基于天冬組培技術(shù)條件優(yōu)化對植物組織培養(yǎng)課程的實踐教學(xué)探究

貴州大學(xué) 劉淼

20 世紀初，以植物細胞全能性為理論基礎(chǔ)，植物組織培養(yǎng)技術(shù)開始蓬勃發(fā)展。自應(yīng)用以來，該技術(shù)創(chuàng)造了許多世界矚目的成就[1]，對挽救瀕危植物、植株脫毒、快速繁殖、培育新品種、種苗擴大生產(chǎn)等產(chǎn)生了重要的價值。因此，當前全國眾多高校生物學(xué)相關(guān)專業(yè)均開設(shè)有植物組織培養(yǎng)理論和實驗操作課程[2-4]。

天冬是我國傳統(tǒng)中藥，最早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為藥典收載物種，具有養(yǎng)陰潤燥、清肺生津的作用，近代醫(yī)學(xué)研究表明其還有抑菌消炎、抗腫瘤、抗癌細胞等功效[5-6]，在食品和觀賞方面也具有極高價值[7-8]，市場需求大，但目前實際生產(chǎn)中種苗生產(chǎn)依舊存在一定困難，難以滿足日益擴大的市場需求。按照“十四五”期間規(guī)劃要求，強調(diào)科研成果要向生產(chǎn)力轉(zhuǎn)化，形成產(chǎn)教、產(chǎn)研、產(chǎn)學(xué)融合模式[9]。因此，通過組織培養(yǎng)技術(shù)的實踐操作，讓學(xué)生基于植物組培技術(shù)的基本原理，參與“天冬組培的適宜條件”的探究，解釋并歸納不同培養(yǎng)條件對組培結(jié)果的影響，讓學(xué)生在實踐課堂上體會到植物的生命活動，同時引導(dǎo)學(xué)生反思操作不足之處并建立更優(yōu)實驗設(shè)計。

本文以天冬組培條件篩選為例，結(jié)合文獻匯總、方案設(shè)計、數(shù)據(jù)分析、問題討論、教學(xué)反饋等課程教學(xué)思路，使學(xué)生建立對植物組織培養(yǎng)的基本概念，加深學(xué)習(xí)該門課程重要性的認識。通過總結(jié)教學(xué)過程中存在的問題與不足，探究該課程的改革與創(chuàng)新模式，最終達到培養(yǎng)學(xué)生自主思考及科研精神，增強學(xué)生對生命科學(xué)領(lǐng)域興趣，強化學(xué)生動手實踐能力。該研究結(jié)果為植物組織培養(yǎng)實驗教學(xué)改革提供思路的同時，也為培養(yǎng)學(xué)生科研能力奠定基礎(chǔ)。

一、課程教學(xué)背景

植物的組織培養(yǎng)又叫離體培養(yǎng)，指從植物體分離出符合需要的組織、器官或細胞，原生質(zhì)體等，在無菌條件下接種在含有各種營養(yǎng)物質(zhì)及植物激素的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)以獲得再生的完整植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟價值的其他產(chǎn)品的技術(shù)[10]。目前該項技術(shù)理論基礎(chǔ)已較全面，且現(xiàn)有植物組培技術(shù)體系成熟，應(yīng)用廣泛。但中藥材天冬通過組培實現(xiàn)種苗大規(guī)模生產(chǎn)還沒有顯著成果，未能投入生產(chǎn)實踐，限制了天冬種植產(chǎn)業(yè)發(fā)展。結(jié)合現(xiàn)實產(chǎn)業(yè)發(fā)展需要，在現(xiàn)有組培技術(shù)成果支持下創(chuàng)新開發(fā)天冬組培體系，通過學(xué)習(xí)理論知識，實踐操作方法，為人才培養(yǎng)和產(chǎn)業(yè)應(yīng)用提供支持和保證。

二、研究內(nèi)容

（一）教學(xué)內(nèi)容

以天冬為研究對象，教師在理論課時對實驗基本原理、操作要領(lǐng)和注意事項加以講解，由學(xué)生完成配置培養(yǎng)基，實踐無菌技術(shù)操作，植物離體培養(yǎng)中的形態(tài)觀察等實驗步驟。探討不同部位帶芽莖段為外植體、不同消毒試劑及濃度、不同消毒時間對天冬叢生芽誘導(dǎo)的影響。

（二）實施方案

1、學(xué)生實驗的安排與設(shè)計。教師向?qū)W生講解植物組織培養(yǎng)發(fā)展歷程、組培技術(shù)原理、無菌操作技術(shù)要點和注意事項，讓學(xué)生為實踐操作做好準備。參與實驗項目的學(xué)生人數(shù)約30人。隨機平均分為5個組，每組6人，一名組長，統(tǒng)籌規(guī)劃小組總體實驗任務(wù)與安排。一是學(xué)生收集文獻資料，查閱并歸納總結(jié)，撰寫綜述。二是基于實驗需求和研究思路，設(shè)計實驗方案，由指導(dǎo)老師對其方案進行可行性分析并提出建議后，開展實驗。三是所需研究平臺、儀器設(shè)備及試劑耗材等均由研究院為學(xué)生提供。四是根據(jù)研究結(jié)果，指導(dǎo)學(xué)生完成總結(jié)和討論分析，撰寫實驗報告。

2、儀器與試劑。天冬外植體采集于貴州大學(xué)試驗基地，根據(jù)設(shè)計的實驗安排進行外植體處理與接種操作。

千分之一電子天平（C2002，杭州萬特衡器有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-100SⅡ，上海博迅實業(yè)有限公司）；超凈工作臺（SW-CJ-2D，上海蘇凈實業(yè)有限公司）；MS 培養(yǎng)基（青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司）；瓊脂粉（北京索萊寶科技有限公司）；NAA（北京索萊寶科技有限公司）；6-BA（北京索萊寶科技有限公司）；次氯酸鈉（天津富宇精細化工有限公司）；氯化汞（升汞，Sigma-Aldric）；75%酒精；所用試劑均為分析純。

3、方法與結(jié)果。第一，誘導(dǎo)培養(yǎng)基配制：準確稱取4.74gMS 基礎(chǔ)培養(yǎng)基和30g 蔗糖溶于1L 蒸餾水中，添加0.1mg ·L-1NAA 和1.0mg ·L-16-BA 充分攪拌后調(diào)節(jié)pH 至5.8-6.0，轉(zhuǎn)移至組培瓶中高壓蒸汽滅菌。第二，外植體部位選擇：選取1年生天冬新抽芯枝條的不同部位帶芽莖段，置于流水下沖洗2h 除去表面灰塵；常規(guī)消毒后切至2cm 左右長度，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基，統(tǒng)計誘導(dǎo)率及污染率。第三，消毒試劑配置及時間確定：分別精密稱量升汞0.25g、0.5g，溶解后轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶中用蒸餾水定容，配置成體積分數(shù)為0.1%、0.2%的升汞溶液，同樣的方法配置1%、2%的次氯酸鈉溶液，用于外植體消毒。兩種消毒試劑設(shè)置不同的消毒時間，升汞溶液消毒時間梯度為4min、6min、8min；次氯酸鈉溶液為：6min、8min、10min。第四，操作步驟：將選取的不同部位帶芽莖段外植體流水沖洗4～6h后轉(zhuǎn)移至超凈工作臺中，切至2cm 左右的近端按照消毒設(shè)計方案消毒后，搭配75%酒精消毒5min，無菌水沖洗3～4 次，濾紙吸干多余水分，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，21d后觀察實驗結(jié)果，統(tǒng)計不同外植體的誘導(dǎo)率與不同消毒試劑、濃度、時間的污染率。第五，實驗結(jié)果統(tǒng)計：外植體的選擇對于構(gòu)建天冬組織培養(yǎng)快速繁殖體系是關(guān)鍵步驟，試驗結(jié)果表明，中段帶芽莖段誘導(dǎo)不定芽效果最佳，其誘導(dǎo)率達到了73.33%，誘導(dǎo)倍數(shù)為2.2倍，其次為下段帶芽莖段誘導(dǎo)率為37.78%，誘導(dǎo)倍數(shù)為1.23 倍，而頂端帶芽莖段效果較差誘導(dǎo)率只有13.11%，誘導(dǎo)倍數(shù)只有0.4倍，頂端誘導(dǎo)效果不明顯主要原因為頂端芽較為嫩綠，容易受環(huán)境的影響導(dǎo)致枯萎死亡不易誘導(dǎo)出不定芽。而中段芽段，老嫩適中，不容易受環(huán)境的影響，更容易具備分化出芽的能力。老段芽段雖然不易受環(huán)境的影響，但由于細胞的老化，減緩了分化成芽的概率。

本研究利用不同消毒劑及不同濃度和消毒時間進行試驗，結(jié)果表明，當次氯酸濃度達到2%時，消毒時間為10min時可大大降低污染率，升汞濃度達到0.2%時，消毒時間達到8min時也能有效降低污染（見圖1）。

圖1 不同消毒劑消毒效果

（三）實驗總結(jié)與討論

完成實驗后，各個小組針對結(jié)果進行分析，結(jié)合討論和總結(jié)，撰寫實驗報告。指導(dǎo)老師基于學(xué)生的操作過程和實驗結(jié)果，對該實驗的注意事項、重難點和下一步的研究計劃進行具體分析。

三、教學(xué)效果反饋

通過前期課堂理論知識學(xué)習(xí)，學(xué)生對實驗原理進行了解，同時查閱資料參與實驗方案設(shè)計、撰寫研究綜述、實踐操作培訓(xùn)、數(shù)據(jù)處理分析等，培養(yǎng)了學(xué)生主動學(xué)習(xí)和探究能力，提高了無菌操作技能以及科研思維。第一，通過實驗，使學(xué)生清楚地知道植物組培的基本操作過程，也進行了無菌實踐操作，掌握該項技術(shù)核心操作要求；第二，通過實驗使學(xué)生了解植物組培外植體存活率和污染率與取材部位、消毒劑濃度和消毒時間有重要關(guān)系；第三，通過觀察天冬組培實驗結(jié)果，學(xué)生明白了組培實驗中條件的改變對最終結(jié)果的影響，將理論知識可視化，使整個過程更加生動形象；第四，以存活率和污染率為判定指標，對莖段為外植體的組培條件進行篩選，這個過程使學(xué)生明白材料差異和操作不同對最終結(jié)果的影響；第五，該項目為其他設(shè)計性實驗課程奠定了良好的基礎(chǔ)，進一步開拓了學(xué)生的自主創(chuàng)新思維。

四、實驗教學(xué)反思

（一）存在問題

1、學(xué)習(xí)被動。大多數(shù)高校開展實驗課程都是老師安排，學(xué)生跟著老師操作完成，最后撰寫一份實驗報告。學(xué)生對各因素具體影響效果不甚了解，整個過程很多都是機械地重復(fù)驗證性試驗，學(xué)生創(chuàng)新性思維得不到有效發(fā)揮，理論知識難以深化。

2、開展植物組織培養(yǎng)課程所選取的實驗材料單一。通常每種植物都具有其獨有特性和特點，而這門課程在生產(chǎn)實踐上應(yīng)用的對象卻極為廣泛，難以達到普適性。

3、植物組織培養(yǎng)課程相對學(xué)時較短。理論學(xué)習(xí)課時占比大于實踐操作，學(xué)生真正動手的機會較少。

（二）解決措施

1、培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新思維和自主學(xué)習(xí)能力。創(chuàng)新思維模式和良好的自主學(xué)習(xí)能力，是當代大學(xué)生需具備的重要能力，在本次實驗課程的教學(xué)過程中，通過特定的研究目標，讓學(xué)生自主查閱文獻、視頻資料，了解國內(nèi)外研究進展，挖掘問題，設(shè)計技術(shù)路線，提出實驗方案，明確實驗內(nèi)容，從而達到培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新思維和自主學(xué)習(xí)能力的目的[11]。

2、材料多元化，面向?qū)嶋H應(yīng)用。在課程開展時應(yīng)當準備多種材料，讓學(xué)生有多項選擇，同時實驗課程要面向生產(chǎn)，結(jié)合當前社會生產(chǎn)實際需要，積極開拓領(lǐng)域。將“產(chǎn)學(xué)研”落實到課堂，培養(yǎng)學(xué)生為生產(chǎn)服務(wù)的意識[12]。

3、理論與實踐結(jié)合開展。在課程教學(xué)過程中，應(yīng)該讓學(xué)生盡可能參與實驗，教師需結(jié)合實驗平臺對實驗進行可行性分析判斷，最大程度地滿足理論與實踐相結(jié)合的需求，如在實驗開展過程中引入理論知識，結(jié)合實際情況進行現(xiàn)場教學(xué)，讓學(xué)生對知識的理解更加深入。

五、總結(jié)

植物組織培養(yǎng)課程是一門應(yīng)用性很強的課程，無論是珍稀植物的保存、繁殖，還是園藝花卉的生產(chǎn)或者生產(chǎn)種用的育苗和脫毒復(fù)壯等等，都需要用到組織培養(yǎng)技術(shù)的知識。但在很多高校組培課程開展上還停留在表面形式，這限制了學(xué)生的開創(chuàng)思維、學(xué)習(xí)興趣和自主學(xué)習(xí)能力，從根本上限制了組培相關(guān)技術(shù)與產(chǎn)業(yè)發(fā)展。高校在開展實驗課程時需要加強教學(xué)改革，實現(xiàn)教、研結(jié)合，激發(fā)學(xué)生自主學(xué)習(xí)興趣，主動提出研究內(nèi)容、設(shè)計實驗方案并開展實驗，使其主觀能動性得到充分發(fā)揮，使其具有創(chuàng)新思維、開拓精神和實踐動手能力。最終推動學(xué)科發(fā)展，讓學(xué)生具備新時代人才所要求的職業(yè)素養(yǎng)，成為未來產(chǎn)業(yè)發(fā)展的支柱。