苦杏仁苷減少冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞焦亡并改善載脂蛋白E 缺陷小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成

劉瑾 張潔 馮瑩

武漢市第一醫(yī)院心血管內(nèi)科（武漢 430000）

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是多種心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，在血管壁中可以觀(guān)察到細(xì)胞死亡的數(shù)量增加［1］。細(xì)胞焦亡是一種新發(fā)現(xiàn)的程序性細(xì)胞死亡，與多種心血管疾病有關(guān)，包括AS［2-4］。已知生物草藥提取物通常具有多種成分，可誘導(dǎo)多種生物活性?？嘈尤受眨╝mygdalin，AMY）具有抗炎抗腫瘤和抗AS 等的生物學(xué)和藥理學(xué)活性［5］。有研究［6］發(fā)現(xiàn)，AMY 可減輕AS 并在載脂蛋白E（ApoE）敲除小鼠和骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞中發(fā)揮抗炎作用。此外，既往研究［7］發(fā)現(xiàn)以AMY 為主要成分的補(bǔ)陽(yáng)還五湯甙對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后的細(xì)胞焦亡具有神經(jīng)保護(hù)作用。然而，AMY 是否參與AS 誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡及其發(fā)生機(jī)制尚不明確。因此，本研究構(gòu)建了AS 小鼠模型以及ox-LDL 誘導(dǎo)的人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HCAECs），探討AMY 是否有效緩解AS 進(jìn)展以及可能機(jī)制，為臨床治療AS 提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 10 ～12 周齡載脂蛋白E 缺陷（ApoE-/-）雄性小鼠40 只，購(gòu)自武漢市萬(wàn)千佳興生物科技有限公司，許可證號(hào)SCXK（鄂）2021-0011。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)武漢市第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行。

AMY（長(zhǎng)沙Staherb天然成分有限公司）；HCAECs（美國(guó)ATCC 細(xì)胞庫(kù)）；ox-LDL（美國(guó)Sigma 公司）。OTC 冰凍切片包埋劑（上海睿鉑賽生物科技有限公司）；DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清（美國(guó)Hyclone 公司）；青霉素-鏈霉素、0.25%胰蛋白酶/EDTA 消化液（美國(guó)Sigma 公司）；引物合成由上海生工生物合成；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?3000（美國(guó)Sigma公司）；蛋白裂解液（北京Solarbio 科技有限公司，貨號(hào)：R0010）；Caspase-1（ab207802）、GSDMD（ab209845）、Gal-3（ab209344）、JMJD3（ab169197）和β-actin（ab8227）一抗及相應(yīng)二抗（英國(guó)Abcam公司）；RT-qPCR 試劑盒（Vazyme 生物科技有限公司，貨號(hào)：Q511-02）；CCK-8 試劑盒（美國(guó)MCE 公司，貨號(hào)：HY-K0301）；總膽固醇（TC），甘油三酯（TG），高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C），低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）測(cè)定試劑盒（武漢Elabscience Biotechnology 試劑公司）；高通量實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈鎖反應(yīng)（PCR）儀（Roche 公司，瑞士）；Western blot 系統(tǒng)（北京六一儀器廠(chǎng)DYY-7C）；臺(tái)式低溫高速離心機(jī)（日本KUBOTA 公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海力申科學(xué)儀器公司）；凝膠成像分析儀（廣州瑞豐實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus）。

1.2 研究方法

1.2.1 小鼠AS 模型構(gòu)建及分組 將所有ApoE-/-小鼠維持在受控環(huán)境中，光照/黑暗循環(huán)為12 h，溫度為（20 ± 2）℃，濕度為（50 ± 2）%。適應(yīng)環(huán)境1 周后，將小鼠分為4 組：對(duì)照組（Control）、模型組（Model）、2.5 mg/kg AMY 組、5 mg/kg AMY 組。其中Model、2.5 mg/kg AMY 和5 mg/kg AMY 組小鼠喂食由21%脂肪、19.5%酪蛋白和1.25%膽固醇組成的高脂飲食（HFD）12 周以加速動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，Control 組喂食正常飼料。將水溶性白色粉末形式的AMY溶于0.9%鹽水中，使用直徑為0.22 μm 的特定脫氣過(guò)濾器過(guò)濾AMY 溶液。HFD 喂養(yǎng)12 周后，2.5 mg/kg AMY 和5 mg/kg AMY 組小鼠腹膜內(nèi)注射2.5、5 mg/kg AMY，Model 組注射相同體積的0.9%鹽水，每天1 次連續(xù)4 周。小鼠在二氧化碳窒息處死前12 h 禁食。

1.2.2 小鼠基本生化指標(biāo)的測(cè)定 小鼠禁食過(guò)夜后收集血液樣品。在4 ℃以1 000 ×g離心10 min立即分離血漿，取上清分裝。酶比色法測(cè)定血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）含量。

1.2.3 動(dòng)脈粥樣硬化病變的油紅O染色分析 將小鼠動(dòng)脈冷凍切片用油紅O 溶液（0.5%異丙醇溶液，用3∶2 比例的雙蒸水稀釋?zhuān)┰谑覝叵氯旧? h，并用Image J 軟件定量測(cè)定主動(dòng)脈根部脂質(zhì)沉積和斑塊形成。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將HCAECs置于含10%胎牛血清和1%青鏈霉素（100 U/mL 青霉素、100 U/mL鏈霉素）的DMEM 培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2恒溫箱中培養(yǎng)，每2～3 天更換1 次培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞匯合至80%時(shí)，用胰蛋白酶消化重懸后按照3∶1 的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每24 小時(shí)更換1 次培養(yǎng)基。空白對(duì)照組（Control）：細(xì)胞不做任何處理；ox-LDL：細(xì)胞使用20 μg/mL ox-LDL 處理24 h（其中ox-LDL 制備如下：將人低密度脂蛋白在含有10 μmol/L Cu2SO4的磷酸鹽緩沖鹽水中氧化，并加入過(guò)量的乙二胺四乙酸以停止氧化。ox-LDL 的純度高于97%，濃度為1.0 ～3.9 mg/mL）；50、100 μg/mL AMY：細(xì)胞用20 μg/mL ox-LDL 刺激24 h 后添加50、100 μg/mL AMY 處理繼續(xù)培養(yǎng)24 h；ox-LDL+AMY+pcDNA-3.1/pcDNA-Gal-3 組：細(xì)胞用20 μg/mL ox-LDL 刺激24 h 后轉(zhuǎn)染pcDNA-3.1/ pcDNA-Gal-3 載體，24 h 后添加100 μg/mL AMY。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，裂解細(xì)胞收集蛋白。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 利用Lipofectamine?3000 分別將pcDNA-3.1 和pcDNA-Gal-3 轉(zhuǎn)染進(jìn)HCAECs 中，以pcDNA-3.1 作為對(duì)照，具體步驟參照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?3000 制造商說(shuō)明。

1.2.6 熒光定量-PCR（RT-qPCR）檢測(cè)IL-1β 和IL-18表達(dá)水平 使用TRIZOL 試劑盒提取總RNA，合成cDNA 模板，用SYBR ExScript qPCR 試劑盒在以下條件下進(jìn)行：95 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性15 s，55 ℃退火25 s，在72 ℃延伸15 s，進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。依據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算各mRNA 樣本相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 將各組HCAECs按照每孔1 × 105的密度接種于6 孔板。使用RIPA裂解液提取總蛋白，24 h 后采用BCA 法進(jìn)行蛋白定量。隨后各取30 μL樣品進(jìn)行SDS-PAGE，將蛋白轉(zhuǎn)移至膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入Ⅰ抗，4 ℃孵育過(guò)夜。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗37 ℃孵育45 min，用ECL 液顯影，使用化學(xué)發(fā)光試劑盒在化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)，隨后結(jié)果采用Image-Pro Plus 6 軟件（Media Cybernetics）分析，以待測(cè)蛋白與內(nèi)參照β-actin 的灰度值比值作為蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.8 細(xì)胞存活率檢測(cè) 將HCAECs（1 × 105細(xì)胞/孔）接種到96 孔板中，并與不同濃度的AMY 孵育24 h。將細(xì)胞加入CCK-8 溶液（10 μL/孔）并培養(yǎng)1 h。然后在450 nm 下測(cè)量每個(gè)孔的吸光度以確定細(xì)胞存活率。

1.2.9 TUNEL 檢測(cè)細(xì)胞焦亡 根據(jù)制造商的方案使用TUNEL 測(cè)定試劑盒評(píng)估細(xì)胞死亡，將細(xì)胞用DAPI 染色用于核復(fù)染，并在倒置顯微鏡下觀(guān)察。從每個(gè)樣本的兩個(gè)部分隨機(jī)選擇圖像。

1.2.10 染色質(zhì)免疫沉淀檢測(cè) 將HCAECs（4 ×106個(gè)細(xì)胞/孔）接種到10 cm 培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h，然后使細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)交聯(lián)。將細(xì)胞在裂解物中裂解，用JMJD3 和H3K27me3 抗體進(jìn)行免疫沉淀。用RNA 酶A 和蛋白酶K 處理免疫沉淀的DNA，苯酚-氯仿提取然后乙醇沉淀純化。通過(guò)實(shí)時(shí)PCR 分析純化的DNA 和輸入的基因組DNA。根據(jù)制造商的方案，用標(biāo)準(zhǔn)方法計(jì)算倍數(shù)富集。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示。采用單因素方差分析、Dunnett-t法比較總體和總體中兩樣本均數(shù)之間的差異。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AMY 對(duì)HCAECs 存活率的影響 見(jiàn)圖1A，與Control 組比較，200、400 和800 μg/mL AMY 干預(yù)HCAECs后細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.01）。見(jiàn)圖1B，與Control 組比較，ox-LDL 組HCAECs 存活率降低（P＜0.01），而50 和100 μg/mL AMY 相較于ox-LDL組細(xì)胞存活率升高（P＜0.01）。50 和100 μg/mL AMY 干預(yù)細(xì)胞36、48 h 時(shí)細(xì)胞存活率相較Control組明顯降低（P＜0.01，圖1C）。因此，本研究選擇AMY 濃度為50 和100 μg/mL 做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同濃度AMY 對(duì)HCAECs 存活率的影響Fig.1 Effect of different concentrations of AMY on the survival rate of HCAECs

2.2 AMY 對(duì)ox-LDL 誘導(dǎo)的HCAECs 細(xì)胞焦亡的影響 與Control組相比，ox-LDL 組Caspase-1（圖2A和2B）和GSDMD（圖2A 和2C）蛋白水平增加，IL-1β 和IL-18 mRNA 水平上調(diào)（圖2E-2F），TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞率升高（圖3A 和3B），Gal-3 蛋白表達(dá)增加（圖2A 和2D）（P＜0.01）。與ox-LDL 比較，50 和100 μg/mL AMY 組Caspase-1、GSDMD 和Gal-3 蛋白水平以及TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞率呈劑量依賴(lài)性降低（P＜0.05）。

圖2 AMY 干預(yù)對(duì)ox-LDL 誘導(dǎo)HCAECs 細(xì)胞焦亡的影響Fig.2 Effect of AMY intervention on ox-LDL induced pyroptosis in HCAECs

圖3 AMY 干預(yù)HCAECs 后的TUNEL 染色Fig.3 TUNEL staining after AMY intervention in HCAECs

2.3 苦杏仁苷能夠抑制JMJD3 介導(dǎo)的Gal-3 去甲基化 與IgG 相比，JMJD3 和H3K27me3 在Gal-3上的富集顯著增加（P＜0.01）。與Control 組相比，AMY 組Gal-3 上的JMJD3 富集降低（P＜0.01），H3K27me3富集升高（P＜0.01），見(jiàn)圖4A。與Control組相比，ox-LDL 組JMJD3 蛋白表達(dá)水平明顯增加（P＜0.01）；而50 和100 μg/mL AMY 組HCAECs 細(xì)胞內(nèi)JMJD3 蛋白表達(dá)相較于ox-LDL 組呈劑量依賴(lài)性降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖4C-F，與pcDNA-3.1 比較，pcDNA-JMJD3 組HCAECs 細(xì)胞內(nèi)JMJD3 和Gal-3 mRNA水平以及Gal-3蛋白水平明顯上調(diào)（P＜0.01）；與NC siRNA 相比，JMJD3 siRNA 組JMJD3、Gal-3 mRNA 和蛋白水平顯著降低（P＜0.01）。見(jiàn)圖4B。

圖4 AMY 干預(yù)對(duì)JMJD3 介導(dǎo)Gal-3 表達(dá)的影響Fig.4 Effect of AMY intervention on JMJD3 mediated Gal-3 expression

2.4 Gal-3對(duì)AMY抑制ox-LDL誘導(dǎo)HCAECs細(xì)胞焦亡的影響 與ox-LDL+AMY+pcDNA-3.1 組比較，ox-LDL+AMY+pcDNA-Gal-3 組Gal-3（P＜0.01，圖5A-B）、Caspase-1（P＜0.05，圖5A 和5C）和GSDMD（P＜0.01，圖5A 和5D）蛋白表達(dá)水平升高，IL-1β（P＜0.05，圖5A 和5E）和IL-18（P＜0.01，圖5A 和5F）mRNA 水平上調(diào)，TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞率增加（P＜0.01，圖6A-B）。見(jiàn)圖5、6。

圖5 Gal-3 對(duì)AMY 抑制HCAECs 細(xì)胞焦亡的影響Fig.5 Effect of Gal-3 on AMY inhibition of pyroptosis in HCAECs

圖6 AMY 預(yù)處理HCAECs 后過(guò)表達(dá)Gal-3 的TUNEL 染色Fig.6 TUNEL staining of Gal-3 overexpression after AMY pretreatment of HCAECs

2.5 AMY 治療后動(dòng)脈粥樣硬化小鼠中主動(dòng)脈竇的病理分析及生化指標(biāo)檢測(cè) 與Model 組相比，2.5 mg/kg AMY 和5 mg/kg AMY 組小鼠中主動(dòng)脈中脂質(zhì)沉積減少（圖7A），動(dòng)脈粥樣硬化病變面積百分比［2.5 mg/kg AMY 組病灶面積（8.64 ± 1.01），5 mg/kg AMY 組病灶面積（3.12 ± 0.84）］較Model 組（18.65 ± 1.16）組降低（圖7B，P＜0.01）。與Control組相比，Model 組小鼠血清中TG、TC 和LDL 含量顯著升高（P＜0.01），HDL 濃度降低（P＜0.01）。與Model 組比較2.5 mg/kg AMY 和5 mg/kg AMY 組小鼠血清中TG、TC 和LDL 濃度呈劑量依賴(lài)降低（P＜0.05），HDL 含量呈劑量依賴(lài)降低升高（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 小鼠血清生化指標(biāo)檢測(cè)Tab.1 Serum biochemical parameters of mice ±s，mg/dL

表1 小鼠血清生化指標(biāo)檢測(cè)Tab.1 Serum biochemical parameters of mice ±s，mg/dL

注：與control比較，**P ＜0.01；與Model比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01

組別Control Model 2.5 mg/kg AMY 5 mg/kg AMY F值P值TG 25.1±8.5 191.4±18.9**115.2±16.3#68.3±5.4##27.98＜0.000 1 TC 142.3±18.4 683.8±38.5**411.6±42.0#256.3±35.1##45.65＜0.000 1 HDL 98.4±15.2 26.8±10.5**51.7±8.2#82.7±4.6##9.51＜0.000 1 LDL 16.3±8.5 192.5±21.3**93.0±24.5##57.3±18.4##15.49＜0.000 1

圖7 AMY 治療后小鼠主動(dòng)脈油紅O 染色Fig.7 Oil red O staining of mouse aorta after AMY treatment

2.6 AMY 治療對(duì)小鼠主動(dòng)脈焦亡標(biāo)志物表達(dá)的影響 與Control 組相比，Model 組小鼠主動(dòng)脈組織中Gal-3、JMJD3、Caspase-1和GSDMD 蛋白水平以及IL-1β 和IL-18 mRNA 表達(dá)均顯著升高（P＜0.01）。與Model 組比較，2.5 mg/kg AMY 和5 mg/kg AMY 組小鼠主動(dòng)脈組織中Gal-3、JMJD3、Caspase-1 和GSDMD 蛋白表達(dá)以及IL-1β 和IL-18 mRNA 表達(dá)水平呈劑量依賴(lài)降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖8。

圖8 AMY 治療后檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈組織中焦亡標(biāo)志物表達(dá)Fig.8 Detection of pyroptosis marker expression in mice aortic tissues after AMY treatment

3 討論

在本研究中，首先發(fā)現(xiàn)模型組小鼠主動(dòng)脈組織中細(xì)胞焦亡標(biāo)志蛋白Caspase-1、IL-1β、IL-18 和GSDMD 表達(dá)水平與Control 組相比顯著升高，動(dòng)脈粥樣硬化病變面積百分比增加，提示在A(yíng)S 小鼠中細(xì)胞焦亡是一種主要的細(xì)胞死亡形式。在接下來(lái)的細(xì)胞模型中我們使用ox-LDL 誘導(dǎo)HCAECs 發(fā)生焦亡，結(jié)果顯示Caspase-1、IL-1β、IL-18 和GSDMD表達(dá)水平顯著上調(diào)，TUNEL 陽(yáng)性率增加，而50、100 μg/mL AMY 干預(yù)后HCAECs 內(nèi)Caspase-1、GSDMD 和Gal-3 蛋白水平以及TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞率較ox-LDL 組呈劑量依賴(lài)性降低。隨后，在機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)AMY 干預(yù)能夠抑制JMJD3 介導(dǎo)的Gal-3 啟動(dòng)子H3K27me3 去甲基化，而Gal-3 過(guò)表達(dá)后HCAECs內(nèi)細(xì)胞焦亡標(biāo)志蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率明顯增加。

AS 是一種多因素慢性炎癥性動(dòng)脈疾病，是冠心病、心力衰竭、中風(fēng)等多種心血管疾病的病理基礎(chǔ)［8］。在人AS 病變中可以觀(guān)察到細(xì)胞死亡的數(shù)量增加，特別是在晚期斑塊中。通常，細(xì)胞死亡主要?dú)w因于細(xì)胞凋亡和壞死。然而，還發(fā)現(xiàn)了其他幾種細(xì)胞死亡形式，包括細(xì)胞焦亡［9］。細(xì)胞焦亡是由炎性體介導(dǎo)的炎性細(xì)胞死亡的獨(dú)特形式，并且依賴(lài)于Caspase-1 活化，可將細(xì)胞因子IL-1β 加工成活性形式，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞死亡［10］。GSDMD 是一種中樞效應(yīng)和執(zhí)行蛋白，通過(guò)誘導(dǎo)質(zhì)膜孔的形成發(fā)生細(xì)胞焦亡［11］。有研究［12］發(fā)現(xiàn)，紅景天苷可以減輕ApoE-/-中動(dòng)脈粥樣硬化誘發(fā)的細(xì)胞焦亡，其機(jī)制可能與抑制Caspase-1、IL-1β 和GSDMD 蛋白表達(dá)水平的下調(diào)有關(guān)。據(jù)報(bào)道［13］，細(xì)胞焦亡參與ox-LDL 誘導(dǎo)的HCAECs 死亡，這進(jìn)一步證實(shí)了本研究結(jié)果。

天然藥物成分具有強(qiáng)大的治療潛力，原因主要?dú)w于其安全性、有效性、較少的副作用以及經(jīng)濟(jì)效率［14］。AMY 是一種天然的氰苷，存在于一些可食用植物的種子中，如苦杏仁和桃子。迄今為止，AMY 已被廣泛用于治療哮喘、支氣管炎、肺氣腫、麻風(fēng)病、糖尿病和癌癥等［15-16］。已有研究［17］報(bào)道AMY 可能通過(guò)調(diào)節(jié)ApoE-/-小鼠中的調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Tregs）來(lái)刺激免疫系統(tǒng)并表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)功能。一項(xiàng)研究［6］發(fā)現(xiàn)，AMY 可以通過(guò)MAPKs、AP-1 和NF-κB/p65 信號(hào)通路在A(yíng)poE-/-小鼠和ox-LDL 處理的骨髓源性巨噬細(xì)胞中減輕動(dòng)脈粥樣硬化并發(fā)揮抗炎作用。本研究結(jié)果顯示50、100 μg/mL 的AMY 干預(yù)對(duì)HCAECs 細(xì)胞活性無(wú)明顯影響，而200、400、800 μg/mL AMY 干預(yù)HCAECs 后細(xì)胞存活率明顯降低，說(shuō)明果高濃度的AMY 對(duì)細(xì)胞具有毒性副作用。WANG 等［6］研究證實(shí)濃度為50、100 μg/ mL 的AMY 在50 h 內(nèi)對(duì)骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞沒(méi)有帶來(lái)任何顯著的細(xì)胞毒性。此外，SHE等［7］研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽(yáng)還五湯（主要包括黃芪甲苷、芍藥苷和AMY）通過(guò)抑制腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元的焦亡發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，其潛在作用機(jī)制與NLRP3 對(duì)經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。然而，AMY 是否參與治療AS 誘發(fā)的細(xì)胞焦亡發(fā)病機(jī)制仍需本研究的進(jìn)一步探討。

Gal-3 目前被認(rèn)為是潛在的心血管炎癥生物標(biāo)志物［18］。它是一種29 ～35 kDa 高度保守的β-半乳糖苷結(jié)合凝集素，近幾十年來(lái)在心血管疾病中受到廣泛關(guān)注。Gal-3 已被確定為促炎分子，其功能是驅(qū)動(dòng)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激［19］。此外，Gal-3對(duì)AS 的進(jìn)展有影響，包括內(nèi)皮功能障礙，脂質(zhì)內(nèi)吞作用和血管平滑肌細(xì)胞遷移［20］。MACKINNON等［21］研究發(fā)現(xiàn)抑制Gal-3 可減少ApoE-/-小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成。本研究發(fā)現(xiàn)，與Control 組相比，ox-LDL 組HCAECs 內(nèi)Gal-3 蛋白表達(dá)顯著增加；與ox-LDL 比較，50、100 μg/mL AMY 組HCAECs 內(nèi)Gal-3 蛋白水平呈劑量依賴(lài)性降低。Jumonji 結(jié)構(gòu)域3（JMJD3，KDM6B）是一種組蛋白去甲基化酶，能夠特異性地去甲基化三甲基化H3 賴(lài)氨酸27（H3K27me3），是一種常規(guī)的抑制性組蛋白修飾［22］。Jmjd3 上調(diào)可以使啟動(dòng)子上抑制性H3K27me3 表觀(guān)遺傳標(biāo)記去甲基化，最終導(dǎo)致靶基因表達(dá)增加［23］。一項(xiàng)研究［24］發(fā)現(xiàn)LPS 處理促進(jìn)了JMJD3 表達(dá)，增強(qiáng)了Jmjd3 在人血管內(nèi)皮細(xì)胞中的核積累，參與AS 發(fā)展。此外，JMJD3 能夠使β-MHC 啟動(dòng)子處的H3K27me3 去甲基化，以促進(jìn)其表達(dá)和心臟損傷，表明JMJD3 可能是心肌細(xì)胞中β-MHC 表達(dá)的關(guān)鍵表觀(guān)遺傳調(diào)節(jié)因子，也是心臟損傷的潛在治療靶點(diǎn)27［25］，這與本研究結(jié)果類(lèi)似。

綜上所述，AMY 可有效改善ox-LDL 誘導(dǎo)的HCAECs 細(xì)胞焦亡以及HFD 飼養(yǎng)的ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈脂質(zhì)沉積和斑塊形成，其機(jī)制可能與調(diào)控JMJD3 介導(dǎo)的Gal-3 啟動(dòng)子H3K27me3 去甲基化有關(guān)。然而本研究仍存在一些局限性，首先，本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)僅設(shè)有2.5 和5 mg/kg 兩個(gè)濃度梯度，尚未探索體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中AMY 對(duì)AS 小鼠治療的最佳藥物濃度。其次，研究機(jī)制不夠全面，仍需進(jìn)一步分析其他可能機(jī)制對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。此外，關(guān)于A(yíng)MY 治療ApoE-/-小鼠的AS 指標(biāo)研究過(guò)少，對(duì)AS治療的指導(dǎo)價(jià)值有限，下一步將著重開(kāi)展體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證AMY 對(duì)AS 的防治作用，旨在為AMY 參與AS 進(jìn)展提供新的證據(jù)，并為AS 的治療提供理論基礎(chǔ)。

【Author contributions】LIU Jin designed this study and wrote the manuscript.ZHANG Jie performed the experimental work and provided the majority of statistical analysis as well as provided the figures and tables for the manuscript.FENG Ying collected a large amount of data for the dataset.All authors read and approved the final manuscript.