.4～7萬人死亡。HEV可感染多種家畜、家禽以及其他經(jīng)濟(jì)動物，對動物生產(chǎn)以及人類動物源食品安全造成了嚴(yán)重的威脅。因此，了解HEV的流行病學(xué)、病原學(xué)及其對人類和動物健康的損傷，有助于預(yù)防病毒感染以及臨床治療藥物開發(fā)。

1 流行病學(xué)

1.1 HEV的全球分布及其生活史

HEV是目前已知的5種肝炎病毒之一，病毒分類學(xué)研究將其劃歸為戊型肝炎病毒科，其又可分為兩個屬，即正戊型肝炎病毒屬（Orthohepevirus）和魚戊型肝炎病毒屬（Piscihepevirus）。目前研究較多的哺乳動物和禽類HEV均屬于正戊型肝炎病毒屬，其主要分為A-D 4個種[1]，A種群可感染人、家豬、野豬、鹿類和兔等，包含至少8個基因型，HEV-1和HEV-2僅感染人類，主要流行于亞洲、非洲和拉丁美洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)；HEV-3和HEV-4屬于人獸共患病毒，在全球范圍內(nèi)均有流行；HEV-5和HEV-6僅在野豬中發(fā)現(xiàn)，HEV-7和HEV-8分別在阿拉伯單峰駱駝和中國雙峰駱駝中發(fā)現(xiàn)[2]；B為禽類HEVs，感染家禽和野生鳥類；C可感染鼠、雪貂和狐貍；D在蝙蝠、鹿和紅隼中發(fā)現(xiàn)。HEV基因型多樣性最大的地區(qū)是東南亞，而目前我國HEV流行基因型也已經(jīng)從最初以HEV-1為主變成以人獸共患的HEV-4型為主（圖1）。

圖1 HEV-4、HEV-3、HEV-1和HEV-2全球分布Fig.1 Global distribution of HEV-4,HEV-3,HEV-1 and HEV-2

目前，HEV的生活史比較模糊，其侵入細(xì)胞的過程和宿主對應(yīng)受體尚不清楚。Kenney等[3]認(rèn)為，無囊膜的HEV（non-enveloped HEV,neHEV）粒子與細(xì)胞表面的硫酸肝素蛋白多糖（Heparin sulfate proteoglycan,HSPGs）[4]以及熱休克同源蛋白70（Heat shock homologous protein 70,HSP70）等受體結(jié)合，隨即病毒粒子通過動態(tài)蛋白-2（Dynamic protein-2）、網(wǎng)格蛋白（Clathrin）和膽固醇（Cholesterol）介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞[5]；而有囊膜的HEV（quasi-enveloped HEV,eHEV）粒子則可直接通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的信號通路進(jìn)入細(xì)胞，隨后在HSP90和Grp78作用下將病毒運(yùn)送到釋放基因組的位點(diǎn)。一旦釋放到細(xì)胞質(zhì)中，正鏈RNA作為信使RNA（messenger RNA,mRNA）翻譯出開放閱讀框（open reading frame 1,ORF1）。在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（rough endoplasmic reticulum,RER）或RER衍生的膜小泡中[6]，ORF1編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白在宿主蛋白（包括延伸起始因子）和病毒蛋白（如：ORF4編碼的蛋白）的參與下將正鏈RNA基因組轉(zhuǎn)錄成負(fù)鏈中間產(chǎn)物，后者翻譯出ORF2和ORF3蛋白[7]。在病毒裝配且在向質(zhì)膜移動的過程中，ORF2與病毒基因組RNA結(jié)合并開始多聚，此時ORF3參與進(jìn)來，通過ORF3蛋白與宿主空泡分選蛋白（如腫瘤抑制基因101）的相互作用，病毒顆粒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)小泡并在質(zhì)膜處進(jìn)行釋放[8-10]。經(jīng)宿主消化系統(tǒng)，病毒囊膜會丟失。而釋放到血液中的HEV似乎保留了為了躲避宿主免疫系統(tǒng)的囊膜[3]（圖2）。

1.2 HEV對于社會生產(chǎn)實(shí)踐的影響 HEV因其廣泛的宿主適應(yīng)性，不僅危害人類和動物的健康，同時也影響到動物源食品的安全。在禽類，HEV感染往往與其他病毒感染同時存在，如禽白血病病毒（Avian leukemia virus,ALV）、禽腺病毒（Avian adenovirus,FAdV）和雞傳染性貧血病毒（Avian infectious anemia virus,CIAV）[11]。我們在獸醫(yī)臨床中也發(fā)現(xiàn)HEV與豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus 2,PCV2）共感染的病例[12]。而近年在中國更是有人群聚集性感染HEV的相關(guān)報道，如2018年7月在山東青島就有一起因食用了未徹底加熱的豬肝而導(dǎo)致41人（14.5%，41/283）急性感染HEV事件，其中21人表現(xiàn)出臨床癥狀，經(jīng)基因組學(xué)分析確診為HEV-4型感染[13]。因此，HEV作為一種重要的人獸共患病原，其對人類健康、畜牧獸醫(yī)生產(chǎn)以及動物源食品安全的潛在危害不容小覷。

2 HEV病原學(xué)研究

2.1 HEV病毒粒子結(jié)構(gòu) HEV是單股正鏈RNA病毒，病毒基因組為7.2～7.4 kb。該病毒在無囊膜狀態(tài)下直徑為27～34 nm，其基因組由4個開放閱讀框組成，即ORF1、ORF2、ORF3和ORF4（僅存在于HEV-1）（圖3）。病毒基因組5'端是以7-甲基鳥嘌呤開頭的非翻譯區(qū)（具有27個核苷酸），后接ORF1編碼區(qū)。ORF1是一個大的非結(jié)構(gòu)蛋白，包括多個功能域，如甲基轉(zhuǎn)移酶（methyltransferase）、假定的木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶（papain-like cysteine protease,PCP）、X域、解旋酶和RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase,RdRp），這些功能域決定了ORF1在HEV基因組復(fù)制方面的能力[14]。ORF2將寡聚形成二十面體衣殼，包裹病毒RNA。最近有研究報道ORF2衣殼蛋白有三種形式，即感染性/細(xì)胞內(nèi)ORF2（ORF2i）、糖基化ORF2（ORF2g）和切割ORF2（ORF2c）。ORF2i蛋白使得HEV顆粒具有感染能力，而ORF2g和ORF2c蛋白與HEV顆粒的感染性無關(guān)[15]。因此，推測機(jī)體對HEV過量的免疫反應(yīng)極有可能是對后兩者的反應(yīng)，這可能是HEV免疫逃逸的機(jī)制之一。目前普遍認(rèn)為ORF3是HEV RNA的重要離子通道，其除了可以磷酸化外，N端的半胱氨酸殘基還可被一種尚未確認(rèn)的棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶棕櫚?；?，該轉(zhuǎn)移酶不僅決定其膜結(jié)合位點(diǎn)和亞細(xì)胞定位，也是細(xì)胞釋放感染性病毒過程所必需的酶[16]。ORF4可編碼一個20 kDa的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白，該蛋白與宿主和病毒蛋白相互作用，控制病毒遺傳物質(zhì)依賴的RNA聚合酶的活性[17]。因此，推測ORF1和ORF2決定了病毒的宿主特異性，ORF3與HEV感染性相關(guān)。

圖3 HEV RNA模式圖Fig.3 HEV RNA diagram

2.2 HEV-1型和HEV-2型 HEV-1與HEV-2僅感染人類，主要經(jīng)過糞-口途徑或受污染的水源傳播，孕婦感染有更嚴(yán)重的臨床癥狀。懷孕可能會導(dǎo)致HEV復(fù)制效率增高，病毒血癥持續(xù)時間較長。研究發(fā)現(xiàn)，HEV-1可以使蛻膜和胎盤基質(zhì)中的趨化因子、生長因子等分泌紊亂，從而利于HEV-1傳播，同時也會導(dǎo)致組織損傷[18]。HEV-2感染孕婦的致死率可達(dá)25%，這可能是由于肝臟生物合成受阻、代謝紊亂等因素造成，此外也表現(xiàn)出早產(chǎn)、流產(chǎn)與死胎。HEV-2也通常在年輕人中引起短暫急性自限肝炎，臨床癥狀與其他急性病毒性肝炎沒有區(qū)別。

HEV-1型曾在我國新疆等地暴發(fā)過，導(dǎo)致數(shù)十萬人感染[19]。近十年來，隨著我國公共衛(wèi)生環(huán)境的改善，HEV-1的感染率逐年下降。有相關(guān)文獻(xiàn)指出，HEV感染可能已由HEV-1為主的形式轉(zhuǎn)變?yōu)橐訦EV-4為主，并偶爾呈散發(fā)性流行或聚集性暴發(fā)[13,20]。

2.3 HEV-3型和HEV-4型 這兩種基因型HEV為人獸共患病原，廣泛分布于全球各地，但其主要宿主為家豬和野豬。HEV-3可在免疫功能低下的患者中呈現(xiàn)慢性感染；而由HEV-4導(dǎo)致的慢性感染也有零星報道[21]。慢性感染最顯著的肝外表現(xiàn)包括格林-巴利綜合征（Guillain-Barre syndrome,GBS）、神經(jīng)性肌萎縮癥（Neuralgia muscle atrophy,NA）、腦膜腦炎、多發(fā)性神經(jīng)炎等的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[22]以及膜增生性腎小球腎炎、冷球蛋白血癥（Cryoglobulinemia）等癥狀的腎臟損傷[23]。日本的一項全國性調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在2625名實(shí)體器官移植患者（99名心臟移植患者和2526名腎臟移植患者）中，有12名HEV陽性患者，其中42%的患者發(fā)展為慢性肝炎[24]。Sooryanarain等[25]研究指出，慢性戊型肝炎病例在接受心臟、肝臟、肺臟或腎臟移植的患者中較為常見。由此可見，HEV-3型和HEV-4型慢性感染及其所導(dǎo)致的肝外損傷值得特別關(guān)注。

2.4 HEV-5～HEV-8型 這幾種基因型HEV主要在動物中有報道，但近年也證實(shí)了從野生環(huán)境中分離出的HEV-5可感染非人靈長類動物，充分說明其在人群中具有潛在的傳播風(fēng)險[26]。HEV-7和HEV-8分別在阿拉伯單峰駱駝和中國雙峰駱駝體內(nèi)被檢測到[2]，而前者已在肝移植受體患者中發(fā)現(xiàn)[27]。鑒于這幾種類型HEV發(fā)現(xiàn)較晚，其在人群和動物的感染和流行情況還有待于進(jìn)一步的調(diào)查研究。

3 HEV感染對機(jī)體的損傷及其致病機(jī)制

3.1 戊型肝炎臨床癥狀及肝臟損傷 在散發(fā)HEV感染病例中，最常見的是引起黃疸、發(fā)熱和腹痛，也可表現(xiàn)為急性或慢性肝病從而導(dǎo)致急性呼吸困難，腹水和出血。在發(fā)達(dá)國家，大多數(shù)老年男性感染后表現(xiàn)為急性、自限性疾病；若既往有肝病史的患者將會存在肝衰竭、肝硬化和慢性肝炎的風(fēng)險。感染初期，谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase,ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase,AST）明顯升高；Malcolm等[28]研究顯示HEV感染引起肝細(xì)胞凋亡、局灶性壞死以及細(xì)胞質(zhì)膽紅素沉積。Liu等[29]研究表明在HEV感染沙鼠后，沙鼠肥大細(xì)胞數(shù)目明顯高于對照組，說明肥大細(xì)胞在HEV引起的肝損傷過程中發(fā)揮重要作用。

3.2 消化系統(tǒng)是HEV侵入機(jī)體的第一道防線 HEV作為一種可經(jīng)糞-口途徑傳播的病毒，腸道是其侵入機(jī)體的第一道障礙。Mao等[30]研究發(fā)現(xiàn)，感染沙鼠的十二指腸、空腸、回腸的黏膜上皮處檢測到了HEV的抗原陽性信號。Marion等[31]研究發(fā)現(xiàn)，HEV可在腸上皮細(xì)胞中復(fù)制，并在HEV感染患者十二指腸和回腸的深層腸隱窩中檢測到ORF2蛋白。另外，胰腺炎的發(fā)生也與HEV感染有潛在聯(lián)系[32]。深入研究HEV在消化道，特別是腸道黏膜上皮細(xì)胞的定植和傳播，以及腸道黏膜免疫是否參與HEV感染和逃逸過程的研究，將有助于揭示HEV入侵和感染機(jī)體的分子機(jī)制。

3.3 HEV感染引起泌尿系統(tǒng)組織損傷 除消化系統(tǒng)外，腎臟也是HEV感染的潛在靶器官之一。Geng等[33]在自然感染HEV患者和人為感染HEV猴的尿液中均檢測到了HEV RNA和ORF2抗原，并在猴腎臟檢測到ORF2蛋白陽性以及觀察到腎小管蛋白管型和間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤。Wu等[34]也在HEV感染實(shí)驗兔腎臟中檢測到HEV RNA陽性。HEV侵入腎臟并引起泌尿系統(tǒng)損傷的機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

3.4 HEV感染引起生殖系統(tǒng)損傷 妊娠期雌性生殖系統(tǒng)是HEV侵入機(jī)體主要攻擊目標(biāo)之一。盡管孕婦高死亡率的致病機(jī)制尚未完全被解析，但通常歸因于宿主遺傳背景、妊娠期激素水平和機(jī)體免疫力的改變。Xia等[35]利用兔模型證實(shí)，HEV是通過進(jìn)入胎盤中復(fù)制并完成垂直傳播的，且母乳中未檢測到HEV。An等[36]研究顯示豬源HEV可以感染兔并在其卵巢中復(fù)制，卵巢間質(zhì)和卵泡細(xì)胞表現(xiàn)出分散性壞死，淋巴細(xì)胞浸潤以及卵巢組織中出現(xiàn)細(xì)胞加速凋亡的現(xiàn)象，并且感染了HEV的卵子一旦受精，病毒便可以進(jìn)入受精卵。

對于雄性生殖系統(tǒng)，HEV抗原蛋白可在睪丸間質(zhì)細(xì)胞（Leydig cells,LCs）和曲細(xì)精管周圍肌樣細(xì)胞（Myoid cells around testicular tubule,TPC）中被檢測到，此外即使血液中病毒被清除后，仍可在睪丸中長期被檢測到[37]。Soomro等[38]的研究發(fā)現(xiàn)，HEV感染沙鼠的睪丸支持細(xì)胞排列松散，細(xì)胞核固縮，腔內(nèi)生殖細(xì)胞脫落，并形成多核巨細(xì)胞，生精小管基底膜變薄。精原細(xì)胞和生精細(xì)胞排列松散、稀疏和無序，細(xì)胞發(fā)生變性、壞死，附睪內(nèi)的精子密度較低，導(dǎo)管結(jié)構(gòu)發(fā)生畸變。但目前尚未有證據(jù)表明HEV感染與男性不育有必然聯(lián)系。

3.5 免疫系統(tǒng)參與HEV的識別及慢性感染過程 HEV感染在免疫抑制患者（如器官移植、HIV感染）中常呈現(xiàn)慢性，但有研究表明在有系統(tǒng)性紅斑狼瘡病的人群中也可觀察到慢性HEV感染[39]；與健康人相比，免疫功能正常的急性戊型肝炎患者，其外周血中NK細(xì)胞的比例略低，活化NK細(xì)胞比例卻較高[44]，所以推測NK細(xì)胞在病毒清除過程中起著重要的作用。另外，研究發(fā)現(xiàn)RIG-I信號通路參與識別HEV抗原蛋白和HEV RNA 3'端非編碼區(qū)的核苷酸序列，并可進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞干擾素基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)上調(diào)，從而發(fā)揮抗病毒效應(yīng)[41-44]。

3.6 HEV可在神經(jīng)系統(tǒng)中復(fù)制并引起神經(jīng)癥狀 神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥是HEV感染最為常見的癥狀，也是最受人們關(guān)注的一點(diǎn)。Shi等[45]的研究發(fā)現(xiàn)，HEV可以感染沙鼠腦和脊髓組織并在其中復(fù)制，且感染沙鼠腦組織中緊密連接蛋白ZO-1（Zonula occlidens-1）表達(dá)量下降，而星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著增加。這一結(jié)果證實(shí)HEV能夠破壞血腦屏障（Blood brain barrier,BBB），并與神經(jīng)系統(tǒng)損傷有直接關(guān)系。HEV感染引起的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥主要有兩種臨床表現(xiàn)：第一種是有周圍神經(jīng)參與，最常見的表現(xiàn)為GBS和NA。第二種是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，表現(xiàn)為腦膜炎（Meningitis）、腦炎（Encephalitis）等。雖并不是所有GBS都由HEV感染所致，但不可否認(rèn)HEV確實(shí)是GBS發(fā)生的一個重要誘因，與GBS不同，已有研究證實(shí)了HEV與NA的關(guān)系，該研究結(jié)果顯示在47名NA患者中，所有患者都有HEV感染病史[46]，有5名（10.6%）有近期HEV感染的血清學(xué)證據(jù)。在動物模型中，HEV感染則可引起病毒性腦炎相關(guān)的病理變化，血腦屏障的破壞以及線粒體介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡是HEV引起神經(jīng)系統(tǒng)損傷的潛在原因[47-48]。而HEV突破血腦屏障并引起神經(jīng)系統(tǒng)損傷的分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究。

4 細(xì)胞和動物模型研究進(jìn)展

HEV體外培養(yǎng)和動物感染實(shí)驗在近年取得了較大的進(jìn)步。目前，比較常用的細(xì)胞包括HepG2、PLC/PRF/5、Huh7、A549、Caco-2、PK-15和ST等；兔、豬、沙鼠以及非人靈長類動物等也已被證實(shí)可成功感染HEV。

4.1 細(xì)胞模型 HEV細(xì)胞感染模型最常用的有PLC/PRF/5和A549等，其還可在極化的Caco-2細(xì)胞中復(fù)制，并且能從細(xì)胞頂膜釋放，而HEV-1型和3型可在JEG-3細(xì)胞中復(fù)制。人原代肝細(xì)胞（Primary human hepatocytes,PHHs）和少突膠質(zhì)細(xì)胞系也被用于HEV體外感染。另外，多能干細(xì)胞（Pluripotent stem cells，hESC/iPSC）誘導(dǎo)的肝細(xì)胞樣細(xì)胞（Hepatocyte like cells,HLCs）也是一個在HEV研究中很有意義的細(xì)胞系[49]。

4.2 動物模型 HEV感染豬的動物模型不僅成功證實(shí)HEV是嗜肝病毒，并且發(fā)現(xiàn)它可在肝外組織中復(fù)制，如小腸、淋巴結(jié)和結(jié)腸[50]。Cao等[51]建立了在免疫抑制條件下慢性HEV感染豬的動物模型，而這種模型將有助于開發(fā)針對慢性HEV感染的治療藥物。除此之外，豬作為HEV的保存宿主亦可作為生產(chǎn)HEV抗體的試驗動物。

兔也可作為研究HEV跨種間感染的動物模型。兔易感HEV-3型，但也可感染其他型，因此，可作為動物模型用于研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病和妊娠期感染。研究發(fā)現(xiàn)，在HEV感染的孕兔體內(nèi)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、TNF-α和IFN-γ水平顯著升高[52]。另外，兔也被用于戊型肝炎疫苗研究。如Chen等[53]利用HEV-4型不同的三個ORF2多肽片段完全保護(hù)了兔子免受豬源HEV感染。

嚙齒類也是重要的實(shí)驗動物。但直到最近，才有報道大鼠HEV毒株LA-B350能夠有效的感染裸鼠[54]。然而，Schlosser等[55]研究發(fā)現(xiàn)Wistar大鼠似乎對HEV-1、HEV-3和HEV-4型具有一定抵抗力。具體能否作為模型還有待進(jìn)一步研究。事實(shí)上，人肝嵌合鼠不乏是一種有效的動物模型。Sayed等[56]通過HEV-3感染人肝嵌合鼠模型證實(shí)了ORF2-Ag可用作活動性HEV感染的標(biāo)志物，可用于評估抗病毒治療的效果。長爪沙鼠也是研究HEV致病機(jī)制常用的實(shí)驗動物，研究發(fā)現(xiàn)，在感染沙鼠的多個組織器官，包括肝臟、睪丸、腦和脊髓等組織均可檢測到HEV RNA陽性或抗原蛋白的表達(dá)[29,38,45]。

雞是禽HEV的宿主，HEV通過糞-口途徑在雞群間傳播。雞模型已被證明在疫苗研究中有不可磨滅的作用，Wang等[57]使用pTX8048載體構(gòu)建了以O(shè)RF2為抗原基礎(chǔ)的三種口服疫苗，可以有效控制雞的aHEV感染。

除此之外，雪貂等已經(jīng)被證明可以作為研究HEV感染和致病機(jī)制的動物模型。Wang等[58]的研究結(jié)果顯示，在我國實(shí)驗雪貂和養(yǎng)殖雪貂中均檢測到不同的戊型肝炎病毒C2基因型；而Li等[59]在一篇HEV動物模型的文章中明確指出雪貂在持續(xù)性戊型肝炎研究領(lǐng)域的重要意義。

5 目前存在的問題以及展望

HEV在全球廣泛分布和流行，對人類健康造成嚴(yán)重隱患?？茖W(xué)證據(jù)已充分證明了豬、鹿以及其他動物性食品，成為了人類感染HEV-3型或4型的重要來源。關(guān)于HEV的生活史，Kenney等[3]提出了一個相對完善的模型，但有關(guān)HEV進(jìn)入細(xì)胞所依賴的具體蛋白還未完全闡明。HEV的肝外損傷成為近年的熱門方向，但大多停留在現(xiàn)象的觀察上，對于入侵途徑、致病機(jī)制等問題的研究還比較欠缺。除此之外，有關(guān)HEV的病毒純化仍存在一定困難。綜上所述，HEV感染雖是以引起肝臟損傷為主，但肝外癥狀也受到人們越來越多的關(guān)注，完善HEV動物和細(xì)胞培養(yǎng)模型，將有助于揭示HEV的生活史、感染史和致病機(jī)制，以及抗病毒藥物和治療藥物的開發(fā)。