矮地茶治療骨質(zhì)疏松癥的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析及實(shí)驗(yàn)研究

譚雅文，原茵，吳紫璇，郭亞萍，王瑾源，彭雁飛，鄭紡

〔摘要〕 目的 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及體外實(shí)驗(yàn)探究矮地茶治療骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis， OP）的作用機(jī)制。方法 使用TCMSP、GeneCards數(shù)據(jù)庫篩選矮地茶治療骨質(zhì)疏松癥的有效成分及關(guān)鍵靶點(diǎn)（疾病靶點(diǎn)與藥物活性成分靶點(diǎn)的交集）；使用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“中藥-活性成分-交集靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)；使用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction， PPI）網(wǎng)絡(luò)；通過DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析和KEGG信號(hào)通路富集分析。體外實(shí)驗(yàn)使用矮地茶醇提物干預(yù)成骨誘導(dǎo)的ST-2細(xì)胞，通過堿性磷酸酶染色（alkaline phosphatase， ALP）、RT-qPCR、Western blot等檢測(cè)其對(duì)成骨分化的影響并驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)信號(hào)通路預(yù)測(cè)結(jié)果。結(jié)果 共獲得槲皮苷、山柰酚、射干醇A、丹皮酚、肉桂醛等193個(gè)矮地茶主要活性成分；預(yù)測(cè)出82個(gè)矮地茶與OP的關(guān)鍵靶點(diǎn)，這些關(guān)鍵靶點(diǎn)主要參與調(diào)控雌激素信號(hào)通路、凋亡、Wnt/β-catenin信號(hào)通路等。體外實(shí)驗(yàn)顯示，矮地茶能有效提高ST-2細(xì)胞成骨轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)（P＜0.05），同時(shí)上調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白β-catenin的表達(dá)（P＜0.05），并下調(diào)通路抑制因子Sfrp1的mRNA水平（P＜0.05）。結(jié)論 矮地茶可通過多靶點(diǎn)、多通路治療OP，主要與Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 骨質(zhì)疏松癥；矮地茶；成骨分化；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；Wnt/β-catenin信號(hào)通路

〔中圖分類號(hào)〕R274.9? ? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.08.020

Network pharmacological analysis and experimental study of Aidicha （Ardisiae Japonicae Herba） in treating osteoporosis

TAN Yawen， YUAN Yin， WU Zixuan， GUO Yaping， WANG Jinyuan， PENG Yanfei， ZHENG Fang*

School of Integrated Chinese and Western Medicine， Tianjin University of Chinese Medicine， Tianjin 301617， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the mechanism of action of Aidicha （Ardisiae Japonicae Herba） in treating osteoporosis （OP） based on network pharmacology and in vitro experiments. Methods TCMSP and GeneCards databases were used to screen active ingredients and key targets （intersection of disease targets and drug active ingredient targets） for Aidicha （Ardisiae Japonicae Herba） treating OP; Cytoscape 3.7.1 software was applied to constructing "herb-active ingredient-intersection target-disease" network; STRING database was used to construct the key target protein-protein interaction （PPI） network. GO analysis and KEGG signaling pathway enrichment analysis of the key targets were performed by DAVID database. In vitro experiments were performed using Aidicha （Ardisiae Japonicae Herba） alcohol extracts to intervene in osteogenic-induced ST-2 cells. Alkaline phosphatase （ALP） staining， RT-qPCR， and Western blot were applied to detecting their effects on osteogenic differentiation and validating the prediction made by network pharmacological signaling pathway analysis. Results A total of 193 major active ingredients of Aidicha （Ardisiae Japonicae Herba）， including quercetin， kaempferol， belamcandol A， paeonol， and cinnamaldehyde， were obtained; 82 key targets （intersection targets） of Aidicha （Ardisiae Japonicae Herba） and OP were predicted， and they were mainly regulating estrogen signaling pathway， apoptosis， Wnt/β-catenin signaling pathway， etc. In vitro experiments showed that Aidicha （Ardisiae Japonicae Herba） effectively increased the expressions of osteogenic transcription factors in ST-2 cells （P<0.05）. Meanwhile， it up-regulated the expression of β-catenin， a key protein of Wnt/β-catenin signaling pathway （P<0.05）， but down-regulated the mRNA level of Sfrp1， a pathway suppressor （P<0.05）. Conclusion Aidicha （Ardisiae Japonicae Herba） can treat OP through multiple targets and pathways， mainly related to Wnt/β-catenin signaling pathway.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 osteoporosis; Aidicha （Ardisiae Japonicae Herba）; osteogenic differentiation; network pharmacology; Wnt/β-catenin signaling pathway

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis， OP）為代謝性骨病[1]，多發(fā)于中老人及絕經(jīng)后婦女。最新數(shù)據(jù)顯示，OP在中國(guó)50歲以上人群中男女性患病率分別為13.5%、29%[2]。及早發(fā)現(xiàn)骨丟失現(xiàn)象并加以治療具有重要的社會(huì)意義。OP的發(fā)生與骨重建失衡關(guān)系密切，理想的OP治療藥物應(yīng)能恢復(fù)骨形成與骨吸收平衡，然而目前臨床上大多治療藥物只能抑制骨吸收，限制了在OP治療中的臨床應(yīng)用。因此，從根本上治療OP，尋找能夠增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性、促進(jìn)骨形成的安全藥物至關(guān)重要。

矮地茶（ardisiae japonicae herba， AJH）為我國(guó)西南地區(qū)少數(shù)民族常用藥，具有化痰利濕、活血化瘀之功效。目前，臨床上多用其治療風(fēng)濕痹痛、跌打損傷、脫力勞傷等外傷疾病。OP在中醫(yī)學(xué)中屬于“骨痿”范疇，常因肝腎虧虛，外感誘生濕熱痰瘀致病。研究發(fā)現(xiàn)，AJH中槲皮素、山柰酚、肉桂醛、楊梅素等中藥單體可能是其治療骨代謝疾病的主要有效成分，槲皮素及其衍生物可能通過抗氧化、抗炎、促進(jìn)成骨細(xì)胞、抑制破骨細(xì)胞及其雌激素樣作用部分逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)減少[3]；槲皮素通過調(diào)節(jié)自噬和凋亡提高骨細(xì)胞總數(shù)、預(yù)防骨質(zhì)疏松[4]；山柰酚通過減少miR-10a-3p和提高CXCL12促進(jìn)BMSC成骨分化和改善OP[5]；肉桂醛抑制破骨細(xì)胞生成，促進(jìn)成骨細(xì)胞生成[6]；楊梅素通過激活Wnt/β-catenin增強(qiáng)BMSC的成骨分化[7]。然而AJH治療OP的具體作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)AJH治療OP的潛在作用靶點(diǎn)及通路，通過體外實(shí)驗(yàn)觀察AJH對(duì)ST-2細(xì)胞成骨分化的影響并驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果，以期為揭示AJH治療OP的作用機(jī)制提供參考。

1 材料

1.1? 數(shù)據(jù)庫及軟件

所用數(shù)據(jù)庫包括：中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP）：http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php，GeneCards：https：//www.genecards.org、韋恩Venny2.1.0：http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/、String蛋白質(zhì)相互作用分析平臺(tái)：https：//string-db.org、DAVID 6.8 GO功能和KEGG通路富集分析平臺(tái)：https：//david.ncifcrf.gov；所用軟件包括：Cytoscape3.7.1、R×64 3.6.3、PERL。

1.2? 細(xì)胞

小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞系ST-2（批號(hào)：ZY-900），購于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3? 主要儀器

JJQ5型熒光定時(shí)定量PCR儀（美國(guó)伯樂BIO-RAD公司）；K5500型超微量紫外分光光度儀（北京凱奧科技發(fā)展有限公司）；Varioskan Flash型多功能讀板機(jī)（賽默飛世爾科技公司）。

1.4? 藥品與試劑

AJH醇提物由天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院制備；DMEM（批號(hào)：SH30022.01B）、α-MEM培養(yǎng)基（批號(hào)：SH30265.01B）、胰蛋白酶（批號(hào)：25200056）均購自美國(guó)Gibco公司；二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)：D8418）購自德國(guó)Sigma-Aldrich公司；CCK-8（批號(hào)：LF696）均購自北京博奧拓達(dá)科技有限公司；總RNA提取試劑盒（HP Total RNA Kit，批號(hào)：R6812-02）購自美國(guó)Omega公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：K1622）購自美國(guó)賽默飛世爾科技公司；Ultra SYBR Mixture試劑盒（批號(hào)：CW0957MM）購自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

2 方法

2.1? 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

2.1.1? 藥物活性成分及其靶點(diǎn)、疾病靶點(diǎn)收集? 以口服生物利用度（oral bioavailability， OB）≥30%，類藥性（drug likeness， DL）≥0.18作為活性成分的篩選標(biāo)準(zhǔn)，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索AJH的活性成分及其靶點(diǎn)。使用GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索關(guān)鍵詞"Osteoporosis"得到OP相關(guān)靶點(diǎn)。

2.1.2? “中藥-活性成分-交集靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將AJH活性成分的作用靶點(diǎn)與OP靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny2.1平臺(tái)中，獲得交集靶點(diǎn)即AJH治療OP的關(guān)鍵靶點(diǎn)，繪制韋恩圖；利用Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建“中藥-活性成分-交集靶點(diǎn)-疾病”可視化網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行拓?fù)浞治觥?/p>

2.1.3? 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction， PPI）? 將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING平臺(tái)，設(shè)定物種為“Homo sapiens”，構(gòu)建PPI可視化網(wǎng)絡(luò)并導(dǎo)出圖片與tsv統(tǒng)計(jì)文件，利用R軟件通過度值預(yù)測(cè)核心靶點(diǎn)，并分析靶點(diǎn)之間的互作關(guān)系。

2.1.4? GO功能與KEGG信號(hào)通路富集分析? 將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行GO功能富集分析與KEGG信號(hào)通路富集分析，設(shè)定閾值為P≤0.05。GO富集分析包括生物過程（biological process， BP）、分子功能（molecular function， MF）及細(xì)胞組成（cellular component， CC）。使用R軟件將富集結(jié)果可視化處理為條形圖與氣泡圖，分析AJH治療OP的潛在作用機(jī)制。

2.2? 體外實(shí)驗(yàn)

2.2.1? 細(xì)胞培養(yǎng)? 將小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞系ST-2用DMEM完全培養(yǎng)基（含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素）在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。每隔1天換液，待細(xì)胞匯合至70%～80%融合度時(shí)進(jìn)行傳代。

2.2.2? CCK-8法檢測(cè)ST-2細(xì)胞的增殖? 將細(xì)胞接種至96孔板中，24 h后進(jìn)行分組：空白對(duì)照組（Control組）、DMSO組和10、20、50、100、150、200 μg/mL AJH組。各組分別干預(yù)0、24、48、72 h后，根據(jù)CCK-8試劑盒說明書步驟，在每孔培養(yǎng)基中加入10% CCK-8溶液，37 ℃孵育1 h。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組在450 nm處的光密度（OD）值。

2.2.3? ALP染色觀察ST-2細(xì)胞成骨分化? 培養(yǎng)ST-2細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合度時(shí)均換為含成骨誘導(dǎo)劑（1.0 μmol/L地塞米松+10 mmol/L β-甘油磷酸鈉+50 μmol/L維生素C）的α-MEM完全培養(yǎng)基，給藥組加入10 μg/mL AJH干預(yù)細(xì)胞，每3天換液1次，培養(yǎng)至14 d。按照ALP顯色試劑盒說明書進(jìn)行染色。

2.2.4? RT-qPCR法檢測(cè)成骨轉(zhuǎn)錄因子和β-catenin、Sfrp1的mRNA表達(dá)? 將ST-2細(xì)胞分別接種至六孔板中，1 d后進(jìn)行分組干預(yù)：空白對(duì)照組（Control組）、成骨誘導(dǎo)組、成骨誘導(dǎo)＋10 μg/mL或20 μg/mL AJH組。干預(yù)細(xì)胞5 d后棄去培養(yǎng)基，使用β-巰基乙醇裂解細(xì)胞，按照總RNA提取試劑盒說明書步驟提取細(xì)胞總RNA，檢測(cè)RNA含量與純度；按照 cDNA 第一鏈合成試劑盒說明書步驟逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，逆轉(zhuǎn)錄條件：25 ℃ 10 min，37 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。以cDNA為模板，β-actin作為內(nèi)參基因，按照Ultra SYBR Mixture 試劑盒說明書步驟采用RT-qPCR法檢測(cè)目的基因的表達(dá)，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，共 38 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增反應(yīng)后進(jìn)行熔解曲線分析，排除非特異性擴(kuò)增。目的基因相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。引物序列見表1。

2.2.5? Western blot檢測(cè)成骨轉(zhuǎn)錄因子和β-catenin的蛋白表達(dá)? 成骨誘導(dǎo)劑與10 μg/mL AJH干預(yù)ST-2細(xì)胞5 d后，使用RIPA蛋白裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白并使用BCA蛋白定量法檢測(cè)其濃度。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。TBST漂洗后，于5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h。封閉結(jié)束后用TBST漂洗，加入Runx2、Osterix、β-catenin、β-actin一抗（稀釋比例1∶1000），4 ℃孵育過夜。TBST漂洗，二抗（稀釋比例1∶10000）孵育2 h。ECL顯影、成像。以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2.3? 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料結(jié)果以“ｘ±s”表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和重復(fù)測(cè)量資料方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? AJH活性成分及作用靶點(diǎn)

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選得到AJH活性成分193個(gè)，結(jié)果見表2。通過活性成分篩選并去重后得到AJH潛在作用靶點(diǎn)116個(gè)。

3.2? “中藥-活性成分-交集靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)分析

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫得到OP的靶點(diǎn)4 613個(gè)，取疾病靶點(diǎn)與藥物活性成分靶點(diǎn)的交集，并繪制韋恩圖。詳見圖1。

基于AJH活性成分與OP靶點(diǎn)的相互作用，采用Cytoscape軟件構(gòu)建“中藥-活性成分-交集靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖2。圖中節(jié)點(diǎn)分別代表藥物、疾病、交集靶點(diǎn)、活性成分等，線代表兩節(jié)點(diǎn)之間存在互作關(guān)系。結(jié)果顯示AJH中的槲皮苷、山柰酚、射干醇A、丹皮酚、肉桂醛等多種活性成分能調(diào)控PTGS1、NR3C1、AR等多個(gè)靶點(diǎn)，體現(xiàn)了AJH具有多靶點(diǎn)、多成分協(xié)同調(diào)控OP的特點(diǎn)。

3.3? PPI網(wǎng)絡(luò)分析

PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示共有82個(gè)節(jié)點(diǎn)、801條邊構(gòu)成，平均度值為19.5，見圖3。使用R軟件統(tǒng)計(jì)預(yù)測(cè)出的AJH治療OP的關(guān)鍵蛋白，見圖4。PPI結(jié)果顯示，IL-6、ESR1、CASP3、HSP90AA1、PPARG、HIF1A、EGFR、MYC、FOS、CCND1度值較高，可能是在AJH治療OP中發(fā)揮重要作用的核心靶點(diǎn)。

3.4? GO功能及KEGG通路富集分析

GO富集分析得到條目共1 358個(gè)，其中BP條目1 248個(gè)、CC條目25個(gè)、MF條目85個(gè)。可視化結(jié)果見圖5。GO功能分析結(jié)果預(yù)測(cè)，關(guān)鍵靶點(diǎn)主要涉及類固醇激素的反應(yīng)、對(duì)酮的反應(yīng)、活性氧代謝過程的調(diào)控等。KEGG富集分析結(jié)果見圖6，關(guān)鍵靶點(diǎn)可富集得到114個(gè)信號(hào)通路主要包括雌激素信號(hào)通路、凋亡、Wnt/β-catenin信號(hào)通路等，提示AJH可通過多種信號(hào)通路對(duì)OP發(fā)揮治療作用。

3.5? AJH對(duì)ST-2細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8結(jié)果顯示ST-2細(xì)胞在不同濃度AJH干預(yù)0、24、48、72 h后，與Control組相比，10 μg/mL AJH組、20 μg/mL AJH組的OD值無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖7。結(jié)果表明10、20 μg/mL AJH對(duì)ST-2細(xì)胞增殖的影響沒有差異，因而選取10、20 μg/mL AJH進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.6? AJH對(duì)ST-2細(xì)胞成骨分化的影響

ALP染色結(jié)果顯示，與成骨誘導(dǎo)組相比，AJH組ALP染色顏色明顯加深，提示AJH能夠促進(jìn)ST-2細(xì)胞向成骨方向分化。詳見圖8。

3.7? AJH對(duì)ST-2細(xì)胞成骨轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達(dá)的影響

與Control組相比，成骨誘導(dǎo)組Runx2、Osterix、ALPL的mRNA表達(dá)顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明成骨誘導(dǎo)能夠有效促進(jìn)成骨轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)；與成骨誘導(dǎo)組相比，10 μg/mL AJH組Runx2、Osterix、ALPL的mRNA表達(dá)顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖9。

3.8? AJH對(duì)ST-2細(xì)胞成骨轉(zhuǎn)錄因子蛋白表達(dá)影響

與Control組相比，成骨誘導(dǎo)組Runx2蛋白表達(dá)顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與成骨誘導(dǎo)組相比，10 μg/mL AJH組Osx、Runx2蛋白表達(dá)顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖10。

3.9? AJH對(duì)ST-2細(xì)胞β-catenin與Sfrp1表達(dá)的影響

與Control組相比，成骨誘導(dǎo)組β-catenin的mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與成骨誘導(dǎo)組相比，10 μg/mL AJH組β-catenin的mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此外，與成骨誘導(dǎo)組相比，10 μg/mL AJH組Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制因子Sfrp1的mRNA表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖11。

4 討論

OP是一種以骨量減少、骨微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致骨脆性增加及骨折危險(xiǎn)性增高為特征的全身性代謝性骨病[8]。OP的治療與骨重建關(guān)系密切。骨形成與骨吸收是骨重建相偶聯(lián)的兩個(gè)過程，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分別是其效應(yīng)細(xì)胞。骨形成和骨吸收的動(dòng)態(tài)平衡一旦被打破，將會(huì)引起包括OP和佩吉特病等[9-10]在內(nèi)的多種骨代謝疾病。目前，臨床上存在的OP治療藥物大多不能從根本上逆轉(zhuǎn)已出現(xiàn)的骨量減少和骨微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞，即使是少數(shù)能夠促進(jìn)骨形成的藥物如雌激素，也因有增加乳腺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，限制了其在OP治療中臨床應(yīng)用[11]。中醫(yī)藥在治療脂代謝疾病方面具有多靶點(diǎn)、多通路、藥物安全性高等優(yōu)點(diǎn)，因此，尋找治療OP的有效中藥具有重要意義。

中藥AJH，始載于《圖經(jīng)本草》，其性平、味辛、微苦，歸肺、肝經(jīng)。2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》[12]記載AJH具有化痰利濕、活血化瘀之功效，其歸經(jīng)與功效與OP病因病機(jī)聯(lián)系緊密。OP在中醫(yī)學(xué)中屬于“骨痿”范疇，常為虛實(shí)夾雜、本虛標(biāo)實(shí)之候，與肝、腎密切相關(guān)[13]。因外感致病者，濕熱邪毒耗傷陰津，久則損耗肝腎陰血，是為虛實(shí)夾雜；因內(nèi)傷致病者，多因津液、氣血、精髓的虧虛而生。“腎主骨，生髓”，腎精虧虛虧損則導(dǎo)致筋骨失養(yǎng)、骨萎失用，久則兼現(xiàn)濕熱痰瘀，是為本虛標(biāo)實(shí)。因此，AJH從藥效上分析其有治療OP潛能。

本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選AJH-OP的交集靶點(diǎn)，進(jìn)行PPI分析可知，ESR1、CASP3、HSP90AA1、PPARG、HIF1A、EGFR、MYC、FOS、CCND1等可能為主要有效靶點(diǎn)，提示AJH可能通過調(diào)節(jié)激素、代謝、凋亡等治療脂代謝疾病。GO功能分析證實(shí)五苓散作用于脂代謝疾病的靶點(diǎn)主要參與對(duì)酮的反應(yīng)、類固醇激素的反應(yīng)、活性氧代謝過程；KEGG富集分析主要涉及凋亡、雌激素信號(hào)通路、Wnt/β-catenin信號(hào)通路等疾病通路。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是成骨細(xì)胞分化的分子開關(guān)，該通路在骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展和成骨細(xì)胞分化調(diào)控中的重要作用越來越受到關(guān)注。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[14]，作為Wnt配體的共同受體LRP5[15]的增加能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的數(shù)量增多，而LRP6受體缺失的小鼠骨密度較正常小鼠低。同時(shí)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，Wnt蛋白能夠改變膜受體構(gòu)象，調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)傳遞，從而影響成骨細(xì)胞的發(fā)育[16]。丹參素等中藥單體成分也可通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[17]。鑒于Wnt/β-catenin信號(hào)通路在骨重建和成骨細(xì)胞分化中的重要作用，因此從Wnt/β-catenin信號(hào)通路的視角揭示防治OP藥物的作用機(jī)制，能夠?yàn)楣谴x相關(guān)疾病的治療提供新思路。

骨具有復(fù)雜的生理作用，其中骨髓是維持骨生理功能、保證骨發(fā)育及內(nèi)分泌調(diào)節(jié)的重要成分。骨髓中存在的許多成熟細(xì)胞類型都來源于BMSC，BMSC是一種多潛能干細(xì)胞，可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞[18]。生理狀態(tài)下，多種信號(hào)分子控制著BMSC的定向分化[19]，隨著骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化，細(xì)胞代謝和形態(tài)等發(fā)生變化，進(jìn)一步影響骨形成。在病理狀態(tài)下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化失衡，骨形成減少[20-21]，導(dǎo)致骨生長(zhǎng)缺陷和骨代謝紊亂，是OP、骨折等疾病的主要內(nèi)源性因素。目前，研究BMSC成骨分化是治療OP等骨相關(guān)疾病的重要策略。在動(dòng)物模型及臨床試驗(yàn)中，BMSC已被證實(shí)可修復(fù)多種退行性疾病的受損組織[22-23]。同時(shí)，BMSC具有歸巢能力，可以遷移到損傷部位，分泌有助于組織再生的趨化因子、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子[24]。OP治療需要維持骨穩(wěn)態(tài)與促進(jìn)骨形成，多種信號(hào)分子參與了骨穩(wěn)態(tài)維持及骨形成過程。Runx2是參與調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化的一種特異性轉(zhuǎn)錄因子[25]。Runx2與Osx啟動(dòng)子中的DNA元件結(jié)合，激活間充質(zhì)細(xì)胞中Osx啟動(dòng)子，調(diào)節(jié)骨和軟骨形成。Osx也稱轉(zhuǎn)錄因子SP7，屬于Sp/KLF因子[26]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)Osx缺失小鼠，間充質(zhì)干細(xì)胞不能沉積骨基質(zhì)，骨膜中的細(xì)胞無法分化為成骨細(xì)胞[27]，已形成的骨骼中Osx失活會(huì)導(dǎo)致成骨細(xì)胞功能缺陷，進(jìn)而導(dǎo)致骨小梁生成減少[28]。ALPL是成骨分化晚期及骨形成的重要標(biāo)志物。它可作為上游基因，影響Wnt蛋白家族的分泌，從而影響間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[29]。

本研究結(jié)果顯示，ALP染色結(jié)果顯示，AJH干預(yù)后ST-2細(xì)胞ALP染色明顯加深；Runx2、OSX、ALPL基因表達(dá)結(jié)果顯示，與成骨誘導(dǎo)組相比，10 μg/mL AJH組成骨轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達(dá)均顯著提升；同時(shí)，AJH可顯著提高Runx2、OSX的蛋白表達(dá)水平。這一結(jié)果證實(shí)AJH能夠促進(jìn)ST-2細(xì)胞成骨分化。AJH可顯著提高β-catenin的mRNA及蛋白表達(dá)，同時(shí)下調(diào)Sfrp1 mRNA水平，這些結(jié)果表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路介導(dǎo)了AJH促進(jìn)成骨分化的作用。

綜上，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，AJH具有多靶點(diǎn)、多通路治療OP的作用，并且Wnt/β-catenin可能是AJH治療OP的重要通路。本研究為揭示傳統(tǒng)中藥治療OP的機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)。

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