銅死亡基因在自閉癥譜系障礙免疫浸潤中的生物信息學分析

范兆涵,曹文君,高景宏,石金銘,盧耀恩,葉明,譚中科

(1.鄭州大學第一附屬醫(yī)院 a.互聯(lián)網(wǎng)醫(yī)療系統(tǒng)與應用國家工程實驗室;b.新生兒重癥監(jiān)護室,河南 鄭州 450052)

自閉癥譜系障礙(autism spectrum disorder,ASD)是一組異質(zhì)性的神經(jīng)發(fā)育障礙,表現(xiàn)為社會交往障礙、溝通障礙以及限制性、重復性、刻板性的行為[1]。目前全球總體發(fā)病率約為1%,且以男性為主[2]。既往文獻中對ASD的病因進行廣泛的研究,但具體機制仍不十分清楚[3]。在治療方面,目前研究主要是針對如自殘、攻擊性、重復和刻板行為、注意力不集中等體征的對癥治療,尚無治療ASD的有效藥物[3-4]。

銅是一種生命中必不可少的金屬微量元素[5],在細胞中,銅通過穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機制維持正常水平,防止過量引起細胞毒性損傷[6-7]。關于銅離子對細胞的影響,最近Tsvetkov等[7]提出一種新的細胞死亡方式-銅死亡,其機制主要是銅離子直接與三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循環(huán)途徑中的脂質(zhì)?；M分結(jié)合,導致脂質(zhì)酰化蛋白異常聚集和鐵硫簇蛋白丟失,導致蛋白毒性應激,最終導致細胞死亡。

銅對于神經(jīng)系統(tǒng)的影響十分重要,銅含量失調(diào)可導致認知和運動發(fā)育異常,例如ASD[8]。ASD患者體內(nèi)可觀察到異常的代謝產(chǎn)物,TCA循環(huán)異?？赡苁怯绊懢C合征和散發(fā)性神經(jīng)發(fā)育障礙的常見途徑[9]。因此,通過藥物抑制神經(jīng)元銅死亡的發(fā)生可能為ASD的治療提供新的思路。同時,銅也是免疫系統(tǒng)所必需的關鍵微量元素,免疫系統(tǒng)需要銅來執(zhí)行多種功能,包括調(diào)節(jié)先天性免疫細胞的激活,影響組織中免疫細胞的分布等[10-11],因此銅對免疫反應的影響也不容忽視。

炎癥、細胞因子在內(nèi)的免疫系統(tǒng)、免疫功能的失調(diào),是ASD發(fā)生不可或缺的因素[12]。其中,免疫分為固有免疫和適應性免疫,固有免疫細胞,例如單核細胞、小膠質(zhì)細胞均參與ASD的發(fā)生[13-14]。適應性免疫中,T細胞等也參與ASD的發(fā)生[15]。除免疫細胞外,白細胞介素(interleukin-6,IL-6)等細胞因子失調(diào)也是ASD發(fā)生的危險因素[12]。盡管對免疫方面研究較多,但ASD免疫細胞、免疫功能之間相關程度,以及在ASD進展中的作用,仍有待完善。

精準醫(yī)療以個體化醫(yī)療為基礎,分為精準預防和精準治療,可以根據(jù)個體特點制定預防性的干預措施預防疾病發(fā)生,或根據(jù)個體患者特點制定最佳的治療方式[16]。精準醫(yī)療是隨著基因組學、轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學和代謝組學等測序技術及生物信息學與大數(shù)據(jù)科學的交叉應用而迅速發(fā)展的新型醫(yī)療模式。

目前,越來越多的人使用高通量測序平臺測定基因組、蛋白質(zhì)組學等,通過大型數(shù)據(jù)集分析了解許多疾病的發(fā)病機制[17]、識別疾病的潛在新生物學標志物、協(xié)助診斷和治療[18-19]。列線圖是一種將回歸分析、生存分析等統(tǒng)計模型結(jié)果可視化的工具,通過水平線、刻度線、標度等元素使預測模型中預測因子與結(jié)局的關系圖形化,直觀地表達每個預測因子預測結(jié)局的作用大小,便于臨床使用者對模型的理解,同時根據(jù)自變量取值簡便快速估計臨床結(jié)局發(fā)生概率[20]。目前被廣泛應用于各個系統(tǒng)疾病診療及預后預測,為臨床決策提供理論依據(jù)[20-22]。

本文利用生物信息學方法對ASD進行研究,篩選銅死亡相關基因、計算免疫浸潤情況、構建免疫相關預測模型、預測可能有效的藥物分子。本研究將為ASD銅死亡機制提供新的見解、潛在的生物學標志物及可能的治療藥物,并根據(jù)每個患者的個體化特征預測疾病發(fā)生概率,促進精準醫(yī)學發(fā)展。

1 材料和方法

1.1 原始數(shù)據(jù)采集

從NCBI基因表達綜合數(shù)據(jù)庫(GEO;https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)搜索2012—2022年ASD相關測序數(shù)據(jù)集,其中符合要求的為GSE18123、GSE29691。其中,GSE18123包含115個非ASD樣本,170個ASD樣本;GSE29691包含13個非ASD樣本和2個ASD樣本。GSE18123分別使用GPL6244,(HuGene-1_0-st)Affymetrix Human Gene 1.0 ST Array[transcript (gene) version]和GPL570,(HG-U133_Plus_2)Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array 2個進行平臺檢測。GSE29691使用GPL570,(HG-U133_Plus_2)Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array平臺檢測。兩個數(shù)據(jù)集均為基因表達陣列。本研究使用R 4.2.2版本及其對應安裝包對數(shù)據(jù)進行分析。

1.2 銅死亡相關基因的數(shù)據(jù)處理和鑒定

對兩個數(shù)據(jù)集使用affy進行預處理,包括背景校準、歸一化、log2變換[23]。當多個探針對應于一個共同的基因時,取其平均值作為其表達值,并使用SVA軟件包去除數(shù)據(jù)集合之間的批次效應。對兩個數(shù)據(jù)集進行合并后與銅死亡相關基因取交集。其中,銅死亡相關基因包括SLC31A1、PDHB、PDHA1、LIPT1、ATP7A、ATP7B、DBT、DLAT、DLD、DLST、FDX1、LIAS,來源于發(fā)現(xiàn)銅死亡的Tsvetkov團隊報道[7]。

1.3 免疫細胞浸潤分析

本研究使用“GSVA”軟件包進行ssGSEA算法計算免疫評分,估算樣本的免疫浸潤程度;使用“pheatmap”軟件包繪制熱圖;“corrplot”軟件包對其進行免疫細胞、免疫功能之間的相關性分析,并繪制熱圖;“ggpubr”軟件包采取秩和檢驗比較ASD組和非ASD組免疫細胞及免疫功能的差異性,并繪制箱圖。

1.4 構建預測模型

使用“psych”軟件包分析銅死亡相關基因與免疫浸潤的相關性分析,并繪制相關性熱圖,根據(jù)結(jié)果篩選出與免疫最為相關的基因。使用“rms”R語言軟件包,構建nomogram風險預測圖。使用C指數(shù)、ROC曲線、校準曲線等對預測模型進行檢驗,了解銅死亡相關基因?qū)膊“l(fā)生的意義。

1.5 銅死亡免疫相關基因進行KEGG、GO分析及潛在治療藥物預測

Enrichr網(wǎng)站(https://maayanlab.cloud/Enrichr/)是一個基于網(wǎng)頁端的綜合性基因集富集分析工具。本研究使用Enrichr網(wǎng)站對銅死亡免疫相關基因進行KEEG分析,分析其可能的代謝通路;從生物學過程(biological Process,BP)、細胞成分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)3個方面進行GO分析;對ASD銅死亡基因相關的小分子藥物進行預測。以P<0.05作為篩選標準。

2 結(jié)果

2.1 篩選銅死亡相關基因

將GSE18123、GSE29691兩個集合數(shù)據(jù)進行處理后合并,和銅死亡相關基因取交集。發(fā)現(xiàn)12個ASD銅死亡相關基因:SLC31A1、PDHB、PDHA1、LIPT1、ATP7A、ATP7B、DBT、DLAT、DLD、DLST、FDX1、LIAS。

2.2 免疫細胞浸潤分析

2.2.1免疫浸潤情況

本研究首先采用ssGSEA算法計算免疫評分。圖1A為ASD與非ASD免疫浸潤的熱圖。

A為免疫浸潤的熱圖;B為免疫細胞之間的相關性分析熱圖;C為免疫功能之間的相關性分析熱圖;D為ASD與非ASD免疫細胞浸潤差異性分析的箱型圖;E為ASD與非ASD免疫功能浸潤差異性分析的箱形圖;*代表P<0.05,**代表P<0.01,***代表P<0.001。

2.2.2免疫功能、免疫細胞間相關性分析

本研究分析ASD中浸潤的免疫細胞、免疫功能的相關性,發(fā)現(xiàn)不同免疫細胞、免疫功能之間存在協(xié)同或競爭作用(圖1B、C)。其中,CD8+T細胞和腫瘤浸潤淋巴細胞協(xié)同作用較強(r=0.69),而Treg細胞和樹突狀細胞具有較強的競爭效應(r=-0.71)。在免疫功能方面,副炎癥和Ⅰ型干擾素反應具有較強的協(xié)同作用(r=0.83)。

2.2.3ASD與非ASD組免疫評分差異性分析

ASD和非ASD組免疫細胞和免疫功能的評分差異分析如圖1D、E所示。部分免疫細胞不同組間差異有統(tǒng)計學意義,免疫細胞浸潤差異的柱狀圖顯示在ASD組中性粒細胞、肥大細胞、Treg細胞其浸潤程度較高,B細胞、CD8+T細胞、樹突狀細胞、漿細胞樣樹突狀細胞、T濾泡輔助細胞、Th2細胞浸潤程度較低。在免疫功能方面,與非ASD組相比,ASD組趨化因子受體、免疫檢查點、人類白細胞抗原等免疫功能減弱。

2.3 構建預測模型

對ASD銅死亡相關基因與免疫浸潤的相關性分析(圖2A),選出與免疫相關的基因SLC31A1、PDHB、PDHA1、LIPT1、ATP7A、ATP7B、DBT、DLAT、DLD、DLST、FDX1、LIAS。使用上述基因構建列線圖(圖2B)。計算模型C指數(shù)為0.65,計算模型ROC曲線下面積為0.65(圖2C),提示模型對ASD的發(fā)生風險具有不錯的預測能力。繪制校準曲線(圖2D),顯示模型的結(jié)果與實際結(jié)果的一致性較好。

A為ASD銅死亡基因免疫浸潤的相關性分析熱圖;B為ASD的列線圖,選取免疫相關基因SLC31A1、PDHB、PDHA1、LIPT1、ATP7A、ATP7B、DBT、DLAT、DLD、DLST、FDX1、LIAS構建風險預測模型;C為預測模型的ROC曲線,該模型的ROC曲線下面積為0.652;D為列線圖的校準曲線。

2.4 銅死亡免疫相關基因的KEGG、GO分析及藥物預測

這些基因主要參與丙酮酸乙酰輔酶A生物合成過程、乙酰輔酶A生物合成過程、丙酮酸代謝過程等生物過程(圖3A);主要細胞成分位于線粒體基質(zhì)、細胞內(nèi)細胞器腔等部位(圖3B);主要分子功能涉及過渡金屬離子跨膜轉(zhuǎn)運活性、氧化還原酶活性等(圖3C)。KEEG信號通路分析表明,這些基因主要參與TCA循環(huán)、丙酮酸代謝等信號通路(圖3D)。利用基于DSigDB數(shù)據(jù)庫的Enrichr平臺對ASD銅死亡12個基因相關的小分子藥物進行預測,最終提取出前10個潛在化合物(圖3E)。結(jié)果顯示,維A酸是與大多數(shù)基因相互作用的藥物分子。

A為ASD銅死亡相關基因的BP分析;B為ASD銅死亡相關基因的CC分析;C為ASD銅死亡基因的MF分析;D為ASD銅死亡基因的KEEG分析;E為ASD銅死亡基因相關的藥物預測。

3 討論

精準醫(yī)療相較于傳統(tǒng)治療和預防策略,可以根據(jù)每個患者的特點制定最適合、有效的治療和預防策略,而基因組學和生物信息學的最新進展有助于精準醫(yī)學更好實現(xiàn)[24]。本文利用生物信息學方法對ASD銅死亡進行研究,構建ASD免疫相關預測模型,預測個體發(fā)生ASD概率,促進精準醫(yī)學的發(fā)展。同時確定銅死亡相關基因組KEEG通路、GO通路、藥物等,為ASD銅死亡機制提供新的思路。

ASD是一種嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙疾病,迄今為止,無藥物可以根治ASD,但目前針對各個神經(jīng)系統(tǒng)遞質(zhì),如催產(chǎn)素、膽堿能和谷氨酸能等的藥物研究正在持續(xù)進展中[4]。

本研究發(fā)現(xiàn),銅死亡基因與免疫相關性較好,且銅死亡基因?qū)SD的診斷具有一定的積極意義,因此,本研究認為銅死亡在ASD中可能具有一定的潛在作用。以往的研究發(fā)現(xiàn),銅離子對于維持正常的神經(jīng)元功能至關重要[12,25],這也提示了抑制銅死亡聯(lián)合免疫治療或可能是ASD患者治療的新思路。

在GSE18123和GSE29691兩個數(shù)據(jù)集中共選取172個ASD樣本和128個非ASD樣本,在樣本中篩選出12個與銅死亡免疫相關的基因,包括SLC31A1、PDHB、PDHA1、FDX1、DLST、DLAT、LIPT1、LIAS、DLD、ATP7A、ATP7B、DBT。其中,SLC31A1可以編碼細胞膜中高親和力的銅轉(zhuǎn)運蛋白,影響膳食銅攝取[26]。PDHB是一種雙功能磷酸蛋白,與病原體附著在宿主細胞表面一起在代謝途徑中起著至關重要的作用[27]。PDHA1是丙酮酸脫氫酶復合物的關鍵成分,參與線粒體氧化磷酸化和TCA循環(huán)等過程,在葡萄糖代謝中必不可少[28]。FDX1是銅死亡的關節(jié)調(diào)控因子,蛋白質(zhì)脂?；纳嫌握{(diào)節(jié)因子,影響線粒體代謝功能[29]。DLST、DLAT是編碼線粒體蛋白質(zhì)脂?；?個重要基因,LIPT1、LIAS和DLD是編碼線粒體硫辛酸途徑的3個重要基因[7]。ATP7A、ATP7B分別為銅轉(zhuǎn)運蛋白ATP酶銅轉(zhuǎn)運α和ATP酶銅轉(zhuǎn)運β,對于哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能至關重要,發(fā)生突變后可導致神經(jīng)遺傳疾病[30]。DBT調(diào)節(jié)支鏈氨基酸的降解,是線粒體多酶支鏈α-酮酸脫氫酶復合體的轉(zhuǎn)?；附M分[31]。

KEEG信號通路分析顯示,這些基因主要參與了TCA循環(huán)、丙酮酸代謝等信號通路等,TCA循環(huán)及其酶組分在基底細胞代謝中起至關重要的作用。根據(jù)基因構建列線圖并預測小分子治療藥物,結(jié)果顯示維A酸是與大多數(shù)基因相互作用、可能有效的藥物分子。

4 結(jié)論

本研究確定了參與ASD免疫過程的銅死亡相關基因,制定ASD銅死亡免疫相關診斷預測模型、藥物預測,根據(jù)不同患者的特點預測患病風險及可能有效藥物,促進精準醫(yī)學發(fā)展。同時,為銅死亡在ASD免疫方面的基礎研究提供一定的思路和線索,可能有助于基于銅死亡發(fā)病機制的ASD免疫療法的研究。