新生兒急性呼吸窘迫綜合征患兒血清miR-877-5p表達(dá)變化及其與病情嚴(yán)重程度和預(yù)后的關(guān)系

程旺松，蘇小智，陳鼎瑞

1 深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院 廣東醫(yī)科大學(xué)附屬龍華中心醫(yī)院新生兒科，廣東深圳518110；2 河源市深河人民醫(yī)院新生兒科

新生兒急性呼吸窘迫綜合征（NARDS）是由于缺乏肺泡表面活性物質(zhì)，出生后不久即可出現(xiàn)進(jìn)行性加重的呼吸窘迫和呼吸衰竭，其病理上有肺透明膜的改變，故又被稱為新生兒肺透明膜病，多見(jiàn)于早產(chǎn)兒。近年來(lái)，隨著早產(chǎn)兒數(shù)量逐漸增多，NARDS的發(fā)病率也隨之升高。NARDS的病死率為30%～40%，是導(dǎo)致新生兒死亡的重要原因［1］。肺部炎癥反應(yīng)失控是導(dǎo)致NARDS發(fā)生、發(fā)展的重要原因［2］。有研究表明，微小RNA（miRNA）能夠通過(guò)調(diào)控炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、肺泡表面活性物質(zhì)等參與NARDS的發(fā)生、發(fā)展［3］。miR-877-5p是一種高度保守的miRNA家族成員。有研究報(bào)道，miR-877-5p在呼吸道合胞病毒感染嬰兒外周血中表達(dá)下調(diào)，并且其表達(dá)越低，病情越重［4］。但目前血清miR-877-5p表達(dá)與NARDS病情嚴(yán)重程度和預(yù)后的關(guān)系尚不清楚。鑒于此，我們進(jìn)行了相關(guān)研究。現(xiàn)報(bào)告如下。

1.料與方法

1.1.床資料 選擇2018年1月—2023年1月深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院收治的NARDS患兒95例（觀察組）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合NARDS診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］；②發(fā)病至確診時(shí)間＜1周；③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并先天畸形或遺傳缺陷者；②合并其他肺部疾病者；③合并腦性過(guò)度換氣者；④合并原發(fā)性肺泡表面活性物質(zhì)缺乏者；⑤合并心、肝、腎等重要臟器功能不全者；⑥合并惡性腫瘤者。其中，男61例、女34例，出生日齡1～28（18.65 ± 2.33）d，胎齡25～41（35.14 ± 2.51）周；分娩方式：經(jīng)陰道分娩46例，剖宮產(chǎn)49例；病因：胎糞吸入9例，肺炎21例，膿毒癥36例，誤吸21例，其他8例。同期選擇健康新生兒40例（對(duì)照組），男26例、女14例，出生日齡1～28（18.44 ± 2.18）d，胎齡32～42（36.02 ± 2.25）周；分娩方式：經(jīng)陰道分娩22例，剖宮產(chǎn)18例。兩組性別、出生日齡、胎齡、分娩方式具有可比性。本研究經(jīng)深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批號(hào)：2019-03-215），患兒監(jiān)護(hù)人均知情同意并簽署書(shū)面知情同意書(shū)。

1.2.ARDS病情嚴(yán)重程度和預(yù)后評(píng)估 NARDS患兒入重癥監(jiān)護(hù)室首次行機(jī)械通氣時(shí)記錄動(dòng)脈血氧分壓、平均氣道壓、吸入氧濃度，計(jì)算氧指數(shù)。氧指數(shù)=平均氣道壓×吸入氧濃度×100/動(dòng)脈血氧分壓。參照NARDS蒙特勒診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］，根據(jù)氧指數(shù)評(píng)估NARDS病情嚴(yán)重程度。其中，NARDS輕度（氧指數(shù)4～＜8）38例、中度（氧指數(shù)≥8～＜16）35例、重度（氧指數(shù)≥16）22例。記錄NARDS患兒28 d內(nèi)臨床結(jié)局，其中死亡21例、存活74例。

1.3.清miR-877-5p表達(dá)檢測(cè) 采集所有新生兒外周靜脈血3 mL，3 000 r/min離心15 min、離心半徑10 cm，留取上層血清，-80 ℃冰箱保存。取部分血清，采用TRIzol法提取血清總RNA，經(jīng)微量分光光度計(jì)鑒定，OD260/OD280為1.8～2.0。按TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成為cDNA。反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 1 h，80 ℃ 5 s。以cDNA為模板，按SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒說(shuō)明進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。引物序列：miR-877-5p上游引物5'-AGTCCATTCCACGCCTAC-3'、下游引物5'-GAGCACGATCAGAACAT-3'，U6上游引物5'-GAACGGGAAGCTCACTGG-3'、下游引物5'-GCCTGCTTCACCACCTTCT-3'。PCR反應(yīng)體系共20 μL：cDNA模板1 μL，上下游引物各0.5 μL，Universal miRNA qPCR primer 0.5 μL，2 × TransStart?Top Green qPCR SurperMix 10 μL，無(wú)核酸酶水7.5 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 90 s，95 ℃ 30 s、63 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s共40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算血清miR-877-5p相對(duì)表達(dá)量。

1.4 血清IL-1β、IL-6、TNF-α檢測(cè) 取剩余血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清IL-1β、IL-6、TNF-α。

1.5.計(jì)學(xué)方法 采用SPSS28.0統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；兩組間比較采用t檢驗(yàn)或Z檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Z檢驗(yàn)；兩組間比較采用Z檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析法。預(yù)測(cè)效能分析采用受試者工作特征（ROC）曲線。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.果

2.1.組血清miR-877-5p表達(dá)及IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較 見(jiàn)表1。

表1.組血清miR-877-5p表達(dá)及IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較

2.2.同病情嚴(yán)重程度NARDS患兒血清miR-877-5p表達(dá)及IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較 見(jiàn)表2。

表2.同病情嚴(yán)重程度NARDS患兒血清miR-877-5p表達(dá)及IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較

2.3.ARDS患兒血清miR-877-5表達(dá)與氧指數(shù)及血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平的關(guān)系 NARDS患兒氧指數(shù)為11.00（6.00，15.00）。Spearman相關(guān)分析顯示，NARDS患兒血清miR-877-5p表達(dá)與氧指數(shù)及血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（rs分別為-0.785、-0.779、-0.778、-0.788，P均＜0.01）。

2.4.ARDS患兒死亡者與存活者血清miR-877-5p表達(dá)比較 NARDS患兒死亡者與存活者血清miR-877-5p表達(dá)分別為0.84（0.64，0.97）、1.11（0.99，1.21）。NARDS患兒死亡者血清miR-877-5p表達(dá)低于其存活者（Z=4.252，P＜0.01）。

2.5.清miR-877-5p表達(dá)對(duì)NARDS診斷和預(yù)后的預(yù)測(cè)效能分析結(jié)果 ROC曲線分析顯示，血清miR-877-5p表達(dá)診斷NARDS的曲線下面積（AUC）為0.857（95%CI：0.787～0.911），其最佳截?cái)嘀禐?.23，此時(shí)其診斷NARDS的靈敏度為73.68%、特異度為95.00%；血清miR-877-5p表達(dá)預(yù)測(cè)NARDS死亡的AUC為0.805（95%CI：0.711～0.879），其最佳截?cái)嘀禐?.97，此時(shí)其預(yù)測(cè)NARDS死亡的靈敏度為80.95%、特異度為75.68%。

3.論

NARDS是新生兒重癥監(jiān)護(hù)室常見(jiàn)的危重癥之一，其發(fā)病不局限于剖宮產(chǎn)、早產(chǎn)、妊娠期合并癥、胎膜早破、胎兒宮內(nèi)窘迫等圍產(chǎn)期因素，任何引起急性呼吸窘迫綜合征的因素均可誘發(fā)NARDS［6-7］。雖然NARDS與兒童或成人急性呼吸窘迫綜合征有著共同的發(fā)病危險(xiǎn)因素和相同的病理生理表現(xiàn)，但NARDS還具有早產(chǎn)、胎糞吸入、胎膜早破、胎兒窘迫等特有的誘發(fā)因素，以及肺成熟度、肺功能和免疫功能等生理差異。近年來(lái)，隨著NARDS蒙特勒診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］發(fā)布，NARDS診斷和治療取得了較大進(jìn)展，但呼吸支持仍然是目前NARDS最主要的治療方法，臨床尚缺乏特效的治療手段，故NARDS患兒病死率仍然較高。因此，深入探索NARDS發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制具有重要意義［8］。

研究認(rèn)為，炎癥反應(yīng)是NARDS發(fā)生、發(fā)展的重要病理生理基礎(chǔ)。肺臟具有獨(dú)特的先天免疫系統(tǒng)，當(dāng)受到感染或創(chuàng)傷刺激時(shí)激活其先天免疫系統(tǒng)，可產(chǎn)生細(xì)胞因子、抗體、黏液等效應(yīng)因子構(gòu)建免疫屏障，以維持肺臟免疫微環(huán)境穩(wěn)態(tài)。但當(dāng)病原微生物突破防御屏障時(shí)可引起肺臟免疫穩(wěn)態(tài)失控，引起失控性炎癥反應(yīng)，加劇肺泡和肺毛細(xì)血管損害，最終導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征發(fā)生［9］。miRNA是一類由18～25個(gè)核苷酸組成的非編碼單鏈小RNA分子，能夠通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)特異性結(jié)合，誘導(dǎo)mRNA降解或抑制其翻譯，通過(guò)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)參與急性呼吸窘迫綜合征的發(fā)生、發(fā)展［10-11］。miR-877-5p是一種高度保守的miRNA家族成員，定位于人染色體6p21.33。既往研究報(bào)道，miR-877-5p可作為抑癌基因抑制肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移［12-13］。近年研究發(fā)現(xiàn)，miR-877-5p能夠靶向叉頭框蛋白M1抑制炎癥反應(yīng)來(lái)改善關(guān)節(jié)功能，還能通過(guò)抑制乙酰氨基酚誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)來(lái)改善肝損傷［14-15］。上述研究表明，miR-877-5p具有抗炎作用。WANG等［4］研究報(bào)道，miR-877-5p能夠靶向IL-13受體A1抑制呼吸道合胞病毒誘導(dǎo)的嬰幼兒炎癥反應(yīng)。而病毒感染是急性呼吸窘迫綜合征常見(jiàn)的一個(gè)致病原因［16］。由此，我們推測(cè)miR-877-5p可能與NARDS的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，觀察組血清miR-877-5p表達(dá)低于對(duì)照組；隨著病情加重，NARDS患兒血清miR-877-5p表達(dá)逐漸降低；NARDS患兒死亡者血清miR-877-5p表達(dá)低于其存活者。結(jié)果表明，miR-877-5p能夠參與NARDS的發(fā)生、發(fā)展，并與患兒預(yù)后密切相關(guān)。IL-1β、IL-6和TNF-α是反映機(jī)體炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞因子，可參與急性呼吸窘迫綜合征的發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平高于對(duì)照組；隨著病情加重，NARDS患兒血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平逐漸升高。進(jìn)一步證實(shí)，炎癥反應(yīng)能夠參與NARDS的發(fā)生、發(fā)展。本研究相關(guān)分析顯示，NARDS患兒血清miR-877-5p表達(dá)與氧指數(shù)和血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。結(jié)果提示，miR-877-5p可能通過(guò)調(diào)控IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子參與NARDS的發(fā)生、發(fā)展。究其原因，miR-877-5p能夠激活細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子1B，通過(guò)調(diào)控多條信號(hào)傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，引起肺部炎癥和結(jié)構(gòu)破壞，最終導(dǎo)致NARDS病情加重和預(yù)后不良［17-18］。本研究ROC曲線分析顯示，血清miR-877-5p表達(dá)診斷NARDS的曲線下面積為0.857，其最佳截?cái)嘀禐?.23，此時(shí)其診斷NARDS的靈敏度和特異度分別為73.68%、95.00%；血清miR-877-5p表達(dá)預(yù)測(cè)NARDS死亡的曲線下面積為0.805，其最佳截?cái)嘀禐?.97，此時(shí)其預(yù)測(cè)NARDS死亡的靈敏度和特異度分別為80.95%、75.68%。結(jié)果提示，miR-877-5p可作用NARDS診斷和預(yù)后評(píng)估的血清生物學(xué)標(biāo)志物。

綜上所述，NARDS患兒血清miR-877-5p表達(dá)降低，其表達(dá)變化與病情嚴(yán)重程度和預(yù)后密切相關(guān)。