基于GC-MS/MS聯(lián)合HPLC-MS/MS測定大棗禁用農(nóng)藥殘留

吳祿祥 黃若干 周勁松 劉春榮 藍(lán)曉東 鐘林靜

摘 要：目的：建立QuEChERS結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Gas Chromatography-tandem Mass Spectrometry，GC-MS/MS）聯(lián)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（High Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS）檢測大棗禁用農(nóng)藥殘留的方法。方法：樣品以體積比為1%的乙酸乙腈為溶劑，高速勻漿，采用QuEChERS法凈化處理樣品，分別以氣質(zhì)法和液質(zhì)法進(jìn)行分析，氣質(zhì)法采用外標(biāo)法定量，液質(zhì)法采用內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果：氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測的35種農(nóng)藥線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均≥0.997 2，定量限為0.000 1～0.005 5 mg·kg-1，回收率為65.54%～101.03%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.38%～11.54%。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定的30種農(nóng)藥線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均≥0.989 6，定量限為0～0.000 49 mg·kg-1，回收率為62.92%～109.96%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.04%～3.71%。結(jié)論：該方法操作簡便、高效、定量定性準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好，適用于大棗禁用農(nóng)藥殘留的快速檢測。

關(guān)鍵詞：大棗；氣相色譜法-串聯(lián)質(zhì)譜法；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；QuEChERS；禁用農(nóng)藥殘留

Abstract： Objective： The method of QuEChERS combined with gas chromatography-tandem mass spectrometry（GC-MS/MS） and high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS） for the determination of forbidden pesticide residues in jujube was established. Method： The samples were purified by QuEChERS method using acetonitrile with 1% volume ratio as solvent and homogenized at high speed. The samples were analyzed by temperament method and liquid mass method respectively. The temperament method was quantified by external standard method， and the liquid mass method was quantified by internal standard method. Result： The linear relationship of 35 pesticides detected by gas chromatography-tandem mass spectrometry was good. The correlation coefficients were all greater than 0.997 2， the limits of quantitation were 0.000 1～0.005 5 mg·kg-1， the recoveries were 65.54%～101.03%， and the relative standard deviations were 0.38%～11.54%. The 30 pesticides determined by high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry have good linear relationships. The correlation coefficients were all greater than 0.989 6， the limits of quantification were 0～0.000 49 mg·kg-1， the recoveries were 62.92%～109.96%， and the relative standard deviations were 0.04%～3.71%. Conclusion： This method is simple and efficient， with accurate quantitative and qualitative analysis， high sensitivity， good reproducibility and stability， and is suitable for the rapid detection of prohibited pesticide residues in jujube medicinal materials.

Keywords： jujube; gas chromatography-tandem mass spectrometry; high performance liquid chromatography- tandem mass spectrometry; QuEChERS; prohibited pesticide residues

大棗（Ziziphus jujuba Mill.）屬于鼠李科植物棗的干燥成熟果實[1]，有養(yǎng)胃、健脾、益血等效果，屬安神類中藥[2]，被廣泛應(yīng)用于臨床、中藥制劑、大健康產(chǎn)品的開發(fā)?，F(xiàn)代藥理研究證明，大棗含黃酮、生物堿、三萜類和多糖類等化合物，具有降壓、鎮(zhèn)靜催眠、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、補血、增強(qiáng)心肌收縮力和減輕疲勞等作用[3]。大棗極易遭受病蟲害，種植戶濫用農(nóng)藥導(dǎo)致農(nóng)藥殘留超標(biāo)已成為影響大棗質(zhì)量和安全的重要因素。農(nóng)藥殘留會導(dǎo)致人體多種疾病，如引發(fā)心肌炎[4]，危害神經(jīng)系統(tǒng)，甚至有致癌、致畸、致突變等危害[5]，導(dǎo)致女性患乳腺癌、子宮癌的風(fēng)險增加[6]，已經(jīng)成為不容忽視的問題[7]，引起普遍關(guān)注。中國藥典2020年版收錄了中藥材及飲片（植物類）33種禁用農(nóng)藥，農(nóng)藥殘留檢測方法氣相色譜法[8]和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9]，中國藥典“第五法藥材及飲片（植物類）中禁用農(nóng)藥多殘留測定法”[10]規(guī)定了中藥材及飲片的禁用農(nóng)藥殘留測定方法為氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。大棗作為藿香正氣顆粒的主要原料，常有農(nóng)藥殘留超標(biāo)的情況發(fā)生。為保證用藥安全，廣西白云山盈康藥業(yè)有限公司特別關(guān)注了原料大棗的質(zhì)量和農(nóng)藥殘留問題，通過建立QuEChERS結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Gas Chromatography-tandem Mass Spectrometry，GC-MS/MS）聯(lián)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（High Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS），以中國藥典2020年版農(nóng)藥殘留分析方法為依據(jù)，對大棗中禁用農(nóng)藥殘留進(jìn)行了研究，可為中藥禁限用農(nóng)藥監(jiān)管和檢測提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

冰醋酸（優(yōu)級純，20200427-001）、甲酸（AR，20200710-001），購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；提取鹽（60105-335-B），賽默飛世爾科技（中國）有限公司；分散固相萃取凈化管（6015-509-B），北京迪科馬科技有限公司；甲酸銨（色譜純）、異丙醇（色譜純，L6750432-004）、乙腈（色譜純，M1881440-041）、甲醇（色譜純，06751440-019），中山聯(lián)思化科技有限公司；磷酸三苯酯（CDAA-S-412134-JD-1 mL）、55種禁用農(nóng)藥混合對照品溶液（CDAA-M-490407-TY-1.2 mL），上海安譜實驗科技股份有限公司。委托合格供應(yīng)商收集山西、新疆、河北、甘肅、山東和福建等10批不同產(chǎn)地的大棗。

1.2 試驗方法

1.2.1 制備對照溶液

（1）制備混合對照溶液。精密量取250 μL禁用農(nóng)藥混合對照溶液，置于量瓶中，加乙腈配制中間儲備液；精密量取中間儲備液2 mL，置于量瓶中，加乙腈到規(guī)定量，搖勻，制備工作溶液。

（2）制備GC-MS/MS法分析用內(nèi)標(biāo)溶液。精密取磷酸三苯酯對照品適量，制成0.1 mg·L-1的分析用內(nèi)標(biāo)溶液磷酸三苯酯。

（3）制備空白基質(zhì)溶液。照供試溶液制備方法，取空白基質(zhì)樣品適量，制成空白基質(zhì)溶液。

（4）基質(zhì)混合對照溶液的制備。精密吸取6份空白基質(zhì)溶液各1.0 mL，40 ℃氮吹濃縮至約0.4 mL，分別加工作溶液l0 μL、20 μL、50 μL、l00 μL、150 μL和200 μL，加乙腈定容至l mL，渦旋混勻，即得。

1.2.2 制備供試溶液

取供試適量，剪切成塊再研磨成粉，取粉末3 g，置于50 mL聚苯乙烯具塞離心管中，加1%冰醋酸溶液15 mL，渦旋后靜置30 min，加乙腈15 mL，渦旋5 min，加質(zhì)量比為4∶1的無水硫酸鎂與無水乙酸鈉混合粉末7.5 g，加入粉末后立即搖散，并振蕩器劇烈振蕩3 min，置冰浴冷卻10 min，以4 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心5 min，再取上清液9 mL，置于已裝有凈化材料（無水硫酸鎂900 mg、N-丙基乙二胺300 mg、十八烷基硅烷鍵合硅膠300 mg、硅膠300 mg、石墨化碳黑90 mg）的分散固相萃取凈化管，以4 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速渦旋振蕩5 min，使凈化完全，精密取上清液5 mL，置水浴吹氮儀上40 ℃蒸至約0.4 mL，加乙腈至1.0 mL，渦旋混勻，取0.5 mL于10 mL離心管中，加入150 μL內(nèi)標(biāo)渦旋混勻，0.22 μm有機(jī)濾膜濾過，精密量取0.5 mL樣液，置于10 mL離心管中，加入150 μL一級水，渦旋混勻，0.22 μm有機(jī)濾膜濾過。

1.2.3 GC-MS/MS法

（1）色譜條件。50%苯基-甲基聚硅氧烷為固定液的彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）。溫度250 ℃，不分流進(jìn)樣。載氣高純氦氣（He），柱前壓力146 kPa，恒壓模式。升溫程序：初溫60 ℃，保持1 min，30 ℃·min-1升至120 ℃，10 ℃·min-1升至160 ℃，2 ℃·min-1升至230 ℃，15 ℃·min-1升至300 ℃，保持6 min。

（2）質(zhì)譜條件。采用三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測；離子源為EI；溫度250 ℃；碰撞氣為氮氣或氬氣；質(zhì)譜傳輸接口的溫度為250 ℃；質(zhì)譜監(jiān)測模式為多反應(yīng)監(jiān)測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）。

1.2.4 HPLC-MS/MS法

（1）色譜條件。色譜柱（10 cm×2.1 mm，2.6 μm）以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相A：0.1%甲酸溶液（含5 mmol·L-1甲酸銨），流動相B：乙腈-0.1%甲酸溶液（含5 mmol·L-1甲酸銨）體積比95∶5，按表1所示時間和流動相比例梯度洗脫，柱溫40 ℃，流速0.3 mL·min-1。

（2）質(zhì)譜條件。采用三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測；ESI離子源；MRM監(jiān)測模式；正離子掃描模式。

1.2.5 測定方法

（1）GC-MS/MS法。分別精密吸取基質(zhì)混合對照液、供試液各0.5 mL，置于10 mL離心管中，精密加入150 μL內(nèi)標(biāo)溶液，混勻，0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，精密取過濾后的基質(zhì)混合對照液、供試液兩種溶液各1 μL，注入氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，按外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算。

（2）HPLC-MS/MS法。分別精密取基質(zhì)混合對照液、供試品液各0.5 mL，置于10 mL離心管中，精密加入150 μL純水，混勻，0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，精密取過濾后的基質(zhì)混合對照液、供試液兩種溶液各2 μL，注入高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，按內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測

將一定濃度的混合對照品溶液分別注入液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀和氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，在MRM模式下，對關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，并確定分析條件的最佳參數(shù)，獲得總離子流圖，見圖1、圖2。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性及定量限驗證

實驗結(jié)果表明，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測的35種農(nóng)藥線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均≥0.997 2，定量限為0.000 1～0.005 5 mg·kg-1，說明各禁用農(nóng)藥成分的氣質(zhì)曲線線性良好，信噪比均大于10且定量限達(dá)到要求，見表2；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定的30種農(nóng)藥相關(guān)系數(shù)均≥0.989 6，線性關(guān)系良好，定量限為0～0.000 49 mg·kg-1，說明液質(zhì)曲線線性良好，信噪比均大于10，定量限達(dá)到要求，見表3。

2.3 準(zhǔn)確度檢驗

稱取約5 g不含目標(biāo)物的供試品9份，分低、中、高3組，每組3份，低、中、高組分別加中間儲備溶液30 μL、60 μL、90 μL，依照供試品液制備方法檢測，計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。35種禁用農(nóng)藥的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法回收率為65.54%～101.03%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.38%～11.54%，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法回收率為62.92%～109.96%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.04%～3.71%。實驗回收率均在60.00%～130.00%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于15%，說明本方法準(zhǔn)確性、精密度良好，滿足農(nóng)藥殘留檢測要求。

2.4 穩(wěn)定性試驗

精密稱定樣品1份，加入1.2.1步驟（1）下的中間儲備溶液30 μL，按照供試液制備方法制備供試液，室溫放置，在0 h、3 h、6 h、9 h、12 h和24 h取樣測定，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法各個時間化合物檢出濃度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%，說明加標(biāo)后樣品溶液室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3 結(jié)論與討論

本研究利用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對10批來自不同產(chǎn)地的大棗進(jìn)行禁用農(nóng)藥殘留檢測分析，該方法穩(wěn)定性較好，適合大棗的農(nóng)藥殘留檢測。不同產(chǎn)地的10批大棗均未檢出禁用農(nóng)藥殘留，質(zhì)量達(dá)標(biāo)。

目前，國內(nèi)尚未有關(guān)大棗禁用農(nóng)藥殘留檢測標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)報道，本研究建立了氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法聯(lián)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定大棗禁用農(nóng)藥殘留的方法，通過添加內(nèi)標(biāo)和建立基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線消除基質(zhì)效應(yīng)，避免樣品出現(xiàn)假陰性。本研究通過在高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜中，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，降低基質(zhì)效應(yīng)的影響；在氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜中，通過添加內(nèi)標(biāo)物質(zhì)磷酸三苯酯，降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，從而解決質(zhì)譜檢測結(jié)果普遍存在基質(zhì)效應(yīng)的難題。農(nóng)藥殘留檢測常用提取溶劑為石油醚、醋酸乙酯、乙腈、正己烷和丙酮等[11-13]。為減少基質(zhì)效應(yīng)的干擾，多以乙腈提取，QuEChERS凈化，以提高目標(biāo)物的富集程度和檢測靈敏度[14-15]。本研究采用1%乙酸浸制30 min，再加入乙腈提取，保護(hù)了對酸堿敏感的農(nóng)藥成分，提高了穩(wěn)定性。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和檢驗技術(shù)的不斷提高，越來越多的標(biāo)準(zhǔn)將采用氣質(zhì)聯(lián)用和液質(zhì)聯(lián)用作為主要的農(nóng)藥殘留分析手段，本研究對農(nóng)作物規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化種植起到積極的推動作用。

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