白藜蘆醇對(duì)ZEN 誘導(dǎo)的豬小腸上皮細(xì)胞損傷的作用效果研究

韓婧娥，王歡歡，李鵬程，佘福澤，黎肖昱，秦順義

（天津農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300392）

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）是鐮刀菌屬產(chǎn)生的真菌毒素，廣泛存在于各種糧食作物與飼料原料中[1-2]。ZEN 主要表現(xiàn)為生殖毒性，同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生免疫毒性、細(xì)胞毒性及氧化損傷等毒性[3-4]；ZEN 的細(xì)胞毒性可造成細(xì)胞的氧化損傷，并抑制細(xì)胞增殖[5]。白藜蘆醇是從植物中提取的非黃酮類多酚化合物，具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)能量代謝、調(diào)節(jié)腸道、調(diào)節(jié)免疫等作用[6]。文獻(xiàn)報(bào)道具有抗氧化特性的多種物質(zhì)均對(duì)ZEN 具有拮抗效果[7-9]，但未見將白藜蘆醇應(yīng)用于緩解ZEN 對(duì)腸道的毒性作用研究。本項(xiàng)目研究白藜蘆醇對(duì)ZEN 誘導(dǎo)的豬腸上皮細(xì)胞損傷的作用效果，旨在為緩解ZEN 危害提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞

豬小腸上皮細(xì)胞（IPEC-J2）細(xì)胞系（天津市畜牧獸醫(yī)研究所饋贈(zèng)）。

1.1.2 主要試劑與儀器

玉米赤霉烯酮（上海源葉生物科技有限公司），CCK8 檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），乳酸脫氫酶（LDH）檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）檢測(cè)試劑盒、總抗氧化能力（T-AOC）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物技術(shù)研究所），cDNA 試劑盒、SYBR Green qPCR Mix（Genecopoeia 公司）。iMark 酶標(biāo)儀、CFX96 熒光定量PCR 儀（BIO-RAD 公司）。

1.2 方法

1.2.1 白藜蘆醇對(duì)ZEN 誘導(dǎo)的IPEC-J2 細(xì)胞活力測(cè)定

將細(xì)胞含量調(diào)至105個(gè)/mL，以每孔100 μL 接種于96 孔板中，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至70%時(shí)，開始試驗(yàn)。試驗(yàn)分為5 組：C 組（對(duì)照組）、Z 組（ZEN 濃度25 μg/mL）、ZR1 組（25 μg/mL ZEN＋10 μmol/L 白藜蘆醇）、ZR2 組（25 μg/mL ZEN＋20 μmol/L 白藜蘆醇）、ZR3 組（25 μg/mL ZEN＋30 μmol/L 白藜蘆醇），每組重復(fù)4 次。C 組和Z 組使用普通培養(yǎng)液，ZR1 組、ZR2 組、ZR3 組分別使用含白藜蘆醇10μmol/L、20 μmol/L 和30 μmol/L 的培養(yǎng)液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h 后，向Z 組、ZR1 組、ZR2組、ZR3 組加入ZEN 使其濃度為25 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，各孔均加入CCK8 10 μL，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h 后，用酶標(biāo)儀在450 nm 處測(cè)定各孔吸光度，計(jì)算細(xì)胞活力：細(xì)胞活力（%）＝（OD試驗(yàn)－OD空白對(duì)照）（/OD陰性對(duì)照－OD空白對(duì)照）×100%。

1.2.2 白藜蘆醇對(duì)ZEN 誘導(dǎo)的IPEC-J2 細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH 活性測(cè)定

試驗(yàn)分組及處理同1.2.1。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，利用乳酸脫氫酶（LDH）檢測(cè)試劑盒測(cè)定各孔LDH 活性；計(jì)算公式為：LDH 活性（U/L）＝（OD測(cè)定－OD對(duì)照）/（OD標(biāo)準(zhǔn)－OD空白）×0.2×1 000。

1.2.3 白藜蘆醇對(duì)ZEN 誘導(dǎo)的IPEC-J2 細(xì)胞抗氧化酶水平測(cè)定

將細(xì)胞含量調(diào)至106個(gè)/mL，以每孔2 000 μL接種于6 孔板中，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至70%時(shí)，開始試驗(yàn)。試驗(yàn)分組及處理同1.2.1。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)移細(xì)胞至EP 管中，加入預(yù)先冷卻的細(xì)胞裂解液，低溫超聲波破碎細(xì)胞后，離心、取上清測(cè)定細(xì)胞SOD、T-AOC 和MDA 的水平。

1.2.4 白藜蘆醇對(duì)ZEN 誘導(dǎo)的IPEC-J2 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA 表達(dá)水平測(cè)定

依據(jù) GenBank 中豬腸上皮細(xì)胞β-actin、Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2 和bax 基因的參考序列，采用Primer 3 進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物信息見表1。細(xì)胞分組及處理同1.2.3，細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，常規(guī)提取總RNA，利用First-Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；然后用熒光定量PCR 儀檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)ZEN 誘導(dǎo)的IPEC-J2 細(xì)胞β-actin、caspase 3、caspase 9、Bcl-2 和bax 基因mRNA 表達(dá)水平，通過2-ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)體系組成如下：cDNA 3.0 μL、S Primer（10 pmol）2.0 μL、A Primer（10 pmol）2.0 μL、qPCR Mix 9.0 μL 補(bǔ)加ddH2O 至20 μL。反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性20 s，56 ℃退火25 s，72 ℃延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)。熔解程序：65 ℃，0.05s；95 ℃，0.5 s。

表1 β-actin、caspase 3、caspase 9、Bcl-2 和bax引物序列

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

測(cè)定值以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（one way-ANOVA），若存在差異顯著性，再進(jìn)行多重比較（SNK 法）。P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對(duì)ZEN 誘導(dǎo)的IPEC-J2 細(xì)胞活力的影響

由圖1 可知，Z 組IPEC-J2 細(xì)胞細(xì)胞活力極顯著低于C組（P＜0.01），ZR2 組和ZR3 組IPEC-J2細(xì)胞細(xì)胞活力極顯著高于Z 組（P＜0.01）；ZR2組和ZR3 組IPEC-J2 細(xì)胞細(xì)胞活力極顯著或顯著高于ZR1 組（P＜0.01 或P＜0.05）；ZR1 組IPEC-J2細(xì)胞細(xì)胞活力與Z 組相比無顯著差異（P＞0.05）。

圖1 白藜蘆醇對(duì)ZEN 誘導(dǎo)的IPEC-J2 細(xì)胞活力（%）的影響

2.2 白藜蘆醇對(duì)ZEN 誘導(dǎo)的IPEC-J2 細(xì)胞LDH活性的影響

由圖2 可知，Z 組IPEC-J2 細(xì)胞LDH 活性極顯著高于C組（P＜0.01），ZR2 組和ZR3 組IPEC-J2細(xì)胞LDH 活性極顯著低于Z 組（P＜0.01），ZR1組IPEC-J2細(xì)胞LDH活性顯著低于Z 組（P＜0.05）；ZR2 組和ZR3 組IPEC-J2 細(xì)胞LDH 活性顯著低于ZR1 組（P＜0.05）；ZR2 組和ZR3 組IPEC-J2 細(xì)胞LDH 活性與C 組相比無顯著差異（P＞0.05）。

圖2 白藜蘆醇對(duì)ZEN誘導(dǎo)的IPEC-J2細(xì)胞LDH活性（U/L）的影響

2.3 白藜蘆醇對(duì)ZEN 誘導(dǎo)的IPEC-J2 細(xì)胞抗氧化酶水平的影響

由表2 可知，Z 組IPEC-J2 細(xì)胞SOD 活性和T-AOC 水平極顯著低于C 組（P＜0.01），ZR2 組和ZR3 組IPEC-J2 細(xì)胞SOD 活性和T-AOC 水平極顯著高于Z 組（P＜0.01），ZR2 組和ZR3 組IPEC-J2 細(xì)胞SOD 活性和T-AOC 水平極顯著或顯著高于ZR1 組（P＜0.01 或P＜0.05），ZR3 組IPEC-J2 細(xì)胞SOD活性顯著高于ZR2 組（P＜0.05），ZR1 組IPEC-J2 細(xì)胞SOD 活性和T-AOC 水平與Z組相比無顯著差異（P＞0.05）；Z 組IPEC-J2 細(xì)胞MDA 水平極顯著高于C 組（P＜0.01），ZR2 組和ZR3 組IPEC-J2 細(xì)胞MDA 水平極顯著低于Z 組（P＜0.01），ZR2 組和ZR3 組IPEC-J2 細(xì)胞MDA水平極顯著低于ZR1組（P＜0.01），ZR3組IPEC-J2細(xì)胞MDA 極顯著低于ZR2 組（P＜0.01），ZR1 組IPEC-J2 細(xì)胞MDA 水平與Z 組相比無顯著差異（P＞0.05）。

表2 白藜蘆醇對(duì)ZEN誘導(dǎo)的IPEC-J2 細(xì)胞抗氧化酶水平的影響

2.4 白藜蘆醇對(duì)ZEN 誘導(dǎo)的IPEC-J2 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA 表達(dá)水平的影響

由圖3 可知，Z 組IPEC-J2 細(xì)胞Capase-3和Capase-9基因mRNA 表達(dá)水平極顯著高于C 組（P＜0.01），ZR2 組和ZR3 組IPEC-J2 細(xì)胞Capase-3和Capase-9基因mRNA 表達(dá)水平極顯著低于Z 組（P＜0.01），ZR2 組和ZR3 組IPEC-J2細(xì)胞Capase-3和Capase-9基因mRNA 表達(dá)水平極顯著低于ZR1 組（P＜0.01），ZR3 組IPEC-J2細(xì)胞Capase-3和Capase-9基因mRNA 表達(dá)水平極顯著低于ZR2 組（P＜0.01），ZR1 組IPEC-J2細(xì)胞Capase-3和Capase-9基因mRNA 表達(dá)水平與Z 組相比無顯著差異（P＞0.05）。

圖3 白藜蘆醇對(duì)ZEN 誘導(dǎo)的IPEC-J2 細(xì)胞Capase-3 和Capase-9 基因mRNA 表達(dá)水平的影響

由圖4 可知，Z組IPEC-J2 細(xì)胞Bax基因mRNA表達(dá)水平極顯著高于C 組（P＜0.01），ZR1 組、ZR2 組和ZR3 組IPEC-J2 細(xì)胞Bax基因mRNA 表達(dá)水平極顯著低于Z 組（P＜0.01），ZR2 組和ZR3組IPEC-J2 細(xì)胞Bax基因mRNA 表達(dá)水平極顯著低于ZR1 組（P＜0.01），ZR3 組IPEC-J2 細(xì)胞Bax基因mRNA 表達(dá)水平極顯著低于ZR2 組（P＜0.01）；Z 組IPEC-J2 細(xì)胞Bcl-2基因mRNA 表達(dá)水平極顯著低于C組（P＜0.01），ZR2 組和ZR3 組IPEC-J2細(xì)胞Bcl-2基因mRNA 表達(dá)水平極顯著高于Z 組（P＜0.01），ZR2 組和ZR3 組IPEC-J2 細(xì)胞Bcl-2基因mRNA 表達(dá)水平極顯著或顯著高于ZR1 組（P＜0.01 或P＜0.05），ZR3 組IPEC-J2 細(xì)胞Bcl-2基因mRNA 表達(dá)水平與ZR2 組無顯著差異（P＞0.05），ZR1 組IPEC-J2 細(xì)胞Bcl-2基因mRNA 表達(dá)水平與Z 組相比也無顯著差異（P＞0.05）。

圖4 白藜蘆醇對(duì)ZEN 誘導(dǎo)的IPEC-J2 細(xì)胞Bax 和Bcl-2 基因mRNA 表達(dá)水平的影響

3 討論

3.1 白藜蘆醇對(duì)ZEN 誘導(dǎo)的IPEC-J2 細(xì)胞活力和LDH 活性的影響

ZEN 具有細(xì)胞毒性能夠抑制細(xì)胞增殖、降低細(xì)胞活性[5，10]。本研究結(jié)果表明ZEN 能顯著降低IPEC-J2 細(xì)胞的細(xì)胞活力，說明ZEN 同樣能夠抑制豬小腸上皮細(xì)胞增殖、降低豬小腸上皮細(xì)胞的存活率；類似的，許晴雨等研究表明，玉米赤霉烯酮能夠顯著降低小鼠細(xì)胞睪丸間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞活性，且玉米赤霉烯酮會(huì)使該細(xì)胞的細(xì)胞活性呈劑量依賴性降低[11]。現(xiàn)有的研究已證明ZEN 抑制細(xì)胞增殖、降低細(xì)胞活性與氧化損傷有關(guān)，因而從理論上講，抗氧化物質(zhì)能夠緩解ZEN 對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用和對(duì)細(xì)胞活性的降低作用；本研究結(jié)果也證實(shí)了具有抗氧化作用的白藜蘆醇能夠緩解ZEN 所致的IPEC-J2 細(xì)胞細(xì)胞活力降低。

乳酸脫氫酶作為一種存在于細(xì)胞質(zhì)中的酶，常被用作監(jiān)測(cè)細(xì)胞損傷的指標(biāo)，當(dāng)細(xì)胞損傷或凋亡時(shí)，乳酸脫氫酶就會(huì)被釋放到細(xì)胞外，監(jiān)測(cè)血液或細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶的水平，就能反映細(xì)胞的損傷程度。研究表明，玉米赤霉烯酮作用于睪丸支持細(xì)胞，乳酸脫氫酶的釋放量會(huì)隨著玉米赤霉烯酮濃度增加而增加，并且加重細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡[12]；本研究結(jié)果也表明，ZEN 能顯著增加IPEC-J2 細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH 活性。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)10 μmol/L、20 μmol/L 和30 μmol/L白藜蘆醇均能夠顯著緩解ZEN 所致的IPEC-J2 細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH 水平升高，進(jìn)一步說明了具有抗氧化作用的白藜蘆醇在一定程度上能夠緩解ZEN 對(duì)IPEC-J2 細(xì)胞的毒性作用。類似的，具有抗氧化作用的原青花素也能有效緩解玉米赤霉烯酮所致的體外培養(yǎng)的小鼠腸上皮細(xì)胞外乳酸脫氫酶含量升高[13]。

3.2 白藜蘆醇對(duì)ZEN 誘導(dǎo)的IPEC-J2 細(xì)胞抗氧化酶水平的影響

氧化損傷是ZEN 發(fā)揮毒性作用的主要途徑之一[14-15]，ZEN 會(huì)引發(fā)生物膜中多不飽和脂肪酸的脂質(zhì)過氧化作用，并形成脂質(zhì)過氧化物，而脂質(zhì)過氧化作用最終能導(dǎo)致很多脂類分解產(chǎn)物形成，其中部分引起細(xì)胞代謝及功能障礙、甚至死亡；同時(shí)，氧自由基也能通過脂氫過氧化物的分解產(chǎn)物引起細(xì)胞損傷[14-16]。ZEN 能降低抗氧化酶的活性并促進(jìn)活性氧產(chǎn)生，導(dǎo)致豬腸上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激，進(jìn)而誘發(fā)炎癥反應(yīng)[17]。大量研究表明，抗氧化物能夠有效緩解ZEN 對(duì)機(jī)體和細(xì)胞的氧化損傷作用，進(jìn)而緩解其毒性作用。例如原花青素可減輕ZEN誘導(dǎo)的TM4 和MODEK 細(xì)胞的氧化損傷與細(xì)胞凋亡[8,13]；槲皮素或番紅花也可通過降低活性氧水平，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路，減輕ZEN 誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷[9,18]。本研究結(jié)果表明，20 μmol/L 和30 μmol/L 的白藜蘆醇能夠緩解ZEN 誘導(dǎo)的IPEC-J2 細(xì)胞的SOD 活性和T-AOC 水平降低，能夠緩解ZEN 誘導(dǎo)的IPEC-J2 細(xì)胞的MDA 水平升高。說明一定濃度的白藜蘆醇能夠緩解ZEN 誘導(dǎo)的IPEC-J2 細(xì)胞抗氧化功能降低。

3.3 白藜蘆醇對(duì)ZEN 誘導(dǎo)的IPEC-J2 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA 表達(dá)水平的影響

Caspase 蛋白家族與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，Caspase-9 是凋亡的誘發(fā)劑，它接受信號(hào)后激活效應(yīng)Caspase 蛋白（例如caspase-3），Caspase-3 是凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，是凋亡標(biāo)志蛋白。Bax和Blc-2同樣也是凋亡的重要指標(biāo)，Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡，而Bax拮抗Bcl-2，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[19]。研究表明，給予玉米赤霉烯酮后，豬小腸上皮細(xì)胞SIEC02 的Bcl-2表達(dá)下降，促凋亡因子Bax表達(dá)升高，并且Caspase-3和Caspase-9的mRNA 含量均升高[20]。研究表明，有機(jī)硒、原花青素、槲皮素抗氧化物質(zhì)能夠有效緩解ZEN 誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡作用，改變Caspase-3、Caspase-9、Bax和Blc-2等凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平[7-9]。本研究結(jié)果表明，20 μmol/L和30 μmol/L 的白藜蘆醇能夠緩解ZEN 誘導(dǎo)的IPEC-J2 細(xì)胞的Capase-3、Capase-9和Bax基因mRNA 表達(dá)水平升高，能夠緩解ZEN 誘導(dǎo)的IPEC-J2 細(xì)胞Bcl-2基因mRNA 表達(dá)水平降低。說明一定濃度的白藜蘆醇能夠緩解ZEN 誘導(dǎo)的IPEC-J2 細(xì)胞細(xì)胞凋亡發(fā)生。

4 結(jié)論

白藜蘆醇能夠緩解ZEN 誘導(dǎo)的IPEC-J2 細(xì)胞的細(xì)胞活力、LDH 活性、抗氧化功能和凋亡相關(guān)基因mRNA 表達(dá)水平的改變。