光遺傳學(xué)技術(shù)治療心房顫動的作用機(jī)制及應(yīng)用研究進(jìn)展

程錦瀟，王晞

武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科 武漢大學(xué)心血管病研究所 心血管病湖北省重點實驗室，武漢 430060

光遺傳學(xué)技術(shù)是21世紀(jì)備受關(guān)注的細(xì)胞生物學(xué)研究技術(shù)，它結(jié)合了遺傳學(xué)與光控技術(shù)，通過將光敏感蛋白特異性表達(dá)在可興奮細(xì)胞的細(xì)胞膜上，再利用特定波長的光照激活光敏感蛋白以控制離子的跨膜流動，從而實現(xiàn)細(xì)胞膜的去極化或超極化［1］。光遺傳學(xué)技術(shù)的起源最早可追溯到上世紀(jì)70年代，由OESTERHELT和STOECKENIUS兩位科學(xué)家在嗜鹽桿菌的紫膜上發(fā)現(xiàn)了一種與視紫紅質(zhì)結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)，在光照條件下可以被激活，將質(zhì)子泵出細(xì)胞外［2］。從此，學(xué)術(shù)界針對光敏感蛋白展開了一系列的研究，其中突破最大的是BOYDEN等［3］將視紫紅質(zhì)通道蛋白2（ChR2）表達(dá)在哺乳動物的神經(jīng)元上，實現(xiàn)了光照對特定神經(jīng)元的精細(xì)調(diào)控。DEISSEROTH 等［4］于次年首次提出光遺傳學(xué)這一概念，將其定義為一種將遺傳學(xué)技術(shù)與光學(xué)操作相結(jié)合，以實現(xiàn)光對組織器官精細(xì)調(diào)控的新技術(shù)。光遺傳學(xué)技術(shù)于2010年被正式引入心臟電生理研究，ARRENBERG等［5］和BRUEGMANN 等［6］先后將光遺傳學(xué)應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因斑馬魚及小鼠的心肌細(xì)胞，并進(jìn)行心臟節(jié)律研究，從此光遺傳學(xué)技術(shù)逐漸應(yīng)用于終止心律失常、光起搏和心臟再同步治療等［7］。心房顫動（簡稱房顫）是目前最常見的快速性心律失常，具有很高的致死率和致殘率［8］。復(fù)律治療不僅能有效改善患者的臨床癥狀，也能預(yù)防血栓形成，在一定程度上還能阻止房顫的自然進(jìn)展，提高患者的生活質(zhì)量［9］。與傳統(tǒng)的房顫復(fù)律措施相比，光遺傳學(xué)技術(shù)有著更高的時空分辨率，可以應(yīng)用光照對心房內(nèi)的異常放電部位進(jìn)行調(diào)控，因而基于光遺傳學(xué)技術(shù)的房顫復(fù)律治療得到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。本文就光遺傳學(xué)技術(shù)終止房顫發(fā)作的相關(guān)機(jī)制及其應(yīng)用情況作一綜述，為房顫的復(fù)律治療提供一種新的選擇。

1 光遺傳學(xué)技術(shù)治療房顫的作用機(jī)制

1.1 房顫的發(fā)病機(jī)制及“轉(zhuǎn)子”學(xué)說 房顫是一種復(fù)雜的持續(xù)性心律失常，盡管近年來學(xué)術(shù)界針對其發(fā)病機(jī)制做出了一系列的探索，但是我們對于房顫的確切發(fā)病機(jī)制仍然缺少一個明確的認(rèn)識［10］。目前，被學(xué)術(shù)界廣泛認(rèn)同的觀點是房顫的發(fā)生發(fā)展機(jī)制可以分為觸發(fā)機(jī)制和維持機(jī)制［11］。HAISSAGUERRE等［12］早期提出，引發(fā)房顫的異位電活動95%來自于肺靜脈肌袖，其余5%來自于上下腔靜脈。據(jù)此，環(huán)肺靜脈隔離術(shù)成為房顫導(dǎo)管消融的基礎(chǔ)術(shù)式。之后，除了腔靜脈和肺靜脈的其他心臟解剖結(jié)構(gòu)，如Marshall韌帶、左心耳、右心耳、卵圓窩等，作為房顫的異位激活灶也相繼被證實［13］。然而，心腔的異位電激活并不是引起房顫發(fā)作的充分必要條件，有研究表明正常人的心臟內(nèi)也會發(fā)生異常電活動［14］。房顫被觸發(fā)之后，其發(fā)作具有不確定性，有的發(fā)作是短暫的，有的發(fā)作是持續(xù)性的，甚至在沒有異位激活的時候仍然可以出現(xiàn)房顫的發(fā)作［9］。所以房顫的形成除了有觸發(fā)因素之外，維持因素的存在也起到了不可忽視的作用。目前廣泛認(rèn)可的房顫維持機(jī)制有“多子波折返”學(xué)說、局灶驅(qū)動伴顫動樣傳導(dǎo)以及近年來備受關(guān)注的“轉(zhuǎn)子”學(xué)說。轉(zhuǎn)子是一種螺旋形、雜亂無章的電活動，圍繞著一個不可激發(fā)的核心［15］。在離體心臟實驗中已經(jīng)證明了轉(zhuǎn)子的存在，單個轉(zhuǎn)子可以引起單形性快速心律失常，額外的轉(zhuǎn)子可以引起多形性快速心律失常［16］。最近的研究表明，光遺傳學(xué)可以對心房內(nèi)的轉(zhuǎn)子進(jìn)行操控，利用轉(zhuǎn)子可漂移的特性對其進(jìn)行靶向消除［17］。

1.2 光遺傳學(xué)技術(shù)對轉(zhuǎn)子的消除作用 轉(zhuǎn)子是心肌組織中圍繞著一個不可激發(fā)的核心而形成的一種呈螺旋形且雜亂無章的電活動，目前轉(zhuǎn)子被廣泛認(rèn)為是房顫發(fā)生的驅(qū)動灶。心肌組織的興奮性改變可以導(dǎo)致轉(zhuǎn)子核心的移位，奠定了光遺傳學(xué)技術(shù)消除轉(zhuǎn)子治療房顫的可行性。FEOLA等［18］將ChR2表達(dá)在新生大鼠心房肌細(xì)胞（nraCMC）上，隨后通過S1-S2光交叉場刺激，在大鼠心房肌細(xì)胞上成功誘導(dǎo)出單個、穩(wěn)定、集中的轉(zhuǎn)子，然后通過精確的光定位在轉(zhuǎn)子的核心或者周邊區(qū)域誘導(dǎo)出圓形或條塊狀的光傳導(dǎo)塊；當(dāng)在轉(zhuǎn)子核心區(qū)域被局部照射誘導(dǎo)出圓形光傳導(dǎo)塊時，出現(xiàn)到了兩種同時發(fā)生的現(xiàn)象，即出現(xiàn)了一個新的電波和形成了功能性傳導(dǎo)阻滯；在光傳導(dǎo)塊的作用下，新的電波與現(xiàn)有轉(zhuǎn)子激活的前沿發(fā)生碰撞，因而產(chǎn)生了新的折返波，新的折返波被錨定到被誘導(dǎo)功能性傳導(dǎo)阻滯的照明區(qū)，從而維持心律失?；顒?。所以，在轉(zhuǎn)子核心區(qū)域局部照射誘導(dǎo)出圓形光傳導(dǎo)塊時沒有終止轉(zhuǎn)子，而是將轉(zhuǎn)子核心區(qū)靶向轉(zhuǎn)化一種新的折返回路；隨后在轉(zhuǎn)子核心區(qū)域誘導(dǎo)出經(jīng)過核心的條塊狀光傳導(dǎo)塊時，出現(xiàn)了與之前一樣的現(xiàn)象；但是當(dāng)FEOLA等［18］將nraCMC上光傳導(dǎo)塊的長度延長至穿過核心，并達(dá)到至少一個不可激發(fā)的邊界時，轉(zhuǎn)子沿著傳導(dǎo)塊向不可激發(fā)的邊界漂移，并與之發(fā)生碰撞而消失。因此，轉(zhuǎn)子漂移的機(jī)制可能是持續(xù)局部光照導(dǎo)致心肌細(xì)胞興奮性降低而產(chǎn)生了一個興奮性梯度，使得轉(zhuǎn)子向興奮性低的地方漂移。隨后，MAJUMDER等［19］通過光誘導(dǎo)興奮性梯度誘導(dǎo)了兩個轉(zhuǎn)子的對向移動，使得轉(zhuǎn)子核心區(qū)域發(fā)生碰撞，結(jié)果兩個轉(zhuǎn)子核心相互碰撞之后轉(zhuǎn)子也隨之消失。以上實驗證明，光遺傳學(xué)技術(shù)可以通過誘導(dǎo)產(chǎn)生局部光傳導(dǎo)塊而終止房顫，但是需要傳導(dǎo)塊經(jīng)過轉(zhuǎn)子核心，且到達(dá)至少一個不可激發(fā)的邊界的塊狀線，又或者可以通過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)子間的碰撞而終止房顫，這一重大發(fā)現(xiàn)提高了光遺傳學(xué)技術(shù)對轉(zhuǎn)子消融機(jī)制的理解。

2 光遺傳學(xué)技術(shù)在房顫治療中的應(yīng)用

目前，房顫的復(fù)律治療可以通過填充心肌的可興奮間隙來恢復(fù)竇性心律，并阻止心律失常的傳播?？膳d奮間隙是指上一個異位起搏點引起的去極化心肌組織和下一個異常電信號引起去極化的心肌組織之間的可興奮但未興奮的心肌組織?？膳d奮間隙也可以通過增加心臟波長來減小，而心臟波長是傳導(dǎo)速度和動作電位持續(xù)時間（APD）的乘積。通過延長APD持續(xù)時間的光遺傳學(xué)操作可以實現(xiàn)填充可興奮間隙，從而終止房顫發(fā)作。心臟電復(fù)律通過一定強度的電擊，導(dǎo)致大量心肌細(xì)胞除極，并延長隨后的動作電位，從而使心肌細(xì)胞對下一個心律失常無反應(yīng)。但是，電復(fù)律存在若干個缺點：①電流誘導(dǎo)的去極化電流是廣泛且瞬時的；②治療過程需要使用鎮(zhèn)靜劑來減輕患者的痛苦，增加了電復(fù)律的局限性；③除顫波對心肌細(xì)胞膜電位有不均勻影響，增加了超極化細(xì)胞的數(shù)量，導(dǎo)致心肌細(xì)胞之間出現(xiàn)電位梯度，從而引發(fā)心律失常再次形成。相比于電除顫，光遺傳學(xué)技術(shù)可以產(chǎn)生連續(xù)、無痛的去極化電流，且不會破壞心肌和周圍組織。因此，我們有理由認(rèn)為光遺傳學(xué)技術(shù)為房顫的復(fù)律治療提供了一種全新的選擇。我們將從離體實驗、在體實驗以及計算機(jī)模擬實驗三個方面闡述光遺傳學(xué)技術(shù)在終止房顫發(fā)作中的研究進(jìn)展。

2.1 光遺傳學(xué)技術(shù)在離體實驗中終止房顫發(fā)作在離體實驗，最開始由BINGEN等［20］將CatCh表達(dá)在新生大鼠心肌細(xì)胞單層，通過突發(fā)電起搏以誘導(dǎo)圍繞功能核心旋轉(zhuǎn)的螺旋波，并利用多電極陣列MEA研究CatCh激活對折返回路的影響。該研究團(tuán)隊首先用10 ms脈沖的470 nm藍(lán)光照射心肌細(xì)胞，結(jié)果僅在表達(dá)CatCh的心肌細(xì)胞單層中激發(fā)了動作電位，隨后將光脈沖延長至500 ms，發(fā)現(xiàn)在31個表達(dá)了CatCh的單層心肌細(xì)胞中折返回路全部被終止，而沒有表達(dá)CatCh的心肌細(xì)胞單層中折返回路對光照無反應(yīng)；這提示心肌細(xì)胞單層中的螺旋波可被光誘導(dǎo)的去極化電流終止，為非電擊除顫提供了概念驗證。之后NUSSINOVITCH等［21］將光敏感的超極化質(zhì)子泵ArchT表達(dá)在人胚胎腎細(xì)胞293（HEK293）上，隨后將ArchT-HEK293細(xì)胞與新生大鼠心肌細(xì)胞（NRCMs）或人胚胎干細(xì)胞源性心肌細(xì)胞（hESC-CMs）共同培養(yǎng)形成串聯(lián)細(xì)胞單元，之后應(yīng)用多電極陣列MEA記錄聚焦的590 nm黃光照射細(xì)胞之前、期間、之后的傳導(dǎo)和變時特性；結(jié)果顯示光照之后NRCMs的電活動完全被沉默，導(dǎo)致大鼠心肌細(xì)胞中局部傳導(dǎo)阻滯的發(fā)展；在光照下的hESC-CMs自發(fā)搏動顯著減慢，由光照前的（86 ± 9）次/分降低至光照后的（20 ± 4 ）次/分，證明超極化視蛋白被激活能穩(wěn)定膜電位，消除心律失常的傳播，在離體心肌細(xì)胞中可有效終止房顫。

2.2 光遺傳學(xué)技術(shù)在在體實驗中終止房顫發(fā)作BRUEGMAN等［22］將表達(dá)ChR2（H134R）的轉(zhuǎn)基因小鼠與房顫易感的連接蛋白40雜合突變（Cx40 Ala96Ser）小鼠進(jìn)行雜交，以此構(gòu)建出新的光遺傳學(xué)房顫易感的小鼠品系；將該品系小鼠心臟取出，灌注低鉀泰氏液體和KATP通道激活劑以誘發(fā)持續(xù)性房顫，隨后通過聚焦藍(lán)光（470 nm，0.4 mW/mm2）照射心外膜；結(jié)果顯示，相較于不表達(dá)光敏感蛋白的對照組小鼠，光遺傳學(xué)房顫易感的小鼠離體心臟經(jīng)過光照后房顫被有效終止。當(dāng)光遺傳學(xué)技術(shù)被證實在離體實驗中可以用于終止房顫發(fā)作之后，BRUEGMANN等［22］開始研究在體實驗中的光遺傳學(xué)技術(shù)復(fù)律治療，他們用攜帶ChR2的腺相關(guān)病毒來轉(zhuǎn)染小鼠的心臟，6 ～ 8個月后將小鼠麻醉后開胸，用靜脈刺激導(dǎo)管在心內(nèi)膜處予以Burst刺激，以誘發(fā)小鼠房顫發(fā)作，隨后用心外膜照射的方式觀察房顫的終止情況，結(jié)果顯示在首測的7只小鼠中有6只能通過光照終止房顫。同樣，近期發(fā)表的一項研究通過重組腺相關(guān)病毒［rAAV9-CAG-hChR2（XXM）-eYFP］轉(zhuǎn)染SD大鼠心肌細(xì)胞，通過Burst刺激（6 V、20 ms、2 ～ 4 s）誘發(fā)房顫后，對心房施加4個間隔1 s的光脈沖，觀察光照能否有效終止房顫；結(jié)果顯示，光照后大鼠房顫終止率明顯升高，房顫的持續(xù)時間也明顯縮短，證明光照能有效地在體內(nèi)終止房顫的進(jìn)展［23］。以上兩項研究證明，光遺傳學(xué)技術(shù)可以有效終止在體小鼠、大鼠的房顫發(fā)作。

2.3 光遺傳學(xué)技術(shù)在計算機(jī)模擬實驗中終止房顫發(fā)作 為研究光遺傳學(xué)的轉(zhuǎn)化潛力，BOYLE等［24］選擇了3例房撲伴纖維化患者，創(chuàng)建了由晚期Gd增強MRI掃描重建的特定患者模型，并模擬了ChR2表達(dá)，隨后對每個模型分別采用分散式照明和定向照明；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分布式照明的房性心動過速（AT）終止率很低，AT終止率從短脈沖（1 ～ 10 ms）的不足5%到長脈沖（100 ～ 1 000 ms）的20%左右；但是當(dāng)實驗人員嘗試使用定向照明終止相同的AT發(fā)作時，短脈沖的結(jié)果相似（AT終止率0%），但是長脈沖的結(jié)果明顯有所改善（AT終止率為54% ～ 90%）。因此，計算機(jī)模擬實驗有效地證明，持續(xù)時間長于房速周期長度的光脈沖可以有效終止房顫發(fā)作，這也為光遺傳學(xué)技術(shù)復(fù)律治療的臨床轉(zhuǎn)化提供了依據(jù)。

綜上所述，心臟光遺傳學(xué)技術(shù)是一種有潛力的房顫復(fù)律治療手段，特別是在年輕、癥狀明顯、藥物耐受和心力衰竭患者中，光遺傳學(xué)技術(shù)可能會使患者受益。但是，在考慮將這一項技術(shù)用于臨床之前，有幾個挑戰(zhàn)需要解決，比如光敏感蛋白的選擇、光敏感蛋白的傳遞策略和載體選擇，以及人體對載體和光敏感蛋白的免疫反應(yīng)等［25］。理想化載體的發(fā)現(xiàn)以及將光信號無創(chuàng)、有效地傳遞給靶細(xì)胞是目前光遺傳學(xué)轉(zhuǎn)化研究的重點難題。病毒是目前最常用的基因載體，腺相關(guān)病毒（AAV）是基礎(chǔ)研究和臨床試驗中最廣泛使用的病毒工具之一。AAV為野生型病毒，雖然沒有致毒潛力，但是我們?nèi)孕枰紤]到病毒的免疫原性［26］。由于AAV在人類中普遍存在，大多數(shù)的患者攜帶AAV抗體，因此開發(fā)一個不引起免疫反應(yīng)或者輕度免疫反應(yīng)的病毒株或血清型是有必要的［27］。另外，一些非病毒載體的研發(fā)也為光遺傳學(xué)技術(shù)轉(zhuǎn)化研究提供了一絲曙光，但是其不良反應(yīng)仍然沒有太多文獻(xiàn)報導(dǎo)。有效的光信號傳遞是光遺傳學(xué)技術(shù)臨床應(yīng)用的另一大挑戰(zhàn)。在傳統(tǒng)的心臟光遺傳學(xué)基礎(chǔ)研究中，通常采用心包外的可見光照射，而心內(nèi)膜光信號傳導(dǎo)仍然未得到有效解決。同樣，在跳動的心臟中提供適當(dāng)?shù)恼彰饕彩窍喈?dāng)困難的，目前雖然可以通過植入微型LED裝置來解決這一難題，但是其長期適用性仍有待考證。此外，光照產(chǎn)生的熱量會導(dǎo)致心臟產(chǎn)生程度不一的化學(xué)損傷和熱損傷，化學(xué)損傷可通過產(chǎn)生黃素、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和黑色素而引發(fā)［28］；熱損傷的產(chǎn)生可能會導(dǎo)致不可逆的細(xì)胞損傷，并引發(fā)新的心律失常［29］。另外值得注意的是，目前大多數(shù)研究是關(guān)于心肌細(xì)胞單層和計算機(jī)模擬實驗的，在活體心臟中的研究相對較少。因此，還需要更多的試驗來確定心臟光遺傳學(xué)技術(shù)在人體內(nèi)的安全性，以及光遺傳學(xué)技術(shù)在人體應(yīng)用的具體光學(xué)參數(shù)。雖然目前報道顯示機(jī)體對載體和視蛋白的免疫反應(yīng)很小，但是仍然需要足夠多的試驗數(shù)據(jù)來保證光遺傳學(xué)技術(shù)的安全性和可行性。光遺傳學(xué)使得基礎(chǔ)研究科學(xué)家和臨床醫(yī)生能夠精確地操縱細(xì)胞電活動，未來在心臟電生理領(lǐng)域中的研究重點是在人體中安全有效地調(diào)控心臟電活動。然而實現(xiàn)這一目的仍然還有很長的路要走，考慮到以上難題，光遺傳學(xué)技術(shù)的臨床轉(zhuǎn)化研究還需要經(jīng)過長時間的實踐探索。