錦帶花組培快繁體系的建立

李得萍，許丁帆，何遠(yuǎn)秦，楊森茹，黃俊軒，劉艷軍

（天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津 300392）

錦帶花（Weigela florida）為忍冬科（Caprifoliaceae）錦帶花屬（Weigela）叢生灌木植物。主要分布于我國(guó)黑龍江、吉林、遼寧等地區(qū)，其花色艷麗、葉色多變、抗逆性強(qiáng)，是北方重要的園林觀花植物[1-3]。同時(shí)，錦帶花還具有抑菌、抗流感、鎮(zhèn)痛等多種藥用功效[4-5]，也可為紡織品染色[6]，以及作為防火樹種[7]。

錦帶花因種子微小不易采集，且種子出芽率低，生產(chǎn)中極少采用播種法進(jìn)行大規(guī)模繁殖。其種苗繁育多采用扦插、壓條或分株等繁殖方法[8]，但以上方法繁殖效率較低，且長(zhǎng)期無(wú)性繁殖會(huì)導(dǎo)致病蟲害的積累，影響苗木的質(zhì)量。組培快繁技術(shù)具有速度快、繁殖系數(shù)大等優(yōu)點(diǎn)，且能維持原有品種的優(yōu)良特性，適應(yīng)周年工廠化生產(chǎn)，使苗木繁殖不受自然環(huán)境中季節(jié)和惡劣氣候的影響[9]。

目前，關(guān)于錦帶花組培快繁方面的研究報(bào)道較多，前人在錦帶花組培快繁研究中，一般先通過(guò)外植體誘導(dǎo)愈傷組織，進(jìn)而分化出不定芽，采用不定芽再生的方式進(jìn)行增殖[10-12]。然而愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程周期較長(zhǎng)且可能產(chǎn)生變異[13]，導(dǎo)致錦帶花變異植株發(fā)生頻率相對(duì)較高。本試驗(yàn)采用莖段為外植體，通過(guò)誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)增殖的方式進(jìn)行離體快繁，腋芽繁殖出來(lái)的后代遺傳穩(wěn)定性較高，以此建立一種高效且遺傳穩(wěn)定的錦帶花組培快繁體系，為錦帶花工廠化育苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為天津農(nóng)學(xué)院東校區(qū)內(nèi)生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲害‘紅王子’錦帶花植株。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料以x±s表示，采用配對(duì)t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 試驗(yàn)方法

外植體污染率（%）＝污染外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100；

中國(guó)市場(chǎng)已經(jīng)是浩亭最大的潛力之一，十幾年來(lái)，中國(guó)客戶需求的變化正呈現(xiàn)一個(gè)明顯的趨勢(shì)：以前對(duì)價(jià)格靈敏，現(xiàn)在更重視的是品質(zhì)和服務(wù)，其次才是有比較優(yōu)勢(shì)的價(jià)格。馬艾倫博士指出，“中國(guó)制造對(duì)品質(zhì)的關(guān)注度已經(jīng)接近日本客戶的要求，中國(guó)市場(chǎng)的增長(zhǎng)潛力將超過(guò)世界平均水平，中國(guó)市場(chǎng)增長(zhǎng)潛力和速度變化很快，我們正是看到這個(gè)趨勢(shì)，將與德國(guó)總部緊密合作，加大在生產(chǎn)、研發(fā)、銷售網(wǎng)絡(luò)方面的服務(wù)投入?！睋?jù)悉，浩亭計(jì)劃投資1.5億元人民幣在珠海擴(kuò)建新工廠，預(yù)計(jì)3年內(nèi)產(chǎn)能實(shí)現(xiàn)翻倍。

剪取植株上當(dāng)年生新梢中上部莖段，每個(gè)莖段帶有1～2 個(gè)腋芽。用70%乙醇溶液浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗30 s，再分別采用含有效氯1%、2%、4%的次氯酸鈉溶液消毒，消毒時(shí)間設(shè)置為5、10 min，消毒后無(wú)菌水沖洗3 次，每次沖洗10 min，再用無(wú)菌濾紙吸干外植體表面水分，并剪去外植體兩端褐化部分，分別接種至MS、MS＋125 mg/L羧芐青霉素培養(yǎng)基上。試驗(yàn)重復(fù)3 次，每個(gè)處理接種10 瓶，每瓶接種3 個(gè)外植體。15 d 后觀察并統(tǒng)計(jì)不同處理的外植體污染率、腋芽萌發(fā)率及腋芽生長(zhǎng)情況。

隨著當(dāng)今社會(huì)的不斷發(fā)展，學(xué)校對(duì)生物學(xué)科的學(xué)習(xí)是非常重視的，生物學(xué)科的學(xué)習(xí)不僅可以幫助學(xué)生培養(yǎng)學(xué)習(xí)的能力，也可以為同學(xué)打開一所與外界溝通的橋梁.在生物教學(xué)的學(xué)習(xí)中，應(yīng)該培養(yǎng)學(xué)生的核心素養(yǎng)，日后不近可以幫助學(xué)生對(duì)生物知識(shí)的學(xué)習(xí)，還可以培養(yǎng)學(xué)生的思考能力，高中生物教學(xué)的基本內(nèi)容主要包括：引導(dǎo)學(xué)生正確看待生物科學(xué)和把生活與生物合理的進(jìn)行運(yùn)用和聯(lián)系，因此，這三個(gè)方面培養(yǎng)對(duì)學(xué)生的生物學(xué)習(xí)有著非常重要的意義.

采用Excel 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，并用SPSS20.0 分析軟件進(jìn)行顯著性分析。

平均株高（cm）＝同一處理株高之和/外植體數(shù)；

Te=150 nm,t=20 nm,Dn=25 cm2/s,α和β分別取自參考文獻(xiàn)[22]和[23]。

振威展覽的主營(yíng)業(yè)務(wù)是作為展會(huì)的主辦方或承辦機(jī)構(gòu)，具體負(fù)責(zé)整體策劃、市場(chǎng)營(yíng)銷、展臺(tái)搭建、招展招商、現(xiàn)場(chǎng)組織等工作，收入來(lái)源則是展位費(fèi)、廣告宣傳費(fèi)、展會(huì)承辦費(fèi)、展臺(tái)搭建費(fèi)、會(huì)議服務(wù)費(fèi)等。

將錦帶花組培苗作為外植體，將其剪成2～3 cm 小段，每個(gè)莖段帶有2 個(gè)腋芽，接種到不同的增殖培養(yǎng)基上。增殖培養(yǎng)基以WPM 為基本培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度的BA 和IAA，7 種增殖培養(yǎng)基分別為：WPM；WPM＋0.5 mg/L BA；WPM＋1 mg/L BA；WPM＋2 mg/L BA；WPM＋0.5 mg/L BA＋0.5 mg/L IAA；WPM＋1 mg/L BA＋0.5 mg/L IAA；WPM＋2 mg/L BA＋1 mg/L IAA。每個(gè)處理接種15 瓶，每瓶接種3 個(gè)莖段。30 d 后觀察并統(tǒng)計(jì)每種處理增殖系數(shù)、增殖芽平均高度及增殖芽生長(zhǎng)情況。

1.2.3 錦帶花的增殖培養(yǎng)

1.2.4 培養(yǎng)條件

以上培養(yǎng)基均采用7 g/L 瓊脂粉，30 g/L 蔗糖，pH 值5.8～6.0，培養(yǎng)溫度（25±2）℃，光照強(qiáng)度2 000～2 500 lx，連續(xù)照明。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及方法

1.2.1 錦帶花的外植體消毒

將肉泥分為4組，每組5份，每份10 g，每份添加0.03 g食鹽和0.005 g山梨酸鉀，每組肉泥添加一類發(fā)色劑，濃度分別為0.002%，0.004%，0.006%，0.008%，0.010%。烘烤溫度180 ℃，時(shí)間15 min。采用色差計(jì)測(cè)定成品肉脯的紅度值a*。

腋芽萌發(fā)率（%）＝萌發(fā)外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100；

將萌發(fā)后長(zhǎng)至1.5～2.0 cm 的腋芽從外植體上切下，取生長(zhǎng)狀況一致的組培苗接種到不同種類的初代培養(yǎng)基上。初代培養(yǎng)基分別采用MS、B5、WPM、Anderson、White 為基本培養(yǎng)基。每個(gè)試驗(yàn)處理接種15 瓶，每瓶接種3 個(gè)腋芽，試驗(yàn)重復(fù)3次。30 d 后觀察并統(tǒng)計(jì)不同基本培養(yǎng)基中錦帶花平均株高、平均莖粗及腋芽生長(zhǎng)情況。

平均莖粗（cm）＝同一處理莖粗之和/外植體數(shù)；

由表1 可知，隨著次氯酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)和消毒時(shí)間的增加，外植體污染率逐漸減小，外植體腋芽萌發(fā)率逐漸上升，但并非質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高越好，使用4%次氯酸鈉消毒10 min 后，在植株死亡的情況下MS 培養(yǎng)基仍出現(xiàn)外植體污染，污染率為10%，均為細(xì)菌污染，考慮是植株內(nèi)生菌所造成。因此在處理組中加入質(zhì)量濃度為125 mg/L 的羧芐青霉素進(jìn)行試驗(yàn)，2%次氯酸鈉消毒10 min 消毒效果最好，外植體污染率1.67%，腋芽萌發(fā)率98.3%。由此可知，次氯酸鈉濃度過(guò)高會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用，從而影響其正常生長(zhǎng)，甚至死亡。綜合考慮外植體污染率和腋芽萌發(fā)率，最適合消毒方法為：2%次氯酸鈉溶液消毒10 min，接種到MS＋125 mg/L 羧芐青霉素培養(yǎng)基中。

1.2.2 錦帶花初代培養(yǎng)基篩選

適中院二班生徒，多戲迷者。乃就校舍中所懸粉板，大書特書其向日所讀 《新聞報(bào)》戲廣告之戲目。因之有人提議，不如即在校內(nèi)演習(xí)。諸生均極贊成，即于是晚演六君子（戊戌政變紀(jì)事）。當(dāng)時(shí)并無(wú)后臺(tái)化裝之室，更無(wú)預(yù)定腳本，即今日新劇所謂幕表者。同校他班諸生，來(lái)參觀者，均贊美不置。自此一演之后，遂興致勃勃，即于次晚又將小說(shuō)《經(jīng)國(guó)美談》排演。當(dāng)時(shí)排演情形，殊屬可笑，一面將小說(shuō)閱看，一面即付演習(xí)。事雖草率，而大致不錯(cuò)。故再接再厲，又連演一晚。至第三晚參觀者更眾，即教員亦均列席。同校生來(lái)者，均預(yù)購(gòu)洋燭，持贈(zèng)演員，以助膏火。演員乃取洋燭盡燃，室內(nèi)通明如白晝焉。[5]38

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒處理方法對(duì)外植體消毒效果的影響

增殖系數(shù)＝有效芽數(shù)/接種新梢數(shù)（有效芽為芽高≥1 cm）。

表1 不同消毒處理方法對(duì)錦帶花消毒效果的影響

2.2 不同基本培養(yǎng)基類型對(duì)錦帶花生長(zhǎng)的影響

由表2 可知，錦帶花腋芽在5 種基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)30 d 后，其平均株高、莖粗均差異顯著（P＜0.05），其中Anderson 培養(yǎng)基中長(zhǎng)勢(shì)最弱，平均株高0.6 cm，平均莖粗2.50 cm，顯著低于其他4 種培養(yǎng)基中的水平，不適于錦帶花組培苗木的生長(zhǎng)；基本培養(yǎng)基為MS 和B5 時(shí)，其平均莖粗沒(méi)有顯著性差異，顯著高于Anderson 和White 培養(yǎng)基所培養(yǎng)組培苗，但顯著低于WPM 培養(yǎng)基所培養(yǎng)的組培苗，且植株生長(zhǎng)情況一般；當(dāng)基本培養(yǎng)基為WPM 時(shí)植株平均株高和平均莖粗均顯著高于其他基本培養(yǎng)基培養(yǎng)，且植株生長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng)。綜上所述，WPM 基本培養(yǎng)基最適合錦帶花組培苗生長(zhǎng)，培養(yǎng)30 d 后，植株的平均株高為5.58 cm，平均莖粗1.7 cm，植株生長(zhǎng)旺盛，生長(zhǎng)情況較強(qiáng)（圖1）。

圖1 ‘紅王子’錦帶花組織培養(yǎng)和快速繁殖

表2 不同基本培養(yǎng)基類型對(duì)組培苗生長(zhǎng)的影響

2.3 不同激素質(zhì)量濃度配比對(duì)錦帶花增殖培養(yǎng)的影響

不同激素處理對(duì)錦帶花增殖影響不同。由表3可知，當(dāng)單獨(dú)加入BA 時(shí)，各處理的增殖系數(shù)均大于對(duì)照組ck，隨著BA 質(zhì)量濃度的增加，增殖系數(shù)由高到低再升高，當(dāng)BA 質(zhì)量濃度達(dá)到1.0 mg/L 及以上時(shí)生長(zhǎng)勢(shì)減弱并出現(xiàn)玻璃化，增殖芽的平均高度逐漸下降。因此，單獨(dú)添加BA 時(shí)，0.5 mg/L 的質(zhì)量濃度條件下增殖效果最好，增殖系數(shù)3.9，增殖芽平均高度1.8 cm；在同時(shí)添加BA與IAA 時(shí)，各處理的增殖系數(shù)、增殖芽平均高度進(jìn)一步提升，均大于未加IAA 的處理組，其中添加1.0 mg/L BA＋0.5 mg/L IAA 的增殖效果最好，增殖系數(shù)為8.0，增殖芽高度為1.7 cm，生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)且未出現(xiàn)玻璃化。其次是添加0.5 mg/L BA＋0.5 mg/L IAA 的處理組，增殖系數(shù)為6.9，增殖芽高度為3.2 cm，增殖芽平均高度顯著高于其他處理；2.0 mg/L BA＋1.0 mg/L IAA 條件下效果最差，增殖芽平均高度低于對(duì)照組，可見(jiàn)此條件并不適用于錦帶花腋芽增殖生長(zhǎng)。因此，綜合考慮得出，‘紅王子’錦帶花最適的增殖培養(yǎng)基為WPM＋1.0 mg/L BA＋0.5 mg/L IAA。

表3 不同增殖培養(yǎng)基對(duì)錦帶花增殖培養(yǎng)的影響

3 討論與結(jié)論

植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，外植體消毒是建立錦帶花組培快繁體系的關(guān)鍵步驟。前人多采用升汞進(jìn)行錦帶花外植體消毒[14-18]，但升汞有劇毒、易殘留，且管制較嚴(yán)不易獲取，而次氯酸鈉使用較為安全。本試驗(yàn)采用次氯酸鈉溶液作為消毒液，使用2%次氯酸鈉溶液消毒10 min 后，將外植體接種到含125 mg/L 羧芐青霉素的MS 培養(yǎng)基上，其污染率為1.67%，腋芽萌發(fā)率達(dá)98.3%，且腋芽生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)。

在錦帶花外植體消毒試驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，使用2%次氯酸鈉消毒10 min 后接種到MS 培養(yǎng)基中其消毒效果并不理想，污染率達(dá)25%，然而在提高次氯酸鈉溶液有效氯濃度后，外植體出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，并且仍存在細(xì)菌污染現(xiàn)象，推測(cè)為錦帶花植株內(nèi)生菌所造成，因此試驗(yàn)采用添加抗生素的方法來(lái)抑制內(nèi)生菌污染。通過(guò)在培養(yǎng)基中添加125 mg/L 羧芐青霉素后，錦帶花莖段污染率顯著低于未加羧芐青霉素的處理組。黃俊軒等[19]在北美海棠脫菌組培試驗(yàn)中，使用含有250 mg/L 羧芐青霉素和50 mg/L 卡那霉素的MS 培養(yǎng)基取得了理想的內(nèi)生菌抑制效果。侯淑婧等[20]在花葉錦帶花組織培養(yǎng)試驗(yàn)中，在初代培養(yǎng)基中添加480 mg/L 羧芐青霉素也有效抑制了花葉錦帶花內(nèi)生菌的污染。因此，抗生素在組培中對(duì)植株脫菌以及生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用，而其抗生素濃度使用差異可能與取材植株的生理狀態(tài)、外植體的取材部位及老嫩程度等有關(guān)，在試驗(yàn)前應(yīng)先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)來(lái)確認(rèn)使用抗生素的濃度范圍。

本試驗(yàn)得出WPM 基本培養(yǎng)基更適合錦帶花組培苗生長(zhǎng)，這一結(jié)論與多位學(xué)者不一致[15，21]。WPM 培養(yǎng)基是經(jīng)過(guò)MS 培養(yǎng)基改良后的低鹽培養(yǎng)基，主要用于木本植物的培養(yǎng)，因此，對(duì)于錦帶花組培苗的培養(yǎng)也適用。B5 培養(yǎng)基是一種低鹽培養(yǎng)基，也有利于錦帶花組培苗的生長(zhǎng)，且生長(zhǎng)效果優(yōu)于高鹽MS 培養(yǎng)基培養(yǎng)，因此，錦帶花適合較低鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)。Anderson 培養(yǎng)基研制之初主要用于牡丹屬植物組織培養(yǎng)[22-23]，錦帶花屬植物培養(yǎng)沒(méi)有相關(guān)報(bào)道，本試驗(yàn)結(jié)果也表明，錦帶花在Anderson 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)效果最差，不適合生長(zhǎng)。

增殖培養(yǎng)常用的增殖方法有不定芽增殖和腋芽萌發(fā)增殖[24-25]。不定芽增殖通常需脫分化形成愈傷組織，再經(jīng)過(guò)再分化過(guò)程形成不定芽。而在誘導(dǎo)愈傷組織過(guò)程中，一般會(huì)使用大量的外源植物激素促使外植體脫分化，且愈傷組織脫分化與再分化過(guò)程中，其過(guò)程復(fù)雜，激素濃度使用不當(dāng)時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致組培苗遺傳變異的產(chǎn)生。本研究采用誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)增殖的方式進(jìn)行離體快繁，這種方式具備遺傳穩(wěn)定性較高、成苗速度快等優(yōu)點(diǎn)。

本研究以錦帶花帶腋芽莖段為外植體，通過(guò)不同的消毒方式獲得無(wú)菌苗，篩選適合錦帶花組織培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基和合適的增殖培養(yǎng)基，通過(guò)腋芽萌發(fā)的方式初步建立起了錦帶花組培快繁體系。試驗(yàn)結(jié)果顯示，外植體最佳消毒方法為2%次氯酸鈉溶液消毒10 min 后，接種至添加125 mg/L羧芐青霉素的MS 培養(yǎng)基中，此方法外植體污染率僅1.67%，萌發(fā)率可達(dá)98.3%；初代培養(yǎng)最適基本培養(yǎng)基為WPM，組培苗平均株高可達(dá)5.58 cm，莖粗1.7 cm；最適增殖培養(yǎng)基為WPM＋1.0 mg/L BA＋0.5 mg/L IAA，增殖系數(shù)8.0，增殖芽高度1.7 cm，生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)且未出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。