核仁素對(duì)伯基特淋巴瘤細(xì)胞長(zhǎng)春新堿敏感性的影響及其機(jī)制

徐偉格，郝秀君，李英新，賈鑫新，楊艷敏，原現(xiàn)華

邢臺(tái)市第一醫(yī)院血液科，河北邢臺(tái)054001

伯基特淋巴瘤是一種高侵襲性B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤，在臨床上分為非洲地區(qū)性、散發(fā)性和免疫缺陷相關(guān)性三種流行病學(xué)亞型［1］。目前，化療仍然是伯基特淋巴瘤最主要的治療手段，而化療耐藥是導(dǎo)致治療失敗和預(yù)后較差的主要原因［2］。核仁素是一種多功能蛋白，廣泛分布于真核細(xì)胞的核仁、核質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜等部位，能夠參與多種生物學(xué)過程。有研究報(bào)道，核仁素在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并能調(diào)控凋亡過程中各種蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定性，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［3］。另外，與親本CA46細(xì)胞相比，核仁素在阿霉素耐藥的CA46細(xì)胞中表達(dá)顯著升高［4］。核仁素在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，尤其是耐藥腫瘤細(xì)胞，據(jù)此推測(cè)核仁素可能與腫瘤耐藥性密切相關(guān)［5］。但核仁素參與腫瘤耐藥的機(jī)制尚不清楚。Bcl-2基因是一種抑制細(xì)胞凋亡的癌基因，其編碼蛋白屬于細(xì)胞凋亡蛋白家族。研究表明，Bcl-2蛋白過表達(dá)能夠抑制細(xì)胞凋亡，并導(dǎo)致血液腫瘤化療耐藥［6-7］。腫瘤細(xì)胞中核仁素和Bcl-2高表達(dá)均能參與細(xì)胞凋亡過程，它們與腫瘤細(xì)胞耐藥可能具有一定關(guān)系。2021年6月—2022年10月，本研究探討了核仁素對(duì)伯基特淋巴瘤細(xì)胞長(zhǎng)春新堿敏感性的影響及其機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1.料與方法

1.1.料 伯基特淋巴瘤CA46細(xì)胞，購(gòu)自上海博爾森生物科技有限公司。長(zhǎng)春新堿，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。對(duì)照質(zhì)粒（5'-CGAACGTCTACTGTCAC-3'）、核仁素shRNA質(zhì)粒（5'-AGTCGTAGCTGTGAGCTG-3'）、核仁素mRNA質(zhì)粒（5'-TGCACTAATGCTAGCTGTGAC-3'），由上海美迪西生物醫(yī)藥股份有限公司構(gòu)建。Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑，購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；RIPA裂解液，購(gòu)自美國(guó)MCE公司。TaKaRa實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，購(gòu)自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；凋亡檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司。Bcl-2、β-actin單克隆抗體及相應(yīng)的二抗，購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.2.胞培養(yǎng) 將CA46細(xì)胞接種于含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。每2～3天換液一次。待細(xì)胞生長(zhǎng)至85%左右融合時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化、計(jì)數(shù)，按1∶3傳代。取傳3代、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的CA46細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.粒轉(zhuǎn)染 取傳3代、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的CA46細(xì)胞，以2 × 105/孔接種于6孔板，隨機(jī)分為Control組、核仁素-NC組、核仁素-KD組和核仁素-OE組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。將6孔板置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h，按Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑說明，將對(duì)照質(zhì)粒、核仁素shRNA質(zhì)粒、核仁素mRNA質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至核仁素-NC組、核仁素-KD組和核仁素-OE組CA46細(xì)胞中，Control組不予轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染6 h，更換新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞。

1.4.仁素、Bcl-2 mRNA表達(dá)檢測(cè) 收集上述各組CA46細(xì)胞，按總RNA提取試劑盒說明提取細(xì)胞總RNA。經(jīng)紫外可見分光光度計(jì)鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格。然后將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，按TaKaRa實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：核仁素上游引物5'-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGC-3'、下游引物5'-TACCTTCAAACTTCGTCTTCTTTCC-3'；Bcl-2上游引物5'-CGACGACTTCTCCCGCCCGCTACCG-3'、下游引物5'-CCGCATGCTGGGGGCCGTACAGT-3'；GAPDH上游引物5'-CCTCAAGATCAGCAAT-3'、下游引物5'-GATGTTCTGGAGAGCCCCCG-3'。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT法計(jì)算核仁素、Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5.胞存活率檢測(cè)及長(zhǎng)春新堿的半數(shù)抑制濃度（IC50）計(jì)算 收集上述各組CA46細(xì)胞，以5 × 103/孔接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h。然后分別加入0、25、50、100、200、400 μg/L長(zhǎng)春新堿，繼續(xù)孵育48 h。每孔加入5 mg/L MTT溶液20 μL，繼續(xù)孵育2 h。每孔加入DMSO溶液200 μL，輕輕振蕩，使結(jié)晶物充分溶解。酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的光密度（OD）值，按公式計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=1-［（觀察組OD450值-空白對(duì)照組OD450值）/（對(duì)照組OD450值-空白對(duì)照組OD450值）］×100%。利用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算各組CA46細(xì)胞長(zhǎng)春新堿的IC50。

1.6.胞凋亡率檢測(cè) 收集上述各組CA46細(xì)胞，以3 × 106/孔接種于6孔板，每孔加入100 μg/L長(zhǎng)春新堿，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48 h，0.25%胰蛋白酶消化，4 ℃下300 × g離心5 min，收集細(xì)胞。預(yù)冷的PBS洗滌2次，1 × Binding Buffer 100 μL重懸，然后分別加入Annexin V-FITC 5 μL、PI 10 μL，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min。最后加入1 × Binding Buffer 400 μL，混勻后置于冰盒中，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.7.cl-2蛋白表達(dá)檢測(cè) 取上述各組CA46細(xì)胞，加入適量細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞總蛋白。經(jīng)BCA法蛋白定量合格，加入蛋白上樣緩沖液混勻，100 ℃水浴充分變性。取部分變性蛋白，SDS-PAGE分離，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜。然后分別加入Bcl-2、β-actin單克隆抗體，4 ℃孵育過夜。次日，TBST洗膜后，加入IgG二抗，室溫孵育1 h。ECL發(fā)光，暗室內(nèi)曝光、顯影。采用Image J軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8.仁素蛋白與Bcl-2相互作用觀察 CA46細(xì)胞經(jīng)RIPA裂解液充分裂解，與抗核仁素抗體和蛋白A/G磁珠交聯(lián)，以小鼠IgG作為對(duì)照抗體。將抗核仁素抗體與蛋白A/G磁珠交聯(lián)產(chǎn)物置于RNA免疫沉淀緩沖液，4 ℃孵育過夜。用蛋白酶K緩沖液消化磁珠中的蛋白，用苯酚、氯仿、異戊醇混合物提取和純化RNA，并將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s共40個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠分離，GoldView染色，觀察核仁素免疫沉淀復(fù)合物中Bcl-2 mRNA條帶強(qiáng)度。

1.9.計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.果

2.1.組CA46細(xì)胞核仁素mRNA表達(dá)比較 Control組、核仁素-NC組、核仁素-KD組、核仁素-OE組CA46細(xì)胞核仁素mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.00 ±0.08、0.90 ± 0.05、0.30 ± 0.06、1.86 ± 0.09。Control組與核仁素-NC組CA46細(xì)胞核仁素mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），核仁素-KD組CA46細(xì)胞核仁素mRNA相對(duì)表達(dá)量低于核仁素-NC組和Control組（P均＜0.05），核仁素-OE組CA46細(xì)胞核仁素mRNA相對(duì)表達(dá)量高于核仁素-NC組和Control組（P均＜0.05）。

2.2.組CA46細(xì)胞長(zhǎng)春新堿的IC50比較 不同濃度長(zhǎng)春新堿干預(yù)下各組CA46細(xì)胞存活率變化見圖1。Control組、核仁素-NC組、核仁素-KD組、核仁素-OE組CA46細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿的IC50分別為（143.2 ± 5.8）、（148.0 ± 4.2）、（68.3 ± 4.0）、（304.2 ± 15.7）μg/L。Control組與核仁素-NC組CA46細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿的IC50比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），核仁素-KD組CA46細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿的IC50低于Control組和核仁素-NC組（P均＜0.05），核仁素-OE組CA46細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿的IC50高于Control組和核仁素-NC組（P均＜0.05）。

圖1.仁素蛋白與Bcl-2 mRNA的免疫共沉淀結(jié)果觀察

圖1.同濃度長(zhǎng)春新堿干預(yù)下各組CA46細(xì)胞存活率變化

2.3.組CA46細(xì)胞長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)后凋亡率比較Control組、核仁素-NC組、核仁素-KD組、核仁素-OE組CA46細(xì)胞長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)后凋亡率分別為（26.3 ±2.1）%、（28.4 ± 2.6）%、（20.5 ± 3.7）%、（75.3 ±6.8）%。Control組與核仁素-NC組CA46細(xì)胞長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)后凋亡率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），核仁素-KD組CA46細(xì)胞長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)后凋亡率均低于Control組和核仁素-NC組（P均＜0.05），而核仁素-OE組CA46細(xì)胞長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)后凋亡率均高于Control組和核仁素-NC組（P均＜0.05）。

2.4.組CA46細(xì)胞Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)比較 見表1。

表1.組CA46細(xì)胞Bcl-2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表1.組CA46細(xì)胞Bcl-2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與Control組比較，*P＜0.05；與核仁素-NC組比較，#P＜0.05。

組別Control組核仁素-NC組核仁素-KD組核仁素-OE組Bcl-2 mRNA 1.00 ± 0.05 0.98 ± 0.02 0.41 ± 0.03*#1.59 ± 0.05*#蛋白0.78 ± 0.06 1.05 ± 0.07 0.31 ± 0.03*#1.24 ± 0.10*#

2.5.仁素蛋白與Bcl-2 mRNA的免疫共沉淀觀察 與抗IgG相比，核仁素免疫沉淀復(fù)合物中Bcl-2 mRNA顯著富集，見圖1。

3.論

伯基特淋巴瘤是一種來源于濾泡生發(fā)中心細(xì)胞的高度侵襲性B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤。目前，化療仍然是伯基特淋巴瘤最主要的治療手段，而化療耐藥是導(dǎo)致治療失敗和預(yù)后較差的主要原因［2］。因此，改善伯基特淋巴瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性并提高其敏感性是臨床亟需解決的問題。普遍認(rèn)為，伯基特淋巴瘤細(xì)胞化療耐藥與基因突變、細(xì)胞凋亡異常、骨髓微環(huán)境改變等因素有關(guān)。

核仁素是一種多功能蛋白，廣泛分布于真核細(xì)胞的核仁、核質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜等部位，能夠參與多種生物學(xué)過程。研究表明，核仁素在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并且其表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖和存活密切相關(guān)［8］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，核仁素在復(fù)發(fā)或難治性急性白血病預(yù)后較差患者中過表達(dá)［9］。另有研究報(bào)道，核仁素在急性白血病細(xì)胞中具有促進(jìn)增殖和耐藥性進(jìn)化的作用［10］。此外，有學(xué)者認(rèn)為下調(diào)核仁素表達(dá)有望成為腫瘤化療增敏的有效措施之一［11-12］。有研究報(bào)道，化療藥物誘導(dǎo)的髓細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡發(fā)生之前，Bcl-2 mRNA表達(dá)下調(diào)且不穩(wěn)定［13］。核仁素是否通過上調(diào)Bcl-2表達(dá)進(jìn)而降低CA46細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿的敏感性，目前尚不明確。

本研究通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建了CA46細(xì)胞核仁素低表達(dá)和過表達(dá)細(xì)胞株，進(jìn)一步觀察了核仁素對(duì)CA46細(xì)胞增殖、凋亡以及Bcl-2表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)春新堿作用于核仁素過表達(dá)CA46細(xì)胞株的IC50顯著增加，說明核仁素過表達(dá)可降低CA46細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿的敏感性。有研究認(rèn)為，核仁素表達(dá)下調(diào)可能通過降低Bcl-2表達(dá)而增強(qiáng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞順鉑耐藥株對(duì)順鉑的敏感性［14］。此外，核仁素抑制劑AS1411通過破壞Bcl-2 mRNA穩(wěn)定性而抑制人膠質(zhì)瘤和乳腺癌細(xì)胞增殖［15-16］。本研究還發(fā)現(xiàn)，核仁素低表達(dá)CA46細(xì)胞株Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低，核仁素過表達(dá)CA46細(xì)胞株Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高。Bcl-2基因是一種抑制細(xì)胞凋亡的癌基因，其編碼蛋白屬于細(xì)胞凋亡蛋白家族。核仁素過表達(dá)CA46細(xì)胞株對(duì)長(zhǎng)春新堿的敏感性降低，可能與上調(diào)Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)有關(guān)。本研究采用免疫共沉淀技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證核仁素與Bcl-2在體內(nèi)的相互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫沉淀復(fù)合物中Bcl-2 mRNA顯著富集，證實(shí)核仁素可與Bcl-2直接結(jié)合。

綜上所述，核仁素可能通過上調(diào)Bcl-2表達(dá)，并直接與Bcl-2 mRNA結(jié)合而促進(jìn)其穩(wěn)定性，從而降低伯基特淋巴瘤細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿的敏感性。