細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的應(yīng)用研究進(jìn)展▲

朱健敏 陳 煒 吳 林

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,廣西南寧市 530200;2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣西南寧市 530023)

【提要】 細(xì)胞間的通訊是正常生理學(xué)中不可缺少的活動(dòng),但單細(xì)胞體外培養(yǎng)模型不能很好地反映人體復(fù)雜的細(xì)胞通訊活動(dòng)。細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型可以通過(guò)模擬體內(nèi)環(huán)境,觀察不同細(xì)胞與細(xì)胞之間,以及細(xì)胞與胞外環(huán)境之間的相互作用,廣泛應(yīng)用于神經(jīng)退行性疾病的研究。神經(jīng)炎癥引起的神經(jīng)元損傷與神經(jīng)退行性疾病發(fā)生機(jī)制的關(guān)系目前尚未完全明確。細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型可以用于研究特定的炎癥分子途徑,直觀了解大腦細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用,從而進(jìn)一步揭示神經(jīng)細(xì)胞與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞之間的串?dāng)_機(jī)制。本文對(duì)不同細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用研究進(jìn)行綜述,以期為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基礎(chǔ)研究提供參考。

細(xì)胞間的通訊活動(dòng)廣泛參與人體的生理及病理過(guò)程,如神經(jīng)遞質(zhì)、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外囊泡等介導(dǎo)的通訊活動(dòng)。細(xì)胞體外共培養(yǎng)研究證實(shí)供體細(xì)胞和受體細(xì)胞之間存在RNA轉(zhuǎn)移,這為研究腫瘤與腦微環(huán)境多細(xì)胞串?dāng)_機(jī)制和腫瘤靶向治療提供了新思路[1]。神經(jīng)炎癥提示中樞神經(jīng)系統(tǒng)動(dòng)態(tài)平衡紊亂,是當(dāng)前神經(jīng)退行性疾病研究的重點(diǎn)[2],但神經(jīng)炎癥與神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機(jī)制的關(guān)系目前尚未完全明確?？煽康募?xì)胞體外共培養(yǎng)模型是臨床驗(yàn)證中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療方法的重要工具。本文就近年來(lái)不同細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用研究進(jìn)行綜述。

1 細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型

由于單細(xì)胞體外培養(yǎng)模型容易受到培養(yǎng)環(huán)境的影響而減少原有的生物學(xué)特征,故在20世紀(jì)80年代,便有學(xué)者提出“細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型”的概念,隨后該概念日漸成熟[3]。細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型是指在同一環(huán)境中進(jìn)行2種或2種以上的細(xì)胞培養(yǎng),根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)目的,可分為直接接觸共培養(yǎng)、間接接觸共培養(yǎng)等培養(yǎng)模型,還可以細(xì)分為直接混合共培養(yǎng)、間接共培養(yǎng)、3D共同培養(yǎng)系統(tǒng)及腦片共培養(yǎng)等培養(yǎng)模型。細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型可以最大限度地模擬不同細(xì)胞之間生物功能信號(hào)的相互作用,并促進(jìn)細(xì)胞的定向增殖,建立與體內(nèi)相似的培養(yǎng)微環(huán)境。細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型的選擇取決于細(xì)胞之間的黏附狀態(tài),其中直接混合共培養(yǎng)模型操作較為簡(jiǎn)單,且費(fèi)用較低,但是難以對(duì)單一細(xì)胞蛋白進(jìn)行分析,并且其結(jié)果的分析和解讀較為困難。間接共培養(yǎng)模型指的是將2種以上類(lèi)型細(xì)胞置于不同的環(huán)境中,通過(guò)培養(yǎng)室、過(guò)濾器、凝膠等儀器觀察體液因子介導(dǎo)細(xì)胞間相互作用,進(jìn)而研究不同類(lèi)型細(xì)胞活動(dòng)之間的分子機(jī)制。其中Transwell小室共培養(yǎng)模型被視為間接共培養(yǎng)模型的標(biāo)準(zhǔn)化方法[4]。3D共同培養(yǎng)系統(tǒng)可同時(shí)培養(yǎng)3種以上的人類(lèi)細(xì)胞,滿(mǎn)足參與神經(jīng)炎癥的不同類(lèi)型細(xì)胞間串?dāng)_機(jī)制的研究需求[5],形成更加接近人體試驗(yàn)的數(shù)據(jù),且可以進(jìn)行較為準(zhǔn)確的定量與定位分析,但其費(fèi)用較為昂貴且操作要求較高。腦片共培養(yǎng)的缺點(diǎn)在于細(xì)胞容易氧化壞死,不利于用于長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)研究。

2 細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用

2.1 細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型在帕金森病中的應(yīng)用 帕金森病是一類(lèi)與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性病變,臨床癥狀以行動(dòng)遲緩、強(qiáng)直、靜止性震顫等運(yùn)動(dòng)癥狀及抑郁、睡眠障礙等非運(yùn)動(dòng)癥狀多見(jiàn)[6]。目前認(rèn)為其主要發(fā)病機(jī)制為α-突觸核蛋白(α-synuclein,αSYN)聚集、氧化應(yīng)激與神經(jīng)炎癥,病理特征表現(xiàn)為黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的喪失,以及在路易體中天然αSYN絲狀聚集[7]。此外,鐵離子的沉積會(huì)加速αSYN原纖維的類(lèi)朊蛋白增殖[8],加快帕金森病的進(jìn)展。

2.1.1 細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型在帕金森病分子機(jī)制研究中的應(yīng)用:近年來(lái),帕金森病患者腦內(nèi)鐵離子異常沉積進(jìn)而加重黑質(zhì)-紋狀體系統(tǒng)多巴胺能神經(jīng)元功能損傷的研究逐漸受到關(guān)注[9-10]。鐵沉積水平與帕金森病患者認(rèn)知功能缺損的嚴(yán)重程度相關(guān),但其具體分子機(jī)制尚未闡明[11]。目前,有關(guān)鐵沉積與多巴胺能神經(jīng)元氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥之間關(guān)系的研究較多,而星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte,AS)等神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在維持腦內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)方面具有重要的作用[12]。故腦內(nèi)細(xì)胞的體外共培養(yǎng)模型能模擬體內(nèi)復(fù)雜的生理環(huán)境,可用于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究。許曼曼[12]采用Transwell小室共培養(yǎng)大鼠原代AS與腹側(cè)神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)現(xiàn),AS可加快鐵離子在胞內(nèi)的轉(zhuǎn)入與轉(zhuǎn)出,其機(jī)制可能是其通過(guò)蛋白激酶C途徑激活6-羥基多巴胺,促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)因子α與膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1等結(jié)合,加快鐵離子在胞內(nèi)的轉(zhuǎn)入與轉(zhuǎn)出,從而加重神經(jīng)元功能的減退。有學(xué)者將經(jīng)過(guò)黑色素處理的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元細(xì)胞混合培養(yǎng),結(jié)果顯示神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞具有減輕帕金森病黑色素神經(jīng)毒性作用的潛力[13]。AS與神經(jīng)元細(xì)胞共培養(yǎng)可通過(guò)核因子E2相關(guān)因子2系統(tǒng)誘導(dǎo)戊糖酸途徑活化,保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞免受多巴胺毒性的影響[14]。與單培養(yǎng)模型相比,共培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞可下調(diào)病原體反應(yīng)途徑,上調(diào)穩(wěn)態(tài)功能途徑,并促進(jìn)抗炎和重塑細(xì)胞因子反應(yīng),表明共培養(yǎng)模型或許更適合模擬小膠質(zhì)細(xì)胞的生理學(xué)特性[15]。有學(xué)者通過(guò)建立誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)產(chǎn)生的AS與小膠質(zhì)細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型,分析兩種膠質(zhì)細(xì)胞在β淀粉樣蛋白(amyloid-beta protein,Aβ)和αSYN清除過(guò)程中的協(xié)調(diào)作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與AS相比,小膠質(zhì)細(xì)胞能更好地降解聚集的Aβ和αSYN,這兩種細(xì)胞類(lèi)型之間的相互作用涉及蛋白質(zhì)聚集體從AS轉(zhuǎn)移到小膠質(zhì)細(xì)胞,該研究結(jié)果對(duì)于研究神經(jīng)退行性疾病的新治療靶點(diǎn)具有重要意義[16]。

2.1.2 細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型在帕金森病治療研究中的應(yīng)用:Du等[17]使用Transwell小室插入物建立誘導(dǎo)iPSC衍生的神經(jīng)元-AS共培養(yǎng)模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)AS可以減輕線(xiàn)粒體毒素?fù)p害,可能起到治療帕金森病患者多巴胺能神經(jīng)元中的線(xiàn)粒體功能障礙的作用。有學(xué)者通過(guò)建立神經(jīng)元PC12細(xì)胞和N9小膠質(zhì)細(xì)胞的間接共培養(yǎng)模型,研究白藜蘆醇二聚體ε-長(zhǎng)春花素對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的抑制作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ε-長(zhǎng)春花素可以抑制PC12細(xì)胞因氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,還可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞向M1表型極化,防止神經(jīng)細(xì)胞凋亡[18]。

2.2 細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型在阿爾茨海默病中的應(yīng)用 阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease AD)是一種無(wú)法治愈的神經(jīng)退行性疾病,臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能下降,發(fā)病初期患者的短期記憶功能受損最為明顯,疾病發(fā)展至后期還會(huì)影響語(yǔ)言、情緒、運(yùn)動(dòng)與生理功能[19],主要發(fā)病機(jī)制包括淀粉樣聚集、神經(jīng)炎癥等[20],病理特征主要為Aβ積累、磷酸化tau形成、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化和神經(jīng)元丟失[21]。

2.2.1 細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型在AD分子機(jī)制研究中的應(yīng)用:在AD早期,神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞參與的神經(jīng)炎癥會(huì)驅(qū)動(dòng)疾病隱匿進(jìn)展,最終導(dǎo)致其出現(xiàn)認(rèn)知障礙,故細(xì)胞病理學(xué)是早期AD研究的重點(diǎn)[22]。利用細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型探討神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用,對(duì)揭開(kāi)AD致病分子機(jī)制至關(guān)重要[23]。目前尚缺乏能夠全面觀察AD患者大腦中多階段細(xì)胞間相互作用的體外細(xì)胞模型[24]。但AD神經(jīng)3D共同培養(yǎng)系統(tǒng)模型可利用微流體裝置高度真實(shí)模擬AD患者的大腦平臺(tái),反映神經(jīng)元-小膠質(zhì)細(xì)胞-AS炎癥反應(yīng)[25]。該模型將人類(lèi)神經(jīng)元、AS和小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)以模擬AD環(huán)境,其中中央腔室裝載神經(jīng)元/AS分化細(xì)胞,而角室裝載小膠質(zhì)細(xì)胞,中央室和角室通過(guò)遷移通道連接,可觀察小膠質(zhì)細(xì)胞在單細(xì)胞分辨率下的實(shí)時(shí)遷移活動(dòng),如Aβ聚集、tau磷酸化、小膠質(zhì)細(xì)胞募集、神經(jīng)元-小膠質(zhì)細(xì)胞相互作用的神經(jīng)毒性作用,這為研究AD的神經(jīng)炎癥分子機(jī)制提供了有效的模型,并可能有助于尋找新的治療靶點(diǎn)[21]。

外泌體是一種小細(xì)胞外囊泡,直徑為20～120 nm[26],可以通過(guò)細(xì)胞通訊和分子運(yùn)輸,參與神經(jīng)毒性[27]、神經(jīng)退行性疾病[28]的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。研究表明,AD患者腦外泌體富含寡聚Aβ[29],將與紅色熒光蛋白標(biāo)記的外泌體共同孵育3 h的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞置于Transwell小室下室,以及iPSC AF22供體細(xì)胞接種在孔徑為0.4 μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器上共培養(yǎng)24 h,結(jié)果顯示這些紅色熒光蛋白標(biāo)記的外泌體在與共培養(yǎng)的神經(jīng)元一起孵育時(shí)被神經(jīng)細(xì)胞通過(guò)胞吞作用消化,外泌體能將Aβ低聚物在神經(jīng)元之間進(jìn)行傳播,從而引起細(xì)胞毒性,成為AD的新型細(xì)胞間信使[30-31]。研究顯示,將AS單層單獨(dú)培養(yǎng)3 d后,與神經(jīng)元以體積比為2 ∶5的比例繼續(xù)共培養(yǎng)7 d,然后將小膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元以體積比為1 ∶5的比例接種于AS-神經(jīng)元頂部,或可作為研究AD神經(jīng)炎癥的共培養(yǎng)模式[32]。AD反應(yīng)性AS對(duì)神經(jīng)元的非細(xì)胞自主毒性高度依賴(lài)AS和神經(jīng)元的細(xì)胞比例,但混合比例的培養(yǎng)要求較高,難以精確調(diào)控細(xì)胞比例[33]。

2.2.2 細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型在AD治療研究中的應(yīng)用:神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell,NSC)移植是AD的主要治療方法,NSC的分化及營(yíng)養(yǎng)因子的分泌受腦內(nèi)微環(huán)境的影響,目前NSC與各種膠質(zhì)細(xì)胞之間的分子機(jī)制尚未完全明確[34]。有學(xué)者將原代神經(jīng)元細(xì)胞置于Transwell下室,在Transwell上室添加原代AS、小膠質(zhì)細(xì)胞、NSC,并分別加入含fAβ25-35細(xì)胞培養(yǎng)基,結(jié)果顯示,NSC可減少Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡[35]。將家族性AD突變的神經(jīng)細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體共同培養(yǎng),可以降低Aβ水平并上調(diào)記憶突觸可塑性相關(guān)基因的表達(dá)[36],但大腦中間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的數(shù)量有限,應(yīng)尋找提高間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體大腦靶向能力的方法。

2.3 細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型在缺血性腦卒中中的應(yīng)用 缺血性腦卒中約占全部腦卒中的70%[37-38],主要臨床表現(xiàn)為頭暈、肢體乏力、語(yǔ)言及視覺(jué)功能異常等,病理特征為腦血管床內(nèi)不可逆的損傷及形成梗死周?chē)鷧^(qū)域[39],主要病理機(jī)制包括神經(jīng)炎癥、血腦屏障損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等[40],其中缺血后神經(jīng)炎癥的繼發(fā)性進(jìn)展是腦損傷的重要原因。

2.3.1 細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型在缺血性腦卒中分子機(jī)制研究中的應(yīng)用:缺血性腦卒中發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,涉及神經(jīng)膠質(zhì)、神經(jīng)元、血管細(xì)胞和基質(zhì)成分之間的相互作用,這些細(xì)胞或成分統(tǒng)稱(chēng)為神經(jīng)血管單元(neurovascular unit,NVU)[41]。由于缺血性腦卒中涉及的細(xì)胞單元復(fù)雜,目前尚缺乏靈敏性高且針對(duì)性強(qiáng)的診斷標(biāo)志物[42],因此該病治療手段有限[43]。NVU可以限制較大的極性物質(zhì)和潛在的神經(jīng)毒性分子被動(dòng)擴(kuò)散到患者大腦中[44],而大多數(shù)缺血性腦卒中患者存在NVU功能障礙。有學(xué)者將大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞與周細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)或與AS混合培養(yǎng),還有學(xué)者將上述細(xì)胞整合至Transwell小室共培養(yǎng),以模擬缺血性腦卒中患者的血腦屏障,從而分析炎癥刺激下血腦屏障與NVU的互相作用,但由于NVU功能極為復(fù)雜,單純的2D培養(yǎng)存在局限性,或半透膜的存在缺乏流動(dòng)性,使得細(xì)胞之間無(wú)法直接接觸[45-47]。研究表明,微流體平臺(tái)的NVU建模方式有利于分層培養(yǎng)3D細(xì)胞培養(yǎng)物(NVU芯片),通過(guò)改進(jìn)生物技術(shù),可以精確控制介質(zhì)流量,以及調(diào)節(jié)培養(yǎng)微環(huán)境的參數(shù)[48-49],從而將原代腦血管內(nèi)皮細(xì)胞與iPSC來(lái)源的AS和神經(jīng)元共同培養(yǎng)在不同的通道上,并可在芯片底部自動(dòng)進(jìn)行培養(yǎng)基的抽吸、細(xì)胞混懸液的種植,建立體外缺血性腦卒中模型以供實(shí)驗(yàn)研究之用[50]。但此實(shí)驗(yàn)方法亦存在不足,一是應(yīng)用熒光素鈉檢驗(yàn)NVU屏障特性可能會(huì)受到動(dòng)物體內(nèi)陰離子對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用而出現(xiàn)結(jié)果偏倚;二是血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的RNA分子水平機(jī)制復(fù)雜,未來(lái)仍需對(duì)乳腺癌耐藥蛋白1和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1等蛋白進(jìn)行功能評(píng)估;三是該實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)操作難度較高,需要在相關(guān)專(zhuān)家指導(dǎo)下進(jìn)行,推廣應(yīng)用受限。

2.3.2 細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型在缺血性腦卒中治療研究中的應(yīng)用:小膠質(zhì)細(xì)胞表型極化在缺血性腦卒中的神經(jīng)炎癥過(guò)程中起著重要的作用,可維持神經(jīng)元和血腦屏障的功能[51]。有學(xué)者將BV2小膠質(zhì)細(xì)胞與人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y共培養(yǎng),同時(shí)將長(zhǎng)春西汀干預(yù)后的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞單獨(dú)缺氧缺糖培養(yǎng)后再與SH-SY5Y細(xì)胞在缺氧缺糖條件下共培養(yǎng),結(jié)果表明,經(jīng)長(zhǎng)春西汀處理的BV2細(xì)胞可以減輕共培養(yǎng)系統(tǒng)中缺氧缺糖誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷,其機(jī)制可能與長(zhǎng)春西汀減少小膠質(zhì)細(xì)胞中的磷酸二酯酶,抑制小膠質(zhì)細(xì)胞M1表型,增強(qiáng)自噬通量,保護(hù)神經(jīng)元的存活有關(guān)[52],初步驗(yàn)證長(zhǎng)春西汀或可作為新的神經(jīng)保護(hù)劑。有學(xué)者將經(jīng)過(guò)缺氧缺糖刺激的神經(jīng)元細(xì)胞系N2a細(xì)胞與條件培養(yǎng)基刺激的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)12 h,構(gòu)建神經(jīng)元-小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)模型,發(fā)現(xiàn)褪黑素通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3途徑,調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞向抗炎表型分化,從而對(duì)缺血性腦卒中小鼠的神經(jīng)起到保護(hù)作用[53],但該方法使用的是非原代培養(yǎng)細(xì)胞,或許未能真實(shí)地體現(xiàn)缺血性腦卒中的細(xì)胞受損機(jī)制。NSC的低存活率及低分化率限制其在缺血性腦卒中的應(yīng)用,神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活化可能影響NSC的增殖和分化[54]。研究顯示,將谷氨酸預(yù)處理的神經(jīng)膠質(zhì)混合細(xì)胞與NSC共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞和AS可誘導(dǎo)NSC的神經(jīng)元分化并減少神經(jīng)球的凋亡,將NSC與AS或小膠質(zhì)細(xì)胞共同移植至缺血性腦卒中大鼠模型,可較好地改善大鼠的神經(jīng)損傷[55],但此神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)的方式增加了后續(xù)實(shí)驗(yàn)定量與定性分析單類(lèi)細(xì)胞作用的難度。間充質(zhì)干細(xì)胞具有誘導(dǎo)神經(jīng)元修復(fù)作用,將其與缺氧缺糖處理過(guò)的M17神經(jīng)元細(xì)胞間接共培養(yǎng),可通過(guò)降低炎癥因子表達(dá)水平,修復(fù)缺血性腦卒中大鼠模型的神經(jīng)功能[56]。

2.4 細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型在肌肉萎縮側(cè)索硬化中的應(yīng)用 肌肉萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ASL)是一種進(jìn)展速度較快且可累及上下神經(jīng)元的一類(lèi)神經(jīng)退行性疾病,臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重的肌肉萎縮,最終導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)肌肉去神經(jīng)支配而死亡。目前ASL的具體發(fā)病機(jī)制尚未闡明,但神經(jīng)炎癥已被證實(shí)是該病的重要發(fā)病機(jī)制之一[57]。

經(jīng)典的核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)通路參與ASL的發(fā)病過(guò)程。有學(xué)者將運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元接種在涂有粘連蛋白的96孔板中,2 d后按每孔35 000個(gè)細(xì)胞的密度接種小膠質(zhì)細(xì)胞并共培養(yǎng)72 h,結(jié)果顯示,運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活率明顯下降,NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平明顯升高,且上述改變可被NF-κB抑制劑消除,說(shuō)明小膠質(zhì)細(xì)胞中NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)的缺失可減少運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的死亡,這或可為ALS治療提供新的治療靶點(diǎn)[58],但該研究亦存在不足,即僅采用一種膠質(zhì)細(xì)胞模擬復(fù)雜的神經(jīng)炎癥過(guò)程。Smethurst等[59]使用iPSC衍生的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元與AS共培養(yǎng)來(lái)模擬散發(fā)性ALS的早期細(xì)胞類(lèi)型特異性特征,將未處理的AS與種子聚集的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元間接共培養(yǎng)7 d,發(fā)現(xiàn)TDP-43蛋白寡聚體對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元具有毒性作用,但對(duì)AS無(wú)毒性作用,且AS可以通過(guò)減少TDP-43蛋白寡聚體的毒性來(lái)保護(hù)種子聚集的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。目前,有關(guān)細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型在ASL治療中的應(yīng)用研究較少,這可能與該病的致病機(jī)制尚未明確有關(guān)。

3 小結(jié)與展望

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元細(xì)胞的體外共培養(yǎng)模型是研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要模型,永生細(xì)胞系增加了神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究中細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的可重復(fù)性[60],目前已成為藥理學(xué)和毒理學(xué)研究的重要工具。細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型是多種基礎(chǔ)疾病研究常用的體外模型,可以較為直觀地演示疾病發(fā)生與發(fā)展的病理過(guò)程,且有利于對(duì)細(xì)胞進(jìn)行人為干預(yù),減少動(dòng)物模型體內(nèi)變量的影響,直接觀察細(xì)胞之間的相互交流,還可以作為高通量藥物的刷選手段,避免動(dòng)物倫理問(wèn)題。但是細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型的原代培養(yǎng)細(xì)胞存在潛在問(wèn)題:一是細(xì)胞因失去體內(nèi)環(huán)境而有可能缺乏特征,以及細(xì)胞本身的表型被活化[61];二是人類(lèi)大腦是復(fù)雜且精細(xì)的器官,腦神經(jīng)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)精細(xì)、功能活躍,細(xì)胞系的傳代及干預(yù)可能使得細(xì)胞共培養(yǎng)的體外模型失去體內(nèi)表型而降低其研究結(jié)果的可靠性。

近年來(lái),iPSC及其衍生的各種原代人類(lèi)細(xì)胞的批準(zhǔn)和上市,特別是人工芯片的發(fā)展,讓細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型能更真實(shí)地模擬疾病發(fā)生與進(jìn)展過(guò)程。然而,由于捐贈(zèng)者不同的限制,體外基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的一致性受到了影響。但亦有研究顯示,不同捐獻(xiàn)者的iPSC并不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果[62]。此外,由于重編程、細(xì)胞選擇、體外培養(yǎng)過(guò)程漫長(zhǎng)等問(wèn)題,iPSC模型可能導(dǎo)致表觀遺傳發(fā)生變化。盡管細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型具有局限性,但其可以在明確的實(shí)驗(yàn)條件下提供比單細(xì)胞培養(yǎng)模型更真實(shí)的三維視圖和信息,故其亦可用于科學(xué)基礎(chǔ)研究。