花鱸仔稚魚視覺、消化和運(yùn)動(dòng)等器官發(fā)育組織學(xué)觀察

韓楓，張凱強(qiáng)，馮啟超，溫海深

（1.全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站中國水產(chǎn)學(xué)會(huì)，北京 100125；2.中國海洋大學(xué)，山東 青島 266003）

花鱸（Lateolabrax maculatus）別名板鱸、青鱸、七星鱸、寨花[1]，屬廣溫廣鹽性魚類，分布于中國沿海河口等淺海地區(qū)，以咸淡水交匯處為其理想棲息地，少部分群體具有洄游習(xí)性[2]?；|味道鮮美，質(zhì)嫩爽口，營養(yǎng)豐富，廣受消費(fèi)者的認(rèn)可，市場需求量逐年增加，養(yǎng)殖規(guī)模也逐步擴(kuò)大，2020 年全國花鱸養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)19.52 萬噸，比2019 年增長8.37%，在海水魚養(yǎng)殖產(chǎn)量中位居第二，其中，廣東、福建、山東、浙江等4 省花鱸養(yǎng)殖產(chǎn)量約占全國產(chǎn)量90%[3]，我國每年向東北亞及歐洲地區(qū)出口花鱸3 萬噸左右，其中對(duì)日本和韓國的出口量占總出口量的80%以上。作為我國重要的經(jīng)濟(jì)魚類，養(yǎng)殖模式隨著養(yǎng)殖產(chǎn)量的不斷提高，逐漸從傳統(tǒng)池塘養(yǎng)殖向海水網(wǎng)箱和工廠化養(yǎng)殖轉(zhuǎn)變[1]。目前，南方花鱸種群生產(chǎn)性能下降，病害嚴(yán)重，而北部海域主要依賴捕撈天然苗種來滿足生產(chǎn)需求，已成為制約花鱸養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸，建立規(guī)?；头€(wěn)定的優(yōu)質(zhì)苗種生產(chǎn)體系已是當(dāng)務(wù)之急。目前對(duì)于花鱸的研究主要包括繁殖生物學(xué)[4-9]、攝食生長[10,11]、人工育苗[12-14]、疾病與免疫研究[14-22]、種質(zhì)資源調(diào)查[23,24]等，為花鱸苗種規(guī)?；庇於藞?jiān)實(shí)基礎(chǔ)。但關(guān)于花鱸仔魚早期器官發(fā)育分化以及前期仔魚階段營養(yǎng)供應(yīng)的研究較少。本研究用解剖學(xué)方法和石蠟切片技術(shù)，較詳細(xì)地描述了孵出1～35 日齡（dph，day post hatching）花鱸仔魚與攝食活動(dòng)相關(guān)的眼、與營養(yǎng)消化相關(guān)的卵黃囊、以及與運(yùn)動(dòng)和生長相關(guān)的肌肉組織發(fā)育特征，以了解花鱸仔魚組織結(jié)構(gòu)特征與生理適應(yīng)性之間的關(guān)系，優(yōu)化花鱸苗種的早期培育方法，助力花鱸產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

2019 年11 月在福建省詔安縣進(jìn)行了花鱸的繁殖試驗(yàn)，所獲得的受精卵空運(yùn)至山東省東營市利津縣雙瀛苗種有限責(zé)任公司進(jìn)行孵化、魚苗培育。定時(shí)對(duì)1～35 dph 的花鱸魚苗取樣，用Bouin 氏液固定全魚24 h 后轉(zhuǎn)移至70%酒精中保存。

1.2 方法

組織樣本通過梯度乙醇脫水及二甲苯透明處理后，石蠟包埋，切片（6 μm），HE 染色，中性膠封片，用OLYMPUS BX53 觀察各系統(tǒng)器官發(fā)育情況，使用OLYMPUS cellSens Standard 進(jìn)行圖像采集及相關(guān)數(shù)據(jù)測量。

其中骨骼肌生長一般以特定位置特定肌節(jié)截面面積、肌纖維數(shù)量及長度等指標(biāo)來衡量，測量技術(shù)較為復(fù)雜[26]。本試驗(yàn)中，花鱸仔魚發(fā)育前期肌節(jié)分隔與肌纖維分隔均不明顯，故采用測量特定日齡、特定位置的肌肉截面積的方式衡量骨骼肌的生長變化。選取1 dph、2 dph、3 dph、4 dph、5 dph、7 dph、9 dph、11 dph、13 dph、15 dph、20 dph、25 dph、30 dph、35 dph 仔魚各10 尾，測量背鰭起點(diǎn)橫切右側(cè)肌肉面積。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 眼的組織結(jié)構(gòu)

花鱸眼球構(gòu)造同其他硬骨魚類相似，由眼球壁與內(nèi)容物組成（圖1）。眼球壁分為三層，由外向內(nèi)分別是纖維膜、血管膜與視網(wǎng)膜。纖維膜起保護(hù)內(nèi)部組織與維持基本形態(tài)的作用，依據(jù)位置不同又可分為角膜與鞏膜；血管膜起運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)及廢物的作用，由前向后分為虹膜、睫狀體、脈絡(luò)膜；視網(wǎng)膜是主要的成像組織，分布著大量的光敏細(xì)胞，自脈絡(luò)膜向玻璃體方向可依次分為色素上皮層、視桿視錐細(xì)胞層、外界膜、外核層、外網(wǎng)層、內(nèi)核層、內(nèi)網(wǎng)層、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、神經(jīng)纖維層、內(nèi)界層共10 層。內(nèi)容物主要起到折射光線的作用，由前向后分別是眼房水、晶狀體、玻璃體。晶狀體與視網(wǎng)膜的發(fā)生發(fā)育與仔魚視覺能力的產(chǎn)生密切相關(guān)。

圖1 花鱸仔魚眼球發(fā)育組織切片F(xiàn)ig.1 The histological sections of morphogenesis of larval eye of spotted sea bass（Lateolabrax maculatus）

花鱸初孵仔魚即1 dph 仔魚的晶狀體與視網(wǎng)膜剛開始發(fā)育。晶狀體體積較小，視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)不完整（圖1-1）；2 dph 仔魚晶狀體體積明顯增大，可以觀察到角膜等組織結(jié)構(gòu)（圖1-2）；3 dph 仔魚組織結(jié)構(gòu)與之前并無明顯差異，但眼球體積繼續(xù)增大且眼球前后徑增長速度快于左右徑（圖1-3）；4 dph 仔魚體積變化不明顯，視網(wǎng)膜進(jìn)一步發(fā)育，可觀察到視桿視錐細(xì)胞層、外核層等組織結(jié)構(gòu)，內(nèi)網(wǎng)層厚度加寬（圖1-4）；5 dph 仔魚眼部晶狀體體積繼續(xù)增大，視網(wǎng)膜構(gòu)造基本完善，從脈絡(luò)膜向晶狀體方向可觀察到色素上皮層、視桿視錐細(xì)胞層、外核層、外網(wǎng)層、內(nèi)核層、內(nèi)網(wǎng)層、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、神經(jīng)纖維層等，各層區(qū)分明顯，眼球發(fā)育基本完成（圖1-5）；7 dph 仔魚未觀察到與5 dph 仔魚明顯不同處（圖1-6）。

2.2 卵黃囊及早期消化器官的組織結(jié)構(gòu)

在仔魚發(fā)育過程中花鱸仔魚卵黃囊與油球的體積逐漸縮小（圖2），結(jié)合卵黃囊、油球體積變化趨勢[7]可知：1 dph 仔魚卵黃囊、油球處于胚后發(fā)育階段最大時(shí)期，油球飽滿，卵黃囊充盈（圖2-1）；2 dph，油球體積未見明顯減小，卵黃囊體積縮小，用于卵黃的消耗（圖2-2）；3 dph 仔魚在卵黃囊后端，靠近消化道處可見少數(shù)的肝臟細(xì)胞，肝臟開始發(fā)育（圖2-3）；4 dph 仔魚卵黃囊繼續(xù)縮小，肝臟已見雛形，肝臟擠占了卵黃的空間，油球體積縮?。▓D2-4）；5 dph 仔魚卵黃囊僅剩稍許卵黃，其余空間被剩余的油球與不斷增大的肝臟占據(jù)。從縱切可見，5 dph 仔魚消化道已經(jīng)貫通且胃部已經(jīng)形成（圖2-5）；6 dph 仔魚的卵黃囊中卵黃質(zhì)有零星分布，油球體積明顯減少，仔魚處于混合營養(yǎng)階段（圖2-6）。

圖2 花鱸仔魚卵黃囊切片F(xiàn)ig.2 The histological sections of yolk sac of spotted sea bass（Lateolabrax maculatus）

2.3 骨骼肌的組織結(jié)構(gòu)

1～35 dph 花鱸仔魚背鰭起點(diǎn)橫切右側(cè)肌肉纖維面積如圖3 所示。1 dph 花鱸背鰭起點(diǎn)橫切右側(cè)肌肉面積為（8 448.56±342.13）μm2，35 dph 花鱸為（392 338.74±32 138.61）μm2。肌肉總面積隨發(fā)育時(shí)間延長呈上升趨勢，且在前35 日齡中增長速率不斷加快。破膜之后前7 d，肌纖維面積增長速度緩慢；7～15 d，面積增長相對(duì)平緩；15 d 之后肌纖維面積增長迅速，1～35 dph 花鱸背鰭起點(diǎn)橫切右側(cè)肌肉面積（y，單位μm2）與發(fā)育時(shí)間（x，單位dph）關(guān)系符合函數(shù)y=5386.3e0.1166x。

圖3 不同日齡花鱸背鰭起點(diǎn)橫切右側(cè)肌纖維總面積及擬合趨勢Fig.3 Right half fiber area in transverse section at the front dorsal fin of spotted sea bass（Lateolabrax maculatus）

花鱸前期仔魚骨骼肌上部始于脊髓左右兩端，左右兩側(cè)骨骼肌不接觸，包圍脊索，下部與中腎管處匯合，其他臟器不在骨骼肌包裹范圍之內(nèi)；發(fā)展到后期，35 dph 仔魚橫切圖可看到上側(cè)肌肉向上端生長并匯合，下部肌肉向斜下方兩側(cè)擴(kuò)展，囊裹腹腔臟器，逐步接近成魚體態(tài)（圖4）。

圖4 1、7、15、35 日齡花鱸橫切Fig.4 Transverse histological sections of spotted sea bass（Lateolabrax maculatus）of 1,7,15,35 dph

2.4 5 dph 仔魚全切組織結(jié)構(gòu)

5 dph 仔魚處于由自營養(yǎng)逐步轉(zhuǎn)化為外源營養(yǎng)的階段。卵黃囊、油球尚有剩余，消化道已經(jīng)貫通可進(jìn)行初步的攝食活動(dòng)，神經(jīng)、肌肉也得到了一定的發(fā)展，系統(tǒng)結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜。因此選擇5 dph 仔魚進(jìn)行比較詳細(xì)的系統(tǒng)觀察，觀察結(jié)果如圖5 所示。

圖5 5 日齡花鱸仔魚橫切Fig.5 Transverse histological sections of 5 dph spotted sea bass（Lateolabrax maculatus）

5 dph 仔魚脊索貫穿全身，頭部骨骼已經(jīng)開始發(fā)育，包括鰓弓形成、前端脊索兩側(cè)的脊椎雛形（圖5-9、5-10）。此時(shí)期油球尚未消失（圖5-Ⅰ），肝臟與胰臟已開始形成并擴(kuò)大（圖5-6）。消化道已經(jīng)貫通（圖5-Ⅰ），在腸后端可觀察到凹縊（圖5-Ⅰ、圖5-4）。凹縊之后，肛門之前的部分為直腸，無消化腺，只起到堆積糞便的作用。胃腸分隔不明顯，但整體膨大，出現(xiàn)褶皺（圖5-6、圖5-5），行簡單的消化作用。鰾開始發(fā)育（圖5-Ⅰ），可觀察到原始鰾腔、氣腺、迷網(wǎng)等結(jié)構(gòu)（圖5-6）。胸鰭結(jié)構(gòu)已趨于完整（圖5-7），胸鰭發(fā)育要早于背鰭、臀鰭、尾鰭。心臟位于卵黃囊前端（圖5-Ⅰ、圖5-8），結(jié)構(gòu)明顯，可觀察到血細(xì)胞?？谘是恢杏^察到鰓絲及少量泌氯細(xì)胞，較短，呼吸功能與滲透調(diào)節(jié)功能還不夠完善（圖5-9）。

3 討論

3.1 眼球組織結(jié)構(gòu)特征

眼球是魚類最重要的感覺器官之一，視覺對(duì)于魚類一系列生理活動(dòng)均有影響：攝食、避敵需要依靠視覺器官獲取及時(shí)的圖像反饋；繁殖、集群、洄游等群體行為也需要視覺器官來維持。眼球切片的制作過程中部分樣本出現(xiàn)了比較嚴(yán)重的變形，這可能與取樣后未及時(shí)固定保存導(dǎo)致視網(wǎng)膜脫離有關(guān)[27]?；|初孵仔魚視覺器官并不完善，視網(wǎng)膜分層不明顯，僅能看到晶狀體、色素上皮層以及較模糊的內(nèi)網(wǎng)層等結(jié)構(gòu)，這與施氏鱘（Acipenser schrenckii）[28]的研究結(jié)果相同，但與許氏平（Sebastes schlegelii）[29]、重口裂腹魚[Schizothorax（Racoma）davidi][30]的研究結(jié)果相佐。這可能是因?yàn)榛|孵化時(shí)間較短，視覺器官還未發(fā)育成熟，而許氏平、重口裂腹魚孵化時(shí)間較長，視覺器官有較充足的時(shí)間進(jìn)行發(fā)育?；|眼部發(fā)育中，晶狀體的增長與視網(wǎng)膜的發(fā)育基本同步，晶狀體是主要的折射器官，視網(wǎng)膜是主要的成像器官，二者同步發(fā)育可以保證仔魚盡早完善視覺功能，早捕食。5 dph 花鱸仔魚卵黃囊與油球消耗殆盡，開始準(zhǔn)備攝食，此時(shí)眼部構(gòu)造發(fā)育基本完成，營養(yǎng)消化系統(tǒng)與視覺器官發(fā)育節(jié)點(diǎn)的有效銜接保障了花鱸仔魚從自營養(yǎng)到自主攝食的順利過渡。

3.2 卵黃囊及早期消化器官組織結(jié)構(gòu)特征

前期仔魚生長發(fā)育所需要的營養(yǎng)主要來源于卵黃囊和油球。油球位于卵黃囊前端，其余空間充斥著卵黃，卵黃囊與油球的變化與仔魚生長發(fā)育密切相關(guān)[7]。以往對(duì)于魚類提供營養(yǎng)的器官的研究多集中在消化道、消化腺器官方面，對(duì)卵黃囊的研究多停留在發(fā)育形態(tài)特征觀察水平，其組織學(xué)層面的研究較少。觀察油球與卵黃囊的變化趨勢可知，花鱸對(duì)卵黃囊中卵黃質(zhì)的消耗速度要快于對(duì)油球的消耗速度，這與以前同屬科的鱖（Siniperca chuatsi）[31]、點(diǎn)帶石斑魚（Epinephelus coioides）[32]的研究結(jié)果相同。此時(shí)期仔魚肝臟功能較弱，無法有效利用脂肪，發(fā)育重點(diǎn)在關(guān)系基本生理活動(dòng)的組織結(jié)構(gòu)方面，對(duì)于富含蛋白的卵黃質(zhì)消耗較多，肝臟發(fā)育之后才開始消耗油球。5 dph 仔魚卵黃囊消耗殆盡，已經(jīng)開口攝食，但是相應(yīng)的消化系統(tǒng)功能還未發(fā)育完善，進(jìn)入混合營養(yǎng)期，此階段所需營養(yǎng)一方面來自于油球，一方面來自于所攝食的輪蟲。組織學(xué)觀察結(jié)合仔魚發(fā)育形態(tài)特征觀察的結(jié)果與仔魚培育過程中所表現(xiàn)出來的生理活動(dòng)特性相一致。

3.3 骨骼肌組織結(jié)構(gòu)特征

魚類骨骼肌占魚體質(zhì)量的30%～80%，是反映魚體生長的重要指標(biāo)[33]。骨骼肌的生長發(fā)育直接影響仔稚魚運(yùn)動(dòng)能力。良好的骨骼肌發(fā)育對(duì)攝食、避敵等一些列生理活動(dòng)均有重要意義。骨骼肌的生長依靠肌纖維的增生與肥大來實(shí)現(xiàn)，在硬骨魚類的不同發(fā)育階段其增生與肥大所占的比例也有不同[34]。以往關(guān)于鱖[26]、黑斑小鯛（Pagellus bogaraveo）[35]的研究中表明，仔魚早期主要進(jìn)行肌肉的分層增生，形成特定肌肉層次；后期進(jìn)行馬賽克增生，主要增加肌纖維數(shù)量，促使魚體快速增長[36]。但本試驗(yàn)觀察肌纖維分隔不明顯，無法確定單個(gè)肌纖維所占區(qū)域，并沒有觀察到以上兩個(gè)階段，可能是因?yàn)闃颖颈４孢^久或染色方法欠妥所致?；|7 dph 前肌肉面積增長緩慢，之后增長變快。這種現(xiàn)象與之前關(guān)于鱖[26]、條紋狼鱸（Morone saxatilis）[37]的研究結(jié)果相近。結(jié)合其生理特性與生長發(fā)育規(guī)律，出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能與花鱸優(yōu)先選擇發(fā)育神經(jīng)、消化相關(guān)器官有關(guān)。前期仔魚無法攝食，所有能源均來自于卵黃囊，此間優(yōu)先發(fā)育神經(jīng)、消化相關(guān)器官，可以保障在開口之后能夠順利獲取食物，進(jìn)行下一步發(fā)育。以往也有研究表明，在魚類生長資源受限的階段，會(huì)優(yōu)先選擇體長的增長，肌肉脂肪等在營養(yǎng)充足的條件下通過補(bǔ)償生長機(jī)制更容易獲得補(bǔ)充[38]。本試驗(yàn)從側(cè)面也佐證了這種觀點(diǎn)。

3.4 其他組織結(jié)構(gòu)特征

5 dph 花鱸結(jié)構(gòu)復(fù)雜，仔魚前期的部分器官還未退化消失，仔魚后期的一系列器官組織已經(jīng)開始發(fā)育，是花鱸胚后發(fā)育過程中變化較為劇烈的時(shí)期。在此階段，花鱸由內(nèi)源營養(yǎng)轉(zhuǎn)化為混合型營養(yǎng)，并進(jìn)一步向外源性營養(yǎng)過渡，眼球發(fā)育基本成熟，卵黃囊基本完全消耗，胸鰭基本發(fā)育完成，運(yùn)動(dòng)能力得到了一定發(fā)展，中腎管已經(jīng)出現(xiàn)。

3.5 小結(jié)

本研究對(duì)花鱸仔魚的眼、卵黃囊、肝臟、肌肉、鰭等器官的發(fā)生、發(fā)育過程進(jìn)行了組織學(xué)觀察。花鱸仔魚眼和肌肉的發(fā)生、發(fā)育，以及卵黃囊的消耗等一系列生理變化相輔相成，前期仔魚階段優(yōu)先發(fā)育眼、肝臟、肌肉、鰭等器官，以保障視覺、消化及運(yùn)動(dòng)等基本能力，確保在卵黃囊耗盡之后正常攝食。本研究為了解花鱸仔魚器官發(fā)生、發(fā)育過程提供了理論參考，還需要進(jìn)一步開展免疫組化及相關(guān)基因表達(dá)等研究，以完善花鱸仔魚組織器官發(fā)育過程。