基于FoxP3、RORγt及相關(guān)細(xì)胞因子探討半夏瀉心湯對(duì)慢性萎縮性胃炎的干預(yù)機(jī)制▲

韋玉娜 羅旋特 艾 軍 游 琛 何 泉 張亞萍

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,廣西南寧市 530200)

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)是胃黏膜因受致病因素反復(fù)刺激而出現(xiàn)固有層腺體萎縮或腸上皮化生、異型增生的一種慢性消化道疾病[1],主要表現(xiàn)為脹滿(mǎn)、納呆、胃脘痛等癥狀[2]。CAG的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚,目前認(rèn)為與幽門(mén)螺桿菌感染、年齡、免疫因素等有關(guān)[3]。正常胃黏膜-慢性淺表性胃炎-CAG-腸上皮化生-異型增生-胃癌是胃癌發(fā)生的主要病理通路[4]。據(jù)統(tǒng)計(jì),CAG的癌變率可達(dá)10%～14%[5],亞洲是CAG 發(fā)生的主要地區(qū),其中我國(guó)的CAG發(fā)病率最高[6],且我國(guó)2020年胃癌新發(fā)病例數(shù)在所有癌癥中位居第4[7]。及時(shí)阻斷CAG的進(jìn)展,對(duì)于降低胃癌發(fā)病率具有重要意義。

Th17與組織炎癥、自身免疫疾病的發(fā)生有著密切聯(lián)系,其可分泌白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-17、 IL-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)等炎癥因子,其中IL-17是Th17的特異性細(xì)胞因子,可與中性粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞等細(xì)胞的IL-17受體結(jié)合從而發(fā)揮促炎作用[8-9]。調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(regulatory T lymphocyte,Treg)是一類(lèi)能介導(dǎo)多種免疫效應(yīng)的T淋巴細(xì)胞亞群,可通過(guò)分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor β,TGF-β)、IL-10來(lái)促進(jìn)自身分化,同時(shí)TGF-β、IL-10還可通過(guò)誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)[10]。Th17和Treg通過(guò)分泌細(xì)胞因子以相互作用,共同維持機(jī)體的免疫平衡[11]。Th17和Treg的分化分別受轉(zhuǎn)錄因子RAR相關(guān)孤兒受體γt (RAR-related orphan receptor gamma t,RORγt)和叉頭框蛋白P3(forkhead box P3,FoxP3)的調(diào)控,而RORγt和FoxP3與胃癌的發(fā)生和病理變化高度相關(guān)[12-13]。

目前,西醫(yī)治療CAG的常用藥物有葉酸、維酶素等[2],其中葉酸具有抑制胃黏膜炎癥反應(yīng)和修復(fù)胃黏膜的作用[14]。中醫(yī)藥治療CAG具有整體化、個(gè)性化、副作用少的優(yōu)勢(shì)[15]。中藥方劑半夏瀉心湯出自張仲景的《傷寒雜病論》,是治療痞滿(mǎn)的經(jīng)典方劑,全方由法半夏、黨參、干姜、黃連、黃芩、炙甘草、大棗組成,具有健脾益氣、解毒消痞的功效。潘小亮等[16]應(yīng)用加味半夏瀉心湯治療CAG,發(fā)現(xiàn)總有效率達(dá)96.7%。有研究報(bào)告,黃連中的黃連素可抑制IL-17、IL-6等促炎因子的轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)抑炎因子TGF-β的轉(zhuǎn)錄[17],甘草水提物可以提高IL-10的表達(dá)[18]。由此可推測(cè)作為黃連、甘草等中藥復(fù)合體的半夏瀉心湯可能也具有類(lèi)似作用。已有研究報(bào)告,半夏瀉心湯可降低CAG患者的血清IL-6、TNF-α水平[19]。但半夏瀉心湯對(duì)CAG患者機(jī)體Th17相關(guān)細(xì)胞因子(IL-17)、Treg相關(guān)細(xì)胞因子(IL-10、TGF-β)及轉(zhuǎn)錄因子FoxP3和RORγt是否有影響,未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)告。本研究通過(guò)觀察半夏瀉心湯對(duì)CAG大鼠模型臨床癥狀、胃黏膜組織病理學(xué)變化、Th17和Treg相關(guān)細(xì)胞因子含量、FoxP3和RORγt表達(dá)的影響,闡釋其對(duì)CAG的干預(yù)機(jī)制,為今后臨床治療和實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體級(jí)雄性SD大鼠48只,7周齡,體質(zhì)量250～300 g,由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(湘)2019-0004]。所購(gòu)大鼠均飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)仙葫校區(qū)無(wú)特定病原體級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。飼養(yǎng)環(huán)境:室溫(21±3)℃,濕度范圍50%～70%,晝夜等分照明。喂養(yǎng)條件:統(tǒng)一提供常規(guī)大鼠飼料和滅菌水,自由飲水。

1.2 藥物與試劑 半夏瀉心湯組方為黃芩16 g、干姜16 g、黨參16 g、炙甘草16 g、法半夏14 g、大棗10 g、黃連5 g,實(shí)驗(yàn)用中藥材均選用農(nóng)本方?濃縮中藥配方顆粒[培力(香港)健康產(chǎn)品有限公司]。葉酸片(天津力生制藥股份有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H12020215,規(guī)格為5 mg/片),0.3%氨水(Sigma-Aldrich?Lab &Production Material公司,批號(hào):SHBK0854),脫氧膽酸鈉溶液(Solarbio?Life Sciences公司,貨號(hào):D8330;濃度為40 mmol/L)。大鼠IL-10、IL-17、TGF-β ELISA試劑盒(江蘇晶美生物科技有限公司,批號(hào)分別為JM-01602R1、JM-01495R1、JM-01588R1),TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒-POD(博士德生物,貨號(hào):MK1011),TBS緩沖液(武漢博士德生物工程有限公司,貨號(hào):AR0031),DAB顯色液(武漢博士德生物工程有限公司,貨號(hào):AR1022),TRIzol試劑(Invitrogen公司,貨號(hào):15596026),DEPC處理水 (Invitrogen公司,貨號(hào):4387937),反轉(zhuǎn)錄試劑(Thermo Fisher Scientific公司,貨號(hào)EP0442),THUNDERBIRD?qPCR Mix試劑盒(TOYOBO公司,貨號(hào):QPS-201),引物由Invitrogen公司合成。

1.3 主要儀器 5430/R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司),Infinite M200 Pro型多功能酶標(biāo)儀(TECAN公司),BX53型熒光正置顯微鏡(OLYMPUS公司),HISTOCENTRE 3型包埋機(jī)(Thermo Fisher Scientific公司),RM2255型全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(徠卡顯微系統(tǒng)有限公司),LightCycler?96型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche公司)。

1.4 動(dòng)物造模、分組及給藥 采用隨機(jī)數(shù)字表法,從48只大鼠中選取42只作為模型制備組,余下6只設(shè)為空白組。采用脫氧膽酸鈉加氨水聯(lián)合造模法[20-21]制備CAG大鼠模型,即每日用40 mmol/L的脫氧膽酸鈉溶液灌胃,每次灌胃量為10 mL/kg,1次/d,同時(shí)每日提供0.3%氨水(50 mL/只)供自由飲用。給予空白組大鼠滅菌水(50 mL/只)自由飲用。自造模開(kāi)始第12周,每周處死2只模型制備組大鼠,剖取胃部組織經(jīng)HE染色后置于光鏡下觀察以判斷是否造模成功,到第16周時(shí)經(jīng)病理科醫(yī)師驗(yàn)證已達(dá)到CAG診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。造模過(guò)程中有2只大鼠死亡。

將剩余的30只模型制備組大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、葉酸組、半夏瀉心湯低劑量組、半夏瀉心湯中劑量組、半夏瀉心湯高劑量組,各6只。按10 mL/kg給予空白組和模型組大鼠灌喂生理鹽水,1次/d。用超純水溶解研磨后的葉酸片,按1.35 mg/kg給予葉酸組大鼠灌喂葉酸,1次/d。按成人與大鼠劑量比換算半夏瀉心湯的給藥劑量,現(xiàn)已知中藥湯劑的總克數(shù)為93 g,換算系數(shù)為6.3,假設(shè)人的體重為70 kg,則大鼠給藥劑量=人給藥劑量×換算系數(shù)=93/70×6.3≈8.37 g/kg,取該數(shù)值0.5倍即為低劑量組濃度,2倍即為高劑量組濃度,故給予半夏瀉心湯低劑量組、半夏瀉心湯中劑量組、半夏瀉心湯高劑量組大鼠的灌胃劑量分別為4.185 g/kg、8.37 g/kg、16.74 g/kg,1次/d。各組均連續(xù)灌胃12周。

1.5 樣本采集 給藥后12周,在禁食24 h后皮下注射10%水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉各組大鼠后,開(kāi)腹取腹主動(dòng)脈全血20 mL,室溫靜置30～60 min,之后以2 500 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min以獲得血清,用于ELISA檢測(cè)。然后切取大鼠全胃組織,沿著胃小彎切開(kāi)直至幽門(mén)處,剖開(kāi)后用生理鹽水沖洗干凈,再將胃組織平均分成4份,其中一份用于HE染色進(jìn)行組織病理學(xué)觀察,余下3份分別用于TUNEL染色、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)、課題組其他實(shí)驗(yàn)。

1.6 觀察及檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)

1.6.1 大鼠一般情況:實(shí)驗(yàn)期間觀察各組大鼠皮毛、飲食量、排泄物性質(zhì)等情況,并且定期稱(chēng)量大鼠體質(zhì)量。

1.6.2 HE染色觀察胃黏膜組織病理學(xué)變化:取材后使用多聚甲醛進(jìn)行標(biāo)本組織固定;用乙醇和二甲苯分別進(jìn)行脫水、透明處理;對(duì)樣品組織進(jìn)行石蠟包埋后,進(jìn)行切片處理;經(jīng)二甲苯脫蠟后進(jìn)行常規(guī)HE染色;滴加中性樹(shù)膠封片,置于顯微鏡下觀察。

1.6.3 ELISA檢測(cè)血清細(xì)胞因子含量:根據(jù)ELISA試劑盒的操作說(shuō)明書(shū),加入稀釋后呈濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品(IL-10、IL-17、TGF-β)50 μL,在待測(cè)樣品微孔內(nèi)加入稀釋后的待測(cè)樣品(含40 μL稀釋液和10 μL待測(cè)樣品)并拍勻孵育30 min,清洗5次,加入100 μL酶標(biāo)試劑,封板后37 ℃孵育1 h。去除微孔內(nèi)液體并用預(yù)先配制好的清洗液反復(fù)清洗5次并拍去多余液體。每個(gè)微孔依次滴加A、B顯色劑各50 μL,拍勻,37 ℃避光反應(yīng)15 min。加入終止液50 μL,最后通過(guò)多功能酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中各細(xì)胞因子含量。

1.6.4 TUNEL染色觀察胃黏膜細(xì)胞凋亡情況:按照1.6.2步驟制作脫蠟標(biāo)本組織后,在切片上滴加用0.01 mmol/L TBS緩沖液稀釋的蛋白酶K(稀釋比例為1 ∶200),室溫消化8 min,再用0.01 mmol/L TBS緩沖液清洗3次,加入40 μL標(biāo)記緩沖液以保持濕潤(rùn)。取末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶和Biotin-dUTP各2 μL,加入36 μL標(biāo)記緩沖液中并攪拌混勻作為標(biāo)記液。甩去多余液體后加入標(biāo)記液,37 ℃標(biāo)記2 h,用0.01 mmol/L TBS緩沖液清洗3次。滴加封閉液,37 ℃孵育30 min。取1 mL經(jīng)抗體稀釋液稀釋后的鏈霉親和素-生物素(strept avidin-biotin complex,SABC),37 ℃孵育30 min。用DAB顯色液顯色,滴加蘇木素復(fù)染、堿性溶液返藍(lán)、中性樹(shù)脂封片。置于顯微鏡下觀察,細(xì)胞核顯棕色則為陽(yáng)性細(xì)胞。

1.6.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)FoxP3 mRNA、RORγt mRNA相對(duì)表達(dá)水平:取樣本組織20 mg,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟,利用TRIzol試劑提取總RNA,通過(guò)分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度與濃度后,利用反轉(zhuǎn)錄試劑進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè),反應(yīng)體系包含12.5 μL qPCR Mix(2×)、2.5 μmol/L基因引物(上、下游引物各1 μL)、2.0 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、8.5 μL ddH2O。反應(yīng)步驟為95 ℃預(yù)變性1 min,95 ℃變性15 s、58 ℃退火20 s、72 ℃延伸20 s(循環(huán)40次),72 ℃末段延伸5 min。以GAPDH作為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平,引物信息見(jiàn)表1。

表1 引物信息

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,采用LSD-t檢驗(yàn)(方差齊)或Dunnett′s T3檢驗(yàn)(方差不齊)進(jìn)行兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 6組大鼠的一般情況 在實(shí)驗(yàn)期間,與空白組大鼠相比,模型組大鼠毛色泛黃且光澤度下降,飼養(yǎng)盒內(nèi)可見(jiàn)較多掉落鼠毛,食盒內(nèi)的食料剩余量較多,大便稀溏,肛周潮濕,體質(zhì)量下降。給予藥物干預(yù)后,葉酸組和半夏瀉心湯各劑量組大鼠毛色光澤度有一定改善,飲食量增大,大便情況較模型組有不同程度改善,肛周毛發(fā)干燥,體質(zhì)量快速增長(zhǎng),其中半夏瀉心湯低劑量組大鼠的改善情況最好,且改善程度略?xún)?yōu)于葉酸組。

2.2 6組大鼠胃黏膜組織病理學(xué)變化 空白組大鼠胃黏膜固有層腺體數(shù)量正常、排列規(guī)則且緊密。模型組大鼠胃黏膜固有層出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),腺體數(shù)量減少伴囊性擴(kuò)張,部分區(qū)域還可見(jiàn)潘式細(xì)胞。與模型組相比,葉酸組及半夏瀉心湯各劑量組大鼠胃黏膜囊性擴(kuò)張消失或減少,固有腺體數(shù)量不同程度增多,其中以半夏瀉心湯低劑量組改善情況最為明顯。見(jiàn)圖1。

圖1 6組大鼠胃黏膜組織病理學(xué)變化(HE染色,×200)

2.3 6組大鼠血清各細(xì)胞因子含量的比較 與空白組大鼠相比,模型組大鼠血清IL-10、IL-17、TGF-β含量均升高(均P<0.05);與模型組大鼠相比,半夏瀉湯各劑量組和葉酸組大鼠血清IL-10、IL-17、TGF-β含量均下降(均P<0.05),其中半夏瀉心湯低劑量組大鼠上述細(xì)胞因子含量最低(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 6組大鼠血清IL-10、IL-17、TGF-β含量的比較(x±s,pg/mL)

2.4 6組大鼠胃黏膜細(xì)胞凋亡情況的比較 與空白組大鼠相比,模型組大鼠胃黏膜細(xì)胞TUNEL染色陽(yáng)性率升高(P<0.05);與模型組大鼠相比,半夏瀉心湯各劑量組和葉酸組大鼠胃黏膜細(xì)胞TUNEL染色陽(yáng)性率均降低(均P<0.05),其中半夏瀉心湯低劑量組大鼠的胃黏膜細(xì)胞TUNEL染色陽(yáng)性率最低(均P<0.05)。見(jiàn)圖2和表3。

圖2 6組大鼠胃黏膜細(xì)胞凋亡情況(TUNEL染色,×400)

表3 6組大鼠胃黏膜細(xì)胞TUNEL染色陽(yáng)性率的比較(x±s,%)

2.5 6組大鼠胃黏膜組織FoxP3 mRNA、RORγt mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較 與空白組相比,模型組大鼠胃黏膜組織FoxP3 mRNA、RORγt mRNA表達(dá)水平均升高(均P<0.05)。與模型組相比,半夏瀉心湯各劑量組和葉酸組大鼠胃黏膜組織FoxP3 mRNA、RORγt mRNA表達(dá)水平均下降(均P<0.05),其中半夏瀉心湯低劑量組大鼠胃黏膜組織FoxP3 mRNA、RORγt mRNA表達(dá)水平低于其他半夏瀉心湯劑量組,FoxP3 mRNA表達(dá)水平亦低于葉酸組(均P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 6組大鼠胃黏膜組織FoxP3 mRNA、RORγt mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

3 討 論

CAG的臨床癥狀與我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中“痞滿(mǎn)”的癥狀表現(xiàn)相似,故可將其歸于“痞滿(mǎn)”范疇[2]。關(guān)于“痞滿(mǎn)”的病因,《丹溪心法·卷三》記載“痞者,與否同,不通泰也。由陰伏陽(yáng)蓄,氣與血不運(yùn)而成。處心下,位中央,膜滿(mǎn)痞塞者,皆土之病也……有中氣虛弱,不能運(yùn)化精微為痞者;有飲食痰積,不能施化為痞者;有濕熱太甚為痞者”[22];《諸病源候論·卷之十八 濕病諸候(凡三論)》又有“痞者,塞也,言腑臟痞塞不宣通也。由憂(yōu)恚氣積,或墜墮內(nèi)損所致”之說(shuō)[23]。由此可見(jiàn),CAG的病因復(fù)雜,自身情志、飲食失常或外感邪氣侵入均可致病,一般認(rèn)為該病是本虛標(biāo)實(shí)之證,虛則是脾胃虛弱、胃陰虧損,實(shí)則為瘀血、痰濕、濕熱等病理產(chǎn)物阻滯胃絡(luò)經(jīng)脈氣血運(yùn)行[2],導(dǎo)致脾胃升降失和、濁陰不降、清陽(yáng)不升,從而出現(xiàn)脹滿(mǎn)、納呆、胃脘痛等癥狀。半夏瀉心湯出自張仲景所著的《傷寒雜病論》,方中法半夏、干姜可降逆祛痰、溫胃化飲、祛除痰濕和寒濕,黃連、黃芩可清熱燥濕、祛除濕熱,黨參、炙甘草、大棗可補(bǔ)中益氣,增強(qiáng)中焦脾胃樞機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)之力,全方寒熱并用,具有健脾消痞、恢復(fù)脾胃正常升降的作用。段馨[24]運(yùn)用半夏瀉心湯加減治療CAG,在緩解口干口苦、惡心嘔吐、上腹痞滿(mǎn)等癥狀方面均可獲得較好效果。本研究結(jié)果顯示,模型組大鼠毛發(fā)光澤度下降,大便稀溏,體質(zhì)量下降,胃黏膜固有腺體減少;而給予藥物干預(yù)后,半夏瀉心湯各劑量組大鼠毛色光澤度有一定改善,大便情況較模型組有不同程度的改善,體質(zhì)量快速增長(zhǎng),胃黏膜固有腺體數(shù)量不同程度增多。這說(shuō)明半夏瀉心湯可改善CAG相關(guān)臨床癥狀和病理改變。

CAG是胃黏膜病變進(jìn)展為胃癌過(guò)程中的一個(gè)重要節(jié)點(diǎn),免疫系統(tǒng)失衡貫穿該過(guò)程[3,25]。FoxP3是Treg的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[26],Treg通過(guò)分泌IL-10、TGF-β等細(xì)胞因子發(fā)揮免疫抑制作用。其中,IL-10具有減弱提呈細(xì)胞活性,抑制多種免疫細(xì)胞功能以達(dá)到緩解炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫的作用,這可能與IL-10可抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白C1信號(hào)通路從而影響巨噬細(xì)胞代謝有關(guān)[27]。TGF-β是調(diào)控各細(xì)胞生命周期的細(xì)胞因子,其與腫瘤微環(huán)境的形成與擴(kuò)張關(guān)系密切[28]。Th17的分化受到RORγt調(diào)控,該細(xì)胞分泌的IL-17是中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)組織的重要驅(qū)動(dòng)核心,可引發(fā)多種炎癥反應(yīng),同時(shí)對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)也有促進(jìn)作用[29]。Th17與Treg可分泌相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子從而相互抑制,但當(dāng)Th17與Treg比例失衡時(shí)可導(dǎo)致機(jī)體癌前病變的發(fā)生[30]。綜上,RORγt、FoxP3的表達(dá)情況與IL-10、IL-17、TGF-β的含量可在一定程度上反映機(jī)體內(nèi)Th17/Treg的分化情況,以及胃黏膜病變進(jìn)展至胃癌的情況。

本研究結(jié)果顯示,與空白組相比,模型組大鼠胃黏膜凋亡細(xì)胞數(shù)量增加,血清IL-17、TGF-β、IL-10含量及胃黏膜組織FoxP3 mRNA、RORγt mRNA表達(dá)水平均升高(均P<0.05),提示此時(shí)CAG大鼠模型體內(nèi)Th17/Treg平衡環(huán)境可能被破壞。與模型組相比,各藥物組大鼠胃黏膜凋亡細(xì)胞數(shù)量減少,血清IL-17、TGF-β、IL-10含量及胃黏膜組織FoxP3 mRNA、RORγt mRNA表達(dá)水平均降低(均P<0.05),由此推測(cè)半夏瀉心湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)FoxP3 mRNA、RORγ mRNA的表達(dá)來(lái)調(diào)控Th17/Treg平衡,從而抑制胃黏膜細(xì)胞凋亡并減少炎癥因子的分泌,達(dá)到治療CAG的作用。

此外,在各劑量半夏瀉心湯組中,半夏瀉心湯低劑量組大鼠的病理表現(xiàn)改善最為明顯,細(xì)胞凋亡率最低,血清中各細(xì)胞因子表達(dá)水平及胃黏膜組織FoxP3 mRNA、RORγt mRNA表達(dá)水平亦最低,表明對(duì)于CAG大鼠模型而言,4.185 g/kg(低劑量)可能是最佳的半夏瀉心湯干預(yù)濃度。原因可能與黃連、黃芩等苦寒藥濃度有關(guān)。有研究顯示,苦寒藥對(duì)機(jī)體消化系統(tǒng)有雙向調(diào)節(jié)作用,即低濃度促進(jìn)生理活動(dòng),高濃度抑制生理活動(dòng)[31]。同時(shí),較高濃度的黃連、黃芩會(huì)引起一定程度的胃黏膜損傷[32],相關(guān)炎癥因子表達(dá)可能受此影響而發(fā)生紊亂,導(dǎo)致免疫平衡再次被破壞。但其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述,半夏瀉心湯能夠有效改善CAG大鼠的臨床癥狀和病理改變,低劑量的半夏瀉心湯可獲得最佳的干預(yù)效果。半夏瀉心湯干預(yù)CAG的作用機(jī)制可能與其下調(diào)大鼠胃黏膜FoxP3、RORγt的mRNA表達(dá)及相關(guān)細(xì)胞因子的含量有關(guān)。