超聲提取-椰殼炭純化酸櫻桃果皮原花青素工藝研究

李杰 周云法 沈曉宇

摘 要：本文對酸櫻桃果皮原花青素的提取純化工藝進(jìn)行了研究。以酸櫻桃加工副產(chǎn)物果皮為原料，采用超聲提取-椰殼炭吸附法分離純化原花青素，并以柱后液和洗脫液原花青素濃度為指標(biāo)，考察吸附過程中椰殼炭的目數(shù)、上樣濃度、上樣流速以及解析過程中洗脫乙醇濃度、洗脫速度等影響因素。結(jié)果表明，最佳工藝條件為以50～70目椰殼炭進(jìn)行吸附，上樣濃度8 mg·mL-1，上樣速度3 BV·h-1，以70%乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫速度2 BV·h-1。穩(wěn)定性試驗(yàn)顯示，酸櫻桃果皮渣粗提物的原花青素含量由6.13%提高至21.22%，且回收率高達(dá)83%。

關(guān)鍵詞：超聲提??；椰殼炭；酸櫻桃；原花青素

Abstract： The extraction and purification process of procyanidins from Prunus cerasus was studied in this paper. The by-product of Prunus cerasus in processing was used as raw material， and procyanidins were extracted by ultrasound and purified with coconut shell charcoal. With the concentration of procyanidins in effluent and eluent as evaluating indicator， the influencing factors were investigated， including charcoals particle size， sample concentration， sample flow rate during absorption as well as ethanol concentration and elution flow rate. The results showed that the optimal process conditions were adsorption with 50～70 mesh of coconut shell charcoal was used， with the sample concentration of 8 mg·mL-1 and sample rate of 3 BV·h-1， and eluted by 70% ethanol at the rate of?2 BV·h-1. Stability study indicates that purity of procyanidins in Prunus cerasus crude extract increased from 6.13% to 21.22%， with the recovery rate of 83%.

Keywords： ultrasonic extraction; coconut shell charcoal; Prunus cerasus; procyanidins

酸櫻桃（Prunus cerasus）為薔薇科李屬植物，其果實(shí)味道酸甜，營養(yǎng)豐富，含有多種維生素和礦物質(zhì)，還富含多糖、黃酮、有機(jī)酸、原花青素等多種活性物質(zhì)，相比于甜櫻桃有更高的藥用價值，酸櫻桃的營養(yǎng)成分受氣候、地理、儲存條件影響顯著[1-2]?，F(xiàn)代研究表明，酸櫻桃中的花青苷和原花青素具有很好的抗氧化和抗炎癥作用，并具有清除自由基、預(yù)防性血管疾病等多種藥理作用。原花青素純化的高性價比方法為大孔樹脂吸附洗脫法[3-5]，但此類方法往往存在塑化劑殘留的情況，不利于食品安全。酸櫻桃多用于制備濃縮汁，其加工副產(chǎn)物果皮渣往往被丟棄而造成浪費(fèi)。

椰殼炭以優(yōu)質(zhì)椰子殼為原料，經(jīng)系列生產(chǎn)工藝精加工而成，具有孔隙發(fā)達(dá)、吸附性能好、強(qiáng)度高、易再生、經(jīng)濟(jì)耐用等優(yōu)點(diǎn)。本研究以酸櫻桃加工過程中的副產(chǎn)物果皮渣為原料，采用超聲提取-椰殼炭吸附法分離純化原花青素[6-8]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸櫻桃（產(chǎn)地波蘭）果皮，寧波御坊堂生物科技有限公司；椰殼活性炭，木林森活性炭江蘇有限公司；原花青素（UV≥95%），成都曼斯特生物科技有限公司；乙醇（分析級95%），南京盛慶和化工有限公司；甲醇（分析級99.5%），南京盛慶和化工有限公司；香草醛（分析級99%），上海源葉生物科技有限公司；濃鹽酸（分析級37%），揚(yáng)州市華富化工有限公司；蒸餾水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XSD-1500超聲清洗機(jī)，張家港市鑫盛達(dá)超聲科技有限公司；RE-52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生物儀器廠；FD-A10N-50冷凍干燥機(jī)，冠森生物科技（上海）有限公司；TU-1800可見光分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 超聲提取酸櫻桃果皮渣中原花青素

準(zhǔn)確稱取一定量的酸櫻桃果皮渣，按料液比1∶15（g∶mL）加入50%的乙醇溶液，50 ℃超聲提取30 min[9-10]，提取2次，過濾合并，50 ℃以下減壓濃縮，冷凍干燥得到原花青素粗提物，取樣檢測原花青素含量，粗提物用于制備上樣液。

1.3.2 原花青素檢測及計算方法

（1）原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密稱取原花青素標(biāo)準(zhǔn)品25.09 mg于25 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度線，搖勻，作為儲備液。分別精密量取0.5 mL、2.0 mL、4.0 mL、 6.0 mL和8.0 mL上述儲備液至10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋定容得到不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL于試管中，加入6 mL香草醛-甲醇溶液（40 g·L-1）和

3 mL濃鹽酸，充分混勻后在30 ℃水浴中避光靜置

1 h，快速在500 nm處測定吸光值。以甲醇為空白組，以標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，得原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。原花青素溶液在0.05～0.80 mg·mL-1線性關(guān)系良好。

（2）柱后液原花青素濃度測定。收集并精密量取椰殼炭柱后液的樣品（上樣流出液和乙醇洗脫液）4.0 mL，置于10 mL棕色量瓶中，加入甲醇溶解，定容，按上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液測定方法測定500 nm下的吸光值，計算柱后液樣品中原花青素濃度（mg·mL-1）。

（3）提取物原花青素含量測定及計算。精密稱取提取物樣品適量，于100 mL棕色量瓶中，加入甲醇溶解，定容，按上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液測定方法測定500 nm下的吸光值，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到提取物中原花青素的濃度。

1.4 工藝優(yōu)化試驗(yàn)

1.4.1 椰殼炭吸附原花青素性能研究

（1）椰殼炭的目數(shù)選擇。稱取4～8目、10～20目、30～40目、50～70目、80～200目的椰殼炭各50 g，裝柱。精密稱取以上原花青素粗提物用蒸餾水配制成10 mg·mL-1的樣液上樣，以上樣流速為3 BV·h-1進(jìn)行吸附，分段收集流出液，每段收集的流出液為1柱體積（Bed volume，BV），檢測每段流出液中原花青素的濃度，根據(jù)流出液濃度變化，繪制椰殼炭吸附原花青素曲線，確定椰殼炭的最佳目數(shù)。

（2）上樣濃度的選擇。稱取最優(yōu)目數(shù)的椰炭50 g，裝柱。上樣濃度為4 mg·mL-1、6 mg·mL-1、8 mg·mL-1、10 mg·mL-1、12 mg·mL-1，以上樣流速為3 BV·h-1進(jìn)行吸附，同上分段收集流出液，繪制椰殼炭吸附原花青素曲線，確定最佳上樣濃度。

（3）上樣流速的選擇。稱取最優(yōu)目數(shù)的椰殼炭50 g，裝柱。精密稱取以上粗提物用蒸餾水配制成10 mg·mL-1的樣液上樣，考慮到椰殼炭阻力，上樣流速為2 BV·h-1、3 BV·h-1、4 BV·h-1進(jìn)行吸附，同上分段收集流出液，繪制椰殼炭吸附原花青素曲線，確定最佳上樣流速。

1.4.2 椰殼炭解析原花青素性能研究

（1）洗脫乙醇濃度的選擇。優(yōu)選最佳上樣吸附條件，用50%、60%、70%、80%乙醇溶液進(jìn)行洗脫，洗脫速度為3 BV·h-1，分段收集流出液，每段收集的流出液為1 BV，檢測每段流出液中原花青素的濃度，根據(jù)流出液濃度變化，繪制原花青素解析曲線，確定最佳洗脫乙醇濃度。

（2）洗脫速度的選擇。優(yōu)選最佳上樣吸附條件和洗脫濃度，對比洗脫速度1 BV·h-1、2 BV·h-1、3 BV·h-1、4 BV·h-1，同上分段收集流出液，繪制原花青素解析曲線，確定最佳洗脫速度。

1.4.3 椰殼炭吸附純化原花青素穩(wěn)定性研究

稱取最佳目數(shù)椰殼炭50 g，裝柱。稱取原花青素凍干粗提物4.0 g，用蒸餾水配制成最佳上樣濃度，采用最佳吸附解析工藝，分別收集每倍量段（BV）的洗脫液，分別檢測各段原花青素濃度；洗脫液在50 ℃以下減壓濃縮后，冷凍干燥得酸櫻桃原花青素提取物，稱重并檢測計算原花青素含量，平行進(jìn)行3次穩(wěn)定性試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 椰殼炭吸附原花青素結(jié)果

2.1.1 椰殼炭目數(shù)的選擇

由圖2可知，不同目數(shù)椰殼炭對原花青素溶液的吸附能力相差較大，其中4～8目及10～20目椰殼炭的前三段流出液的原花青素濃度都較高，填料未完全吸附上樣液中的原花青素，出現(xiàn)了較多泄露。其中50～70目椰殼炭吸附效果接近于80～200目椰殼炭，考慮到椰殼炭成本及生產(chǎn)效率，優(yōu)選50～70目椰殼炭。

2.1.2 上樣濃度的選擇

由圖3可知，當(dāng)上樣濃度為10～12 mg·mL-1時，椰殼炭吸附流出液的在第一段的時候出現(xiàn)明顯泄漏點(diǎn)，且泄露曲線上升較快。當(dāng)上樣濃度在4～8 mg·mL-1時，椰殼炭對原花青素吸附效果較好，第二段出現(xiàn)泄露點(diǎn)，考慮生產(chǎn)效率及原花青素回收率，優(yōu)選最佳的上樣濃度為8 mg·mL-1。

2.1.3 上樣流速的選擇

由圖4可知，上樣流速越慢，椰殼炭對原花青素吸附效果越好，其中2～3 BV·h-1的上樣流速對原花青素的吸附效果明顯優(yōu)于4 BV·h-1，結(jié)合生產(chǎn)效率，優(yōu)選的最佳的上樣流速為3 BV·h-1。

2.2 椰殼炭解析原花青素結(jié)果

2.2.1 洗脫乙醇濃度的選擇

洗脫過程要求盡可能提高原花青素的回收率，其中同一濃度洗脫液各段收集液的原花青素濃度及原花青素的純度均有所差異，實(shí)際根據(jù)下游產(chǎn)品需求進(jìn)行分類收集。由圖5可知，洗脫至3～5 BV時，洗脫液濃度明顯下降；第1～3 BV階段，70%和80%乙醇濃度的洗脫液中原花青素濃度較高，考慮到原花青素的回收率，優(yōu)選70%乙醇作為洗脫溶劑。

2.2.2 洗脫速度的選擇

由圖6可知，隨著洗脫速度的上升，洗脫液濃度明顯下降。洗脫速度為1～2 BV·h-1時，前段部分洗脫液的原花青素濃度較高，有利于制備高純度原花青素，結(jié)合生產(chǎn)效率及原花青素的回收率情況，優(yōu)選2 BV·h-1的洗脫速度。

2.3 椰殼炭吸附純化原花青素穩(wěn)定性研究

稱取50～70目椰殼炭50 g，裝柱約100 mL。稱取原花青素凍干粗提物4.0 g，用蒸餾水配制成8 mg·mL-1，上樣速度為3 BV·h-1，上樣完畢后用70%乙醇洗脫，洗脫速度為2 BV·h-1，洗脫5 BV，檢測上樣液及每段洗脫液中原花青素濃度，做3組平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，椰殼炭吸附純化原花青素的穩(wěn)定性良好。其中上樣液原花青素濃度為0.49 mg·mL-1，計算得原花青素粗提物含量為6.13%，經(jīng)椰殼炭純化后原花青素含量可達(dá)21.12%，原花青素回收率達(dá)83%。

3 結(jié)論

采用超聲提取-椰殼炭吸附法分離純化酸櫻桃果皮渣中原花青素，可有效解決酸櫻桃濃縮汁生產(chǎn)過程中副產(chǎn)物果皮渣的浪費(fèi)。研究顯示，使用超聲低溫提取可最大限度地保留原花青素，且使用椰殼炭作為吸附劑來進(jìn)行純化，一方面可以克服大孔樹脂等塑化劑的殘留，另一方面降低了生產(chǎn)成本。研究表明使用椰殼炭純化酸櫻桃果皮中原花青素的最佳工藝為使用50～70目椰殼炭，上樣濃度為8 mg·mL-1，上樣速度為3 BV·h-1，洗脫乙醇濃度為70%乙醇，洗脫速度為2 BV·h-1。經(jīng)過3批穩(wěn)定性試驗(yàn)，酸櫻桃果皮渣粗提物原花青素含量由6.13%提高至21.22%，且原花青素回收率高達(dá)83%。

本研究只初步考察了椰殼炭對酸櫻桃果皮中原花青素的吸附與解析作用，并提供了原花青素的有效提純方法。酸櫻桃汁的制備副產(chǎn)物果皮渣在實(shí)際放大分離和純化原青花素的過程中，應(yīng)充分考慮椰殼炭柱壓的影響。關(guān)于吸附柱串聯(lián)或并聯(lián)使用以減少上樣液的泄露，并對椰殼炭的再生及重復(fù)利用應(yīng)做更進(jìn)一步的研究。

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