果蠅微管互作蛋白的大規(guī)模篩選研究

王珊,王雄雄,金珊,劉志華,毛傳樨

(湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 湖北 武漢 430062)

0 引言

微管是由α和β微管蛋白形成的異二聚體頭尾相接所構(gòu)成的13條原纖維縱向排列而成.微管直徑為22～25 nm,內(nèi)徑為15 nm,管壁厚度5 nm左右.微管可與其他蛋白共同組裝,形成單管、二聯(lián)管、三聯(lián)管以及軸突、神經(jīng)管、紡錘體等結(jié)構(gòu). α與β微管蛋白結(jié)構(gòu)相似,均能結(jié)合GTP,其中,作為固有成分存在的GTP在α-微管蛋白上,不發(fā)生交換和水解,而發(fā)生水解或交換的GTP則與β-微管蛋白結(jié)合.此外還有一種微管蛋白,即γ-微管蛋白,然而它并不是微管的組成部分,但卻在微管的組裝中起作用.微管的組裝整體表現(xiàn)為一個(gè)踏車模型(treadmill model)的動(dòng)態(tài)過程,其次它還具有極性.微管正負(fù)極的定義是相對的,通常微管的正端是聚合速度大于解聚速度的一端.若解聚速度大于聚合速度,則為負(fù)端. 微管末端蛋白在微管的動(dòng)態(tài)聚合中至關(guān)重要,微管末端蛋白又分為微管正端蛋白、微管負(fù)端蛋白.微管正端蛋白也即微管正端示蹤蛋白(+TIPs),+TIPs的成員包括EB系列蛋白(EB1、EB2、EB3)、CLIP170和CLIP115以及p150glued等[1],+TIPs調(diào)節(jié)微管動(dòng)態(tài)以及微管與細(xì)胞皮層、有絲分裂活動(dòng)或不同細(xì)胞器的相互作用[2].與大量被發(fā)現(xiàn)的微管正端蛋白不同,目前發(fā)現(xiàn)的微管負(fù)端蛋白主要有3種,分別是γ-tubulin ring complex、Ninein、CAMSAP/Patronin family.γ-tubulin ring complex主要在微管成核方面起作用,Ninein在微管錨定中起作用,而CAMSAP/Patronin family作用在微管穩(wěn)定方面[3].在微管上除了各種末端蛋白,還有兩個(gè)關(guān)鍵的運(yùn)動(dòng)蛋白,驅(qū)動(dòng)蛋白(Kinesin)和動(dòng)力蛋白(Dynein),這兩個(gè)蛋白都以微管為軌跡來運(yùn)載“貨物”,并且運(yùn)載的是囊泡和細(xì)胞器之類的物質(zhì).兩種蛋白均需要水解ATP提供能量.此外,Kinesin和Dynein都是單向運(yùn)輸.絕大部分Kinesin以微管正端為導(dǎo)向,由微管負(fù)端運(yùn)輸?shù)秸?Dynein則與之相反,由微管正端運(yùn)輸?shù)截?fù)端.

微管在細(xì)胞中的功能舉足輕重.首先,它作為支架參與了細(xì)胞形態(tài)的維持,其以一定的抗壓和抗彎曲能力讓細(xì)胞擁有了機(jī)械支持力,防止了細(xì)胞破裂.并且微管對于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的正確定位不可或缺,微管的穩(wěn)定性被破壞,會(huì)影響高爾基體、線粒體等細(xì)胞器在細(xì)胞中的正確分布.第二,微管在細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂、減數(shù)分裂時(shí)構(gòu)成了紡錘體牽引染色體運(yùn)動(dòng).第三,微管是細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)摹败壍馈?其上的兩個(gè)運(yùn)動(dòng)蛋白Kinesin和Dynein沿著微管進(jìn)行物質(zhì)搬運(yùn),包括對神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)遞質(zhì)以及胞內(nèi)色素和小泡的運(yùn)輸.第四,微管還充當(dāng)了纖毛和鞭毛的運(yùn)動(dòng)元件,纖毛和鞭毛的運(yùn)動(dòng)原理主要是在動(dòng)力蛋白水解ATP作用下使相鄰的二聯(lián)鞭毛結(jié)構(gòu)微管相互滑動(dòng).總而言之,微管是機(jī)體不可或缺的“必需品”,參與了細(xì)胞的分裂、運(yùn)輸、運(yùn)動(dòng)、形態(tài)構(gòu)成、器官發(fā)育等一系列的生物學(xué)過程[4],并且微管可存在于哺乳動(dòng)物除了紅細(xì)胞外的幾乎所有細(xì)胞中.

微管的穩(wěn)定與人體健康密切相關(guān),在癌細(xì)胞中,微管穩(wěn)定性遭到破壞,形態(tài)被改變,相較于正常細(xì)胞中的微管,癌細(xì)胞中的微管短小且排列紊亂,因此,在醫(yī)學(xué)上,可通過微管的形態(tài)來判斷病人是否患有癌癥.近年來,微管與疾病相關(guān)聯(lián)的研究日益增多.最近的幾項(xiàng)研究顯示,在各種形式的心臟病中,被修飾的微管可以直接阻礙心肌細(xì)胞的收縮功能[5];富亮氨酸重復(fù)激酶2(LRRK2)與微管之間的關(guān)聯(lián)被破壞是家族性帕金森病最常見的病因[6];編碼微管相關(guān)磷酸化蛋白的MAP1B突變導(dǎo)致感覺神經(jīng)性聽力損失[7];動(dòng)態(tài)微管和穩(wěn)定微管之間的失衡是2,5-己二酮引起神經(jīng)退行性變的基礎(chǔ)[8];微管的組裝和動(dòng)態(tài)穩(wěn)定都受到tau蛋白的調(diào)控,而tau蛋白的脫離導(dǎo)致微管的解體,從而引發(fā)了阿爾茨海默癥[9];線粒體人體肽類似物HNG通過穩(wěn)定血小板微管而抑制血小板活化和血栓形成[10].種種跡象表明,微管的變化顯著影響著機(jī)體的健康,本研究通過對果蠅的遺傳篩選找出了40個(gè)影響微管穩(wěn)定的調(diào)控基因,這些基因?qū)θ祟愇⒐芟嚓P(guān)的疾病治療提供根本的解決途徑.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)所用果蠅品系見表1.

表1 實(shí)驗(yàn)所用果蠅品系

1.2 實(shí)驗(yàn)所用抗體及染料見表2.

表2 實(shí)驗(yàn)所用抗體及染料

1.3 實(shí)驗(yàn)所用解剖液及固定液配制生理解剖液見表3,固定液采用多聚甲醛溶液.

多聚甲醛固定液的配制:①首先配制0.2 mol/L PB (phosphate buffer),稱取8.26 g NaH2PO4·2H2O與21.8 g Na2HPO4溶于1 L超純水中,用NaOH調(diào)pH=7.3. ②稱取40 g多聚甲醛溶于500 mL水中,60 ℃水浴加熱,并不斷攪拌,直到澄清;由于加熱過程中,多聚甲醛揮發(fā)對人體有危害,所以要做好防護(hù)措施,佩戴口罩.加熱過程中,不宜將加熱的玻璃瓶蓋子擰緊. ③加入500 mL 0.2 mol/LPB,即為0.1 mol/L PB多聚甲醛溶液,用NaOH調(diào)pH=7.2～7.4.

表3 生理解剖緩沖液 HL3.1(pH=7.1～7.3)

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 果蠅幼蟲的解剖方法 ①用鑷子將果蠅三齡幼蟲夾出,放于滴有解剖液的平皿蓋子上,涮洗掉幼蟲身上的培養(yǎng)基,輕輕夾起幼蟲放于紙巾上吸干身上的解剖液.②將幼蟲夾入樹脂板解剖盤上,用解剖盤上的解剖針,分別固定住果蠅幼蟲的頭部、尾部,調(diào)整解剖針的位置使幼蟲身體充分伸展.③向固定住的幼蟲身上加一滴解剖液,完全浸沒幼蟲.在幼蟲頭、尾部用解剖剪各開一個(gè)橫切口,然后用解剖剪從幼蟲尾部沿著背中線剪到幼蟲頭部.④用解剖鑷子將幼蟲內(nèi)臟去除干凈,注意不要戳到幼蟲體壁,保持幼蟲肌肉的完整性.⑤用四根解剖針沿著頭、尾橫切口的兩邊位置,將幼蟲體壁固定成片狀,充分伸展,切勿褶皺.解剖針固定過程中盡量保證肌肉結(jié)構(gòu)完整性.

1.4.2 肌肉微管免疫染色方法 ①將解剖好的三齡幼蟲,用紙巾吸干解剖液,加入4% PFA固定液覆蓋體壁表面,室溫下40 min. ②用紙巾吸去固定液,用鑷子將固定好的體壁組織轉(zhuǎn)移至2 mL的EP管中,加入0.2% PBST溶液(1× PBS+0.2% TritonX-100),在側(cè)擺搖床上重復(fù)用0.2% PBST溶液震蕩洗滌,洗滌1 h,此間每10～15 min換一次EP管中的0.2% PBST溶液. ③吸去EP管中的PBST溶液,加入200 μL 0.2% PBST+5%山羊血清,在側(cè)擺搖床上室溫封閉40 min. ④吸去封閉液,加入一抗(按比例現(xiàn)配現(xiàn)用,用0.2% PBST溶液配制一抗),在側(cè)擺搖床上,室溫孵育3 h,也可將側(cè)擺搖床放入4 ℃冰箱進(jìn)行過夜孵育. ⑤吸去一抗,在側(cè)擺搖床上重復(fù)用0.2% PBST溶液震蕩洗滌,洗滌1 h,此間每10～15 min換一次EP管中的0.2% PBST溶液. ⑥吸去洗脫液,加入二抗(按比例現(xiàn)配現(xiàn)用,用0.2% PBST溶液配制二抗),在側(cè)擺搖床上,室溫孵育3 h,亦可將側(cè)擺搖床放入4 ℃冰箱進(jìn)行過夜孵育. ⑦吸去二抗,在側(cè)擺搖床上重復(fù)用0.2% PBST溶液震蕩洗滌,洗滌1 h,此間每10～15 min換一次EP管中的0.2% PBST溶液. ⑧夾出完成免疫染色的體壁組織,放在載玻片上擺整齊,用紙巾吸干體壁組織,在上面滴加封片油Vector shield,蓋上蓋玻片(小心操作,不要出現(xiàn)氣泡),然后于蓋玻片的四周,涂抹適量的指甲油用于密封,寫好標(biāo)記,將做好的樣片平放在暗盒里,4 ℃保存或直接用共聚焦熒光顯微鏡拍攝觀察.

1.5 圖片采集及處理本實(shí)驗(yàn)中所有免疫染色圖片的采集,均是通過Zeiss 激光共聚焦顯微鏡 LSM710和LSM980進(jìn)行拍攝,為了更好地觀察肌肉微管網(wǎng)絡(luò),我們均采集果蠅的第4體節(jié)2號(hào)肌肉上的微管,此處氣管相對較少,不易遮擋肌肉細(xì)胞,便于觀察微管網(wǎng)絡(luò).裁剪處理圖片則是用 Photoshop CS6 軟件.本實(shí)驗(yàn)中,篩選微管有表型的基因均重復(fù)2次及以上.

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)用果蠅三齡幼蟲肌肉系統(tǒng)為模型進(jìn)行微管相關(guān)蛋白的篩選本實(shí)驗(yàn)利用果蠅三齡幼蟲肌肉為模型系統(tǒng),將清華大學(xué)果蠅庫RNAi的部分基因的RNAi果蠅株與C57-Gal(肌肉系統(tǒng)特異性表達(dá)的Gal4)進(jìn)行雜交,通過對后代三齡幼蟲肌肉的微管進(jìn)行免疫染色,篩選出對微管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有影響的基因,篩選微管有表型的分類見2.2節(jié).我們用C57-Gal4驅(qū)動(dòng)RNAi果蠅,使果蠅在幼蟲時(shí)期的肌肉系統(tǒng)中敲減相應(yīng)的基因,并對其肌肉組織用α-tubulin的抗體進(jìn)行染色,以此來觀察其微管網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu),篩選出基因表達(dá)下調(diào)后,對微管網(wǎng)絡(luò)有影響的基因.本研究篩選了共計(jì)541株 RNAi果蠅,其中微管結(jié)構(gòu)異常的40株,微管結(jié)構(gòu)無表型的496株.有5株RNAi果蠅用C57-Gal4驅(qū)動(dòng)后,果蠅在幼蟲期死亡,表明這幾種基因?qū)壍陌l(fā)育至關(guān)重要,缺失這幾種基因?qū)壘哂兄旅?隨著人們對細(xì)胞骨架以及對非中心體微管組織中心的逐漸探索,加之其與某些人類疾病的關(guān)系密切,人們會(huì)更多地去尋求調(diào)節(jié)微管的相關(guān)基因,因此,我們的篩選結(jié)果會(huì)在一定程度上具有借鑒意義.

2.2 敲除后導(dǎo)致微管網(wǎng)絡(luò)異常的基因分類對于篩選到微管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)異常的RNAi的基因,我們將其表型分為6類,分別是:1)微管輕微斷裂;2)微管稀疏;3)微管核周凹陷;4)微管網(wǎng)絡(luò)密度增大;5)微管嚴(yán)重?cái)嗔?6)微管方向異常.此外,我們還單獨(dú)列出了致死類RNAi的基因,因?yàn)槠湓诠壢g幼蟲肌肉中表達(dá)下調(diào)時(shí)對果蠅的致命性,提示這些致死類的基因?qū)Πl(fā)育的重要性,并且在人類中的同源基因有極大可能有致病性,甚至與果蠅一樣,影響人類存活也未可知.

2.2.1 敲除后導(dǎo)致微管輕微斷裂的基因 本實(shí)驗(yàn)中篩選到敲除后導(dǎo)致微管網(wǎng)絡(luò)有表型的基因中,微管斷裂是最常見的表型之一.微管輕微斷裂表型的基因分別是CG17596、CG8171、CG12051、CG3325、CG3298、CG8230、CG11153、CG33102、CG16858、CG31043、CG5588、CG5272.這些基因功能敲減果蠅的免疫染色微管表型如圖1所示.

圖1 敲除后微管輕微斷裂表型的基因肌肉微管免疫染色圖細(xì)胞核(藍(lán)色)用核染料Hoechst33342標(biāo)記,肌肉微管(綠色)用抗體α-tubulin標(biāo)記(下同).

2.2.2 敲除后導(dǎo)致微管稀疏的基因 微管稀疏表型中也是有輕微的微管斷裂的,但并不是主要的微管表型,因此并未將這些基因歸為微管斷裂類別.篩選到微管變稀疏的RNAi的基因分別是CG16827、CG17271、CG2194、CG31005、CG9168、CG32068、CG10862、CG18628、CG5701、CG4994、CG4379.這些基因功能敲減果蠅的免疫染色微管表型如圖2所示,可以看出這些基因的微管與野生型對照相比都有著不同程度的變稀和減少.

圖2 敲除后微管稀疏表型的基因肌肉微管免疫染色圖

2.2.3 敲除后導(dǎo)致微管核周凹陷的基因 敲除后導(dǎo)致微管核周凹陷表型的基因分別是CG30495、CG4649、CG9027、CG31045、CG14815、CG15002、CG3339.這些基因功能敲減果蠅的免疫染色微管表型如圖3所示,可以看出這些基因的微管在細(xì)胞核周有一個(gè)凹陷.

圖3 敲除后導(dǎo)致微管核周凹陷表型的基因肌肉微管免疫染色圖圖上虛線圈中箭頭標(biāo)識(shí)處即為微管在核周凹陷的部位.

2.2.4 敲除后導(dǎo)致微管網(wǎng)絡(luò)密度增大的基因 敲除后導(dǎo)致微管網(wǎng)絡(luò)密度增大的基因只篩選到一株,即CG11546.這個(gè)基因功能敲減果蠅的免疫染色微管表型如圖4所示,它的肌肉微管核周網(wǎng)絡(luò)密度增大且連成一片.

2.2.5 敲除后導(dǎo)致微管嚴(yán)重?cái)嗔训幕?敲除后導(dǎo)致微管嚴(yán)重?cái)嗔驯硇偷幕蚬埠Y到7個(gè),分別是CG4871、CG1721、CG3697、CG1401、CG7186、CG14258、CG30395.這些基因功能敲減果蠅的免疫染色微管表型如圖5所示,可以看出,敲除這些基因后,微管斷裂程度較為嚴(yán)重,且微管斷裂得比較粉碎.

2.2.6 敲除后導(dǎo)致微管方向異常的基因 微管方向異常表型的RNAi的基因共篩到2株,分別是CG32698和CG9886.這兩株基因功能敲減果蠅的三齡幼蟲肌肉微管免疫染色如圖6所示,可以看出CG32698的微管都是縱向,且肌肉出現(xiàn)萎縮變的狹窄.CG9886則呈現(xiàn)出網(wǎng)格狀,由縱向和橫向的微管組成.

圖6 敲除后導(dǎo)致微管方向異常的基因肌肉微管免疫染色圖

2.2.7 敲除后導(dǎo)致果蠅幼蟲期致死的基因 敲除后導(dǎo)致果蠅幼蟲期致死的基因共篩到5株,分別是CG7834、CG18001、CG44252、CG6859、CG1449.

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過篩選清華大學(xué)提供的RNAi果蠅庫果蠅,試圖找出調(diào)控微管的相關(guān)基因.具體方法是讓基因在果蠅三齡幼蟲肌肉組織中沉默表達(dá),免疫染色后觀察相關(guān)的RNAi的基因在肌肉中特定位置(第四體節(jié)二號(hào)肌肉)的微管形態(tài).對于沒有微管表型的RNAi的基因則放棄篩選,有微管表型的則重復(fù)驗(yàn)證表型.本實(shí)驗(yàn)共計(jì)篩選清華RNAi果蠅541株,其中有肌肉微管表型的40株,此外,還篩選出在幼蟲期致死的RNAi的基因5個(gè).在篩選出微管有表型的基因后,我們將其分為6類,分別是減少輕微斷裂型、減少變稀型、核周凹陷型、核周聚集網(wǎng)絡(luò)密度增大型、粉碎嚴(yán)重?cái)嗔研汀⒎较虍惓Ｐ?在篩選出的基因中,我們發(fā)現(xiàn)了一些與細(xì)胞核、高爾基體、線粒體等細(xì)胞器相關(guān)的基因.例如CG3298編碼蛋白R(shí)ibonuclease Z,參與核前tRNA加工和線粒體初級(jí)轉(zhuǎn)錄加工,該基因的人類同源基因與聯(lián)合氧化磷酸化缺陷有關(guān).CG8230 預(yù)測參與高爾基體的組織,該基因的人類同源基因與Dyggve-Melchior-Clausen疾病、Smith-McCort發(fā)育不良和軟骨發(fā)育不良有關(guān).CG11153編碼蛋白Sox102F,預(yù)測具有DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性,參與心臟收縮的正調(diào)節(jié),預(yù)測定位到細(xì)胞核,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá).該基因的人類同源基因與老年癡呆癥、心臟病和高級(jí)別膠質(zhì)瘤有關(guān).CG9027編碼蛋白Superoxide dismutase 3,此蛋白具有超氧化物歧化酶活性,并參與了紫外線防護(hù)、超氧自由基的清除等過程,該基因的人類同源基因與動(dòng)脈疾病、眼科疾病、糖代謝疾病、肺部疾病以及神經(jīng)退行性疾病有關(guān).CG14815編碼蛋白Peroxin 5,參與了過氧化物酶體組織,目前已知定位在細(xì)胞質(zhì)、過氧化物酶體,該基因的人類同源基因與過氧化物酶體生物發(fā)生障礙2A及2B、根狀軟骨發(fā)育不良的點(diǎn)狀5型有關(guān).篩選中還有一些基因的相關(guān)報(bào)道較少[11-13],基因的功能也知之甚少,所以這些基因是如何發(fā)揮作用調(diào)控微管穩(wěn)定還有待進(jìn)一步探究.