布氏桿菌和羊口瘡血清抗體的檢測(cè)與分析

魏 敏,龍宥茨，張煜杭，姬格金，梁 倩，鮮思美

貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550025

羊布氏桿菌?。ㄑ虿疾。?，是一種由布氏桿菌感染引起的具有較強(qiáng)傳染性的慢性傳染病，危害性強(qiáng)且流行范圍廣。病菌通過(guò)呼吸道、生殖系統(tǒng)、消化道進(jìn)行傳播。人和家畜接觸或是食用了羊肉、羊奶，甚至是吸入帶病菌的灰土都會(huì)被傳染。此病對(duì)妊娠期間的母畜危險(xiǎn)性較大，可導(dǎo)致母畜流產(chǎn)，易發(fā)生子宮內(nèi)膜炎，影響后期受孕。公羊感染會(huì)發(fā)生睪丸炎、睪丸萎縮，導(dǎo)致公羊行走不暢，繁衍能力消失。羊口瘡，又稱(chēng)傳染性膿皰，是由羊口瘡病毒引起綿羊、山羊的急性、接觸傳染性、嗜上皮性的人獸共患病。OrfV 可通過(guò)損傷的皮膚或黏膜感染動(dòng)物，在口、唇、舌、鼻、乳房等部位的皮膚和黏膜會(huì)形成丘疹、水皰、膿皰、潰瘍，最后結(jié)成疣狀厚痂。綿羊和山羊?yàn)橹饕母腥緞?dòng)物，尤其是3 ～6月齡的羔羊最為敏感，群體感染性高，致死率高。布魯氏桿菌病和羊口瘡均是人獸共患傳染病，疫病的發(fā)生不僅給羊產(chǎn)業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且威脅人類(lèi)健康，存在社會(huì)公共衛(wèi)生安全隱患。因此開(kāi)展羊血清中布病和羊口瘡抗體的檢測(cè)具有重要意義。本試驗(yàn)采用虎紅平板凝集試驗(yàn)和間接ELISA 方法對(duì)臨床上采集的423 份羊血清樣本進(jìn)行了布氏桿菌和羊口瘡抗體的檢測(cè)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 血清樣本

423 份羊血清樣本（布魯氏桿菌疫苗未免疫羊血清樣本423 份，羊口瘡疫苗免疫羊血清樣本243份、未免疫羊血清樣本180 份）均由貴州大學(xué)動(dòng)物疫病研究室保存。

1.1.2 主要試劑

布氏桿菌病標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清及陰性血清、布氏桿菌病虎紅平板凝集抗原購(gòu)自青島易邦生物工程有限公司；羊口瘡病毒B2L-F1L 截短融合蛋白由貴州大學(xué)動(dòng)物疫病研究室制備保存；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；TMB 顯色液、酶標(biāo)條購(gòu)自Solarbio 科技有限公司；HRP 標(biāo)記兔抗山羊IgG 購(gòu)自重慶奧怡生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 虎紅平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)羊布氏桿菌

在虎紅平板反應(yīng)紙卡上，取被檢血清30 μL 與布魯桿菌凝集抗原30 μL 相混合，同時(shí)以布氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)陰性、陽(yáng)性血清作為對(duì)照，在5 min內(nèi)觀察結(jié)果。液體混合物出現(xiàn)卷邊、肉眼可見(jiàn)的凝集物，判定為陽(yáng)性；液體混合物均勻渾濁、無(wú)凝集物形成，判定為陰性。

1.2.2 B2L-F1L 截短融合蛋白濃度測(cè)定

采用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒對(duì)純化后保存的rB2L-F1L 融合蛋白進(jìn)行濃度測(cè)定。

1.2.3 基于羊口瘡病毒B2L-F1L 截短融合蛋白的間接ELISA 方法檢測(cè)血清抗體

采用本實(shí)驗(yàn)室前期研究建立的基于羊口瘡病毒B2L-F1L 截短融合蛋白的間接ELISA 方法檢測(cè)血清樣本。間接ELISA 的最佳反應(yīng)條件：rB2L-F1L 蛋白抗原最佳包被量為0.25 μg/mL，5%脫脂奶粉封閉1 h，血清最佳稀釋倍數(shù)1:200，一抗及酶標(biāo)二抗最佳孵育時(shí)間為1 h，酶標(biāo)二抗的最佳工作濃度為1:8 000，TMB 最佳顯色時(shí)間為15 min，OD450nm值≥0.358 判為陽(yáng)性，反之則判為陰性。具體操作如下。

①包被：取純化的rB2L-F1L 融合蛋白，將蛋白用包被液稀釋濃度為0.25 μg/mL，4 ℃過(guò)夜包被于96 孔板中，每孔100 μL。

② 洗滌：棄去包被液，用PBST 洗板3 次，每次3 min，并在吸水紙上拍干。

③ 封閉：每孔加入5 %的脫脂奶粉200 μL 于37 ℃封閉1 h。

④ 洗板：棄去多余的液體，用PBST 洗板3 次，每次3 min，并在吸水紙上拍干。

⑤ 一抗孵育：將待檢血清分別加入96 孔板中，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h。

⑥ 步驟同4。

⑦ 二抗孵育：每孔加入100 μL 辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的兔抗山羊IgG(1:8 000)，37 ℃孵育1 h。

⑧ 步驟同4。

⑨ TMB 顯色：每孔加入100 μL 的TMB 顯色液，37 ℃避光顯色15 min；加入50 μL 的終止液終止顯色，酶標(biāo)儀讀取OD450nm 值。

2 結(jié)果

2.1 虎紅平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)羊布氏桿菌病結(jié)果

采用虎紅平板凝集試驗(yàn)對(duì)臨床上采集的羊血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，布氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清樣本出現(xiàn)凝集物，陽(yáng)性對(duì)照成立；423 份羊血清樣本與標(biāo)準(zhǔn)陰性血清對(duì)照結(jié)果相同，即液體均勻渾濁、未見(jiàn)凝集物，即判定為羊布病抗體陰性。

2.2 基于羊口瘡病毒B2L-F1L 截短融合蛋白間接ELISA 檢測(cè)羊口瘡抗體結(jié)果

2.2.1 B2L-F1L 截短融合蛋白濃度測(cè)定結(jié)果

采用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒對(duì)純化后保存的B2L-F1L 蛋白進(jìn)行濃度測(cè)定，B2L-F1L 蛋白濃度為135 μg/mL，將蛋白進(jìn)行1:540 倍稀釋為ELISA 方法蛋白包被的使用濃度0.25 μg/mL。

2.2.2 間接ELISA 檢測(cè)羊口瘡血清抗體結(jié)果

采用間接ELISA 方法檢測(cè)423 份臨床采集的羊血清樣本，羊口瘡陰性血清和陽(yáng)性血清對(duì)照各2 孔。陰性血清對(duì)照孔的OD450nm 分別為0.163 和0.142，OD450nm 值＜0.358；陽(yáng)性血清對(duì)照孔的OD450nm 分別為0.574 和0.652，OD450nm 值＞0.358；表明本試驗(yàn)的陰、陽(yáng)性對(duì)照成立。檢測(cè)出羊口瘡疫苗免疫羊血清樣本陽(yáng)性率為62.55%（152/243），未免疫羊血清樣本陽(yáng)性率為14.44%（26/180）。

3 討論

布魯氏菌病為我國(guó)二類(lèi)動(dòng)物疫病，傳播速度快、范圍廣，目前全國(guó)羊群布病感染率呈上升趨勢(shì)，羊群布病防控形勢(shì)較嚴(yán)峻。血清學(xué)試驗(yàn)如試管凝集試驗(yàn)、虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等是診斷和檢測(cè)布病的常用方法。其中RBT 具有易攜帶、操作簡(jiǎn)便、成本低、檢測(cè)速度快、結(jié)果易觀察等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于基層的大面積布病篩查，然而該方法存在著“前帶現(xiàn)象”、假陽(yáng)性高且判斷結(jié)果存在主觀影響等缺點(diǎn)。

OrfV 通?？筛腥舅心挲g段的綿羊和山羊，其它各種反芻動(dòng)物和哺乳動(dòng)物，如駱駝、犬以及人等均有OrfV 感染的報(bào)告。目前，有許多方法可以對(duì)羊口瘡病毒感染進(jìn)行檢測(cè)，如病原學(xué)檢測(cè)方面有病毒分離鑒定以及常規(guī)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 等；血清學(xué)檢測(cè)方面有血清中和試驗(yàn)和ELISA 等。間接ELISA 方法是檢測(cè)OrfV 抗體的重要手段，Bora 等使用全病毒為包被抗原建立了檢測(cè)羊血清中OrfV抗體的間接ELISA 方法[1]，劉麗佳、張靜等將OrfV B2L 基因進(jìn)行截短以表達(dá)優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)建立了間接ELISA 方法。本試驗(yàn)以純化的rB2L-F1L 蛋白作為包被抗原建立間接ELISA 方法（該技術(shù)已獲得發(fā)明專(zhuān)利授權(quán)，ZL202110360839.6）對(duì)臨床血清樣本進(jìn)行檢測(cè)。由于目前OrfV 尚無(wú)商品化的ELISA 試劑盒，故本試驗(yàn)未能進(jìn)行臨床樣品符合率的比對(duì)研究。

我國(guó)陜西、西藏、四川、新疆、甘肅、云南、貴州等地區(qū)均有羊布氏桿菌病和羊口瘡的疫情暴發(fā)，目前針對(duì)兩種疾病均無(wú)特效藥治療，主要采取疫苗免疫進(jìn)行防控。根據(jù)國(guó)家發(fā)布的布氏桿菌病相關(guān)政策，貴州省是我國(guó)布病防控二類(lèi)地區(qū),原則上不實(shí)施免疫。但貴州省羊群布氏桿菌病感染率較高，因此先要對(duì)羊群進(jìn)行布氏桿菌病篩查,以防從業(yè)人員感染布病。目前羊口瘡病未列入國(guó)家免疫強(qiáng)制計(jì)劃，且暫無(wú)特效藥，主要使用弱毒疫苗和滅活疫苗進(jìn)行預(yù)防免疫，但弱毒疫苗會(huì)存在毒力返強(qiáng)、活病毒免疫逃避、免疫后抗體水平不高等缺點(diǎn)。滅活苗僅限于已發(fā)生過(guò)羊口瘡的羊場(chǎng)使用。為了解采樣羊群布氏桿菌病和羊口瘡抗體水平，本試驗(yàn)采用虎紅平板凝集試驗(yàn)和純化的rB2L-F1L 蛋白作為包被抗原建立間接ELISA 方法對(duì)臨床上采集的423 份羊血清樣本（布魯氏桿菌疫苗未免疫羊血清樣本423 份；羊口瘡疫苗免疫羊血清樣本243 份，未免疫羊血清樣本180 份）進(jìn)行布氏桿菌和羊口瘡的抗體水平檢測(cè)。結(jié)果顯示，羊布氏桿菌病抗體陰性，羊口瘡疫苗未免疫羊血清樣本陽(yáng)性率為14.44%（26/180），再結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查情況和臨床癥狀，表明羊群不存在布氏桿菌感染，但存在羊口瘡病毒感染。