細(xì)胞自噬在急性呼吸窘迫綜合征中的研究進(jìn)展

黃承軍，徐宇，秘樂，王秀軍，劉振峰，王紅嫚△

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是繼發(fā)于內(nèi)皮-上皮屏障破壞、白細(xì)胞過度跨上皮遷移、促炎細(xì)胞因子過度產(chǎn)生的急性呼吸系統(tǒng)疾病，以毛細(xì)血管通透性過度增加導(dǎo)致雙肺非心源性水腫伴嚴(yán)重低氧血癥為特征［1］。該病總病死率高達(dá)35%～46%，但目前尚無統(tǒng)一且有效的治療措施［2］。因此，深入研究ARDS 的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)對(duì)ARDS 的防治具有重要意義。炎癥反應(yīng)的失控是ARDS 進(jìn)展的關(guān)鍵。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞自噬通過調(diào)節(jié)細(xì)胞功能、介導(dǎo)細(xì)胞因子的表達(dá)釋放對(duì)炎癥進(jìn)程有重要影響［3］。Liu等［4］在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）氣管滴注構(gòu)建的小鼠肺泡巨噬細(xì)胞炎癥模型中，采用間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體抑制細(xì)胞自噬后，發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)減輕。然而，Li等［5］在盲腸結(jié)扎穿孔誘導(dǎo)的膿毒性小鼠急性肺損傷（acute lung injury，ALI）中，予以細(xì)胞外囊泡抑制細(xì)胞自噬后，小鼠肺損傷加重。自噬對(duì)ARDS 炎癥反應(yīng)是促進(jìn)還是抑制作用，可能與ARDS的誘因和各個(gè)病理階段最適自噬程度有關(guān)。本文就細(xì)胞自噬發(fā)生機(jī)制及其在ARDS中的作用進(jìn)行綜述。

1 自噬及其主要機(jī)制

自噬是真核細(xì)胞中老化細(xì)胞器或侵入胞內(nèi)病毒、細(xì)菌等大分子物質(zhì)的唯一降解途徑［6］。因此，自噬為細(xì)胞的生長(zhǎng)肅清了障礙［7］。自噬包括巨自噬、微自噬及伴侶介導(dǎo)的自噬，其中巨自噬最常見，其過程大致可分為自噬誘導(dǎo)、自噬體的組裝和形成、自噬體與溶酶體的融合以及囊內(nèi)產(chǎn)物的降解4個(gè)階段［8］。20 世紀(jì)90 年代隨著調(diào)控自噬相關(guān)基因ATG1-16的發(fā)現(xiàn)［9］，自噬機(jī)制的研究進(jìn)入分子水平。研究發(fā)現(xiàn)自身免疫疾病、癌癥、神經(jīng)退行性病變等均與自噬缺陷或過度自噬密切相關(guān)，尤其對(duì)宿主防御至關(guān)重要，自噬一方面通過自噬小泡對(duì)胞內(nèi)病原體包裹，將其輸送到溶酶體進(jìn)行降解；另一方面可通過介導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)［10］。然而，自噬異常或失控也可使部分功能正常的細(xì)胞器受損或功能蛋白降解，細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡，導(dǎo)致相關(guān)組織器官發(fā)生功能障礙。因此，探討自噬的發(fā)生機(jī)制及其在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用，對(duì)疾病防控具有重要意義。目前，自噬的發(fā)生機(jī)制尚不完全明確，可能與細(xì)胞能量代謝失衡相關(guān)，而參與調(diào)控自噬的細(xì)胞信號(hào)通路錯(cuò)綜復(fù)雜，包括雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）信號(hào)通路；同時(shí)，自噬調(diào)節(jié)還與活性氧（ROS）的氧化作用和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激密切相關(guān)。

1.1 mTOR信號(hào)通路 mTOR是調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬上游信號(hào)通路的交匯點(diǎn)。mTOR包括mTOR1和mTOR2兩個(gè)蛋白信號(hào)復(fù)合體，其中mTOR1參與調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、自噬、凋亡等，mTOR2與細(xì)胞骨架重組相關(guān)［11］。mTOR1的活性受細(xì)胞氨基酸及能量攝入的影響，當(dāng)攝入營養(yǎng)充足時(shí)，mTOR1發(fā)生磷酸化并抑制自噬啟動(dòng)蛋白1（unc-51-like kinase 1，ULK1）的活化；而攝入缺乏時(shí)，mTOR1去磷酸化，解除了對(duì)ULK1的抑制作用；ULK1通過活化beclin1 激活磷酸肌醇3-激酶催化亞基Ⅲ型（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）復(fù)合物，PI3K 將自噬相關(guān)蛋白（autophagy-related protein，Atg）16 復(fù)合物募集到自噬體前體結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)磷脂酰乙醇胺（ptdEth，PE）與微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubuleassociated protein1 light chain 3，LC3）結(jié)合，使LC3 被修飾成為L(zhǎng)C3Ⅱ，并被錨定于脂質(zhì)雙分子層，PE-LC3復(fù)合物通過不斷募集脂質(zhì)使隔離膜延伸，最終形成封閉的雙膜脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的自噬體，在SNARE 跨膜蛋白的介導(dǎo)下，自噬體與溶酶體融合，自噬體內(nèi)容物被多種溶酶體水解酶降解釋放至細(xì)胞質(zhì)中再利用［12］。另外，mTOR1 也可以通過磷酸化AMBRA1（自噬/Beclin1 調(diào)控因子）降低ULK1穩(wěn)定性［13］、磷酸化ATG14及調(diào)節(jié)溶酶體相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄［14］，從而負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬。

1.2 AMPK 信號(hào)通路 AMPK 是真核細(xì)胞重要的能量傳感器，可靈敏感知細(xì)胞內(nèi)腺苷一磷酸（adenosine monohosphate，AMP）/腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）比率變化，當(dāng)能量缺乏、AMP/ATP 比率增加或葡萄糖剝奪時(shí)，AMPK 被激活［15］。活化的AMPK不僅可調(diào)節(jié)能量代謝，而且對(duì)線粒體裂變與融合的平衡、細(xì)胞自噬均有調(diào)節(jié)作用。在敲除AMPK的HeLa 細(xì)胞中自噬水平明顯降低；自噬早期，AMPK 通過促進(jìn)ULK1和beclin發(fā)生磷酸化抑制mTOR信號(hào)通路，從而促進(jìn)自噬；另外，在葡萄糖剝奪條件下，AMPK與線粒體融合因子之間結(jié)合力減弱，胞質(zhì)內(nèi)大量活化的AMPK 呈游離狀，促使AMPK與線粒體裂變因子結(jié)合并使其發(fā)生磷酸化，從而調(diào)節(jié)線粒體裂變?nèi)诤掀胶夂途€粒體自噬［16］。Guo等［17］研究發(fā)現(xiàn)，煙堿通過靶向GPR109A 基因，激活A(yù)MPK 信號(hào)通路，從而促進(jìn)細(xì)胞自噬和核因子-E2 相關(guān)因子2（nuclearfactor erythroidderived 2-like 2，Nrf2）核輸入，最終起到防治乳腺炎、修復(fù)血乳屏障的作用。

1.3 ROS 與自噬 ROS 是一種高活性的小分子物質(zhì)，對(duì)DNA、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)均有氧化作用，ROS 可通過氧化相關(guān)蛋白，在自噬的激活中發(fā)揮重要作用。Fang 等［18］研究發(fā)現(xiàn)，三氧化二砷可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生ROS，而ROS 的氧化作用可抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路中AKT和mTOR的磷酸化，從而負(fù)向調(diào)節(jié)該通路，激活細(xì)胞自噬，最終對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)揮保護(hù)性作用。另有研究報(bào)道，自噬可通過促進(jìn)細(xì)胞抗氧化反應(yīng)、減少線粒體的產(chǎn)生，從而抑制ROS的生成［19］。因此，ROS與自噬可相互影響，ROS 可促進(jìn)自噬，而自噬可減少ROS 的產(chǎn)生。

1.4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)折疊、組裝為成熟蛋白的場(chǎng)所。當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)或細(xì)胞內(nèi)環(huán)境改變時(shí)，機(jī)體對(duì)功能成熟蛋白的需求增加，此時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白修飾功能相對(duì)不足，導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊蛋白或未折疊蛋白的累積；當(dāng)細(xì)胞受到的刺激過強(qiáng)或呈持續(xù)狀態(tài)，可造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷，受損內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被自噬囊泡吞噬降解，自噬是恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)最后的手段［20］。Wang 等［21］在顆粒物誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中，給予內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-苯基丁酸干預(yù)后，細(xì)胞自噬水平降低，細(xì)胞凋亡數(shù)量減少。Zhang 等［22］研究發(fā)現(xiàn)，香菇多糖可通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進(jìn)細(xì)胞自噬，從而抑制結(jié)腸癌增殖。

2 細(xì)胞自噬與ARDS

2.1 肺泡巨噬細(xì)胞（alveolar macrophages，AM）自噬與ARDS AM約占肺泡腔常駐細(xì)胞的80%，是肺泡腔最豐富的免疫細(xì)胞［23］。AM 具有高度可塑性，可誘導(dǎo)分化為促炎性質(zhì)的M1型和抗炎性質(zhì)的M2型細(xì)胞，AM主要通過吞噬病原體、釋放細(xì)胞因子直接調(diào)控炎癥反應(yīng)或調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞功能，影響ARDS 炎癥進(jìn)程。近年研究發(fā)現(xiàn)，AM 自噬可調(diào)節(jié)細(xì)胞極化、抗原呈遞和吞噬功能。Liu等［24］研究發(fā)現(xiàn)，老年小鼠來源的巨噬細(xì)胞自噬水平低于年輕小鼠，在LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化的實(shí)驗(yàn)中，加入3-甲基腺嘌呤（3-MA）抑制自噬后，M1型極化更為明顯，炎癥反應(yīng)加劇?；罨木奘杉?xì)胞高表達(dá)組織相容性復(fù)合物（MHCⅠ、MHCⅡ）抗原呈遞分子，巨噬細(xì)胞加工后的抗原肽段可與抗原呈遞分子結(jié)合形成復(fù)合物，再將抗原呈遞給CD4+或CD8+T細(xì)胞［25］，激活產(chǎn)生效應(yīng)T細(xì)胞，介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)。Ligeon 等［26］研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞自噬通過維持吞噬體的LC3修飾，促進(jìn)MHCⅡ類分子的抗原加工呈遞功能。LC3 與自噬體結(jié)合后可形成一種更易與溶酶體融合的復(fù)合物，稱為L(zhǎng)C3 相關(guān)吞噬體（LC3-associated phagocytosis，LAP）。Gluschko 等［27］研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞通過LAP靶向單核細(xì)胞增生李斯特菌，增強(qiáng)小鼠免疫力和巨噬細(xì)胞的抗李斯特菌活性。另外，Xu等［28］研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞自噬通過激活NLRP3 炎性小體，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能，促進(jìn)病原體的清除。以上研究提示巨噬細(xì)胞自噬可減輕ARDS炎癥反應(yīng)，適當(dāng)?shù)卮龠M(jìn)巨噬細(xì)胞自噬可能成為減輕ARDS 的有效方法。

2.2 中性粒細(xì)胞自噬與ARDS 中性粒細(xì)胞是促進(jìn)炎癥反應(yīng)和病原體清除的主要免疫細(xì)胞之一，活化的中性粒細(xì)胞通過吞噬、脫顆粒和中性粒細(xì)胞外網(wǎng)陷阱（neutrophil extracellular traps，NETs）的形成發(fā)揮促炎和抗菌作用，而自噬對(duì)中性粒細(xì)胞的產(chǎn)生及其功能的發(fā)揮均有重要調(diào)節(jié)作用［9］。首先，自噬促進(jìn)造血干細(xì)胞中損傷和老化線粒體的清除，降低干細(xì)胞中ROS 的累積，維持干細(xì)胞正常代謝而使其能夠分化為成熟的中性粒細(xì)胞［29］。Jung 等［30］通過ATG5 基因敲除構(gòu)建自噬缺陷小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠骨髓造血干細(xì)胞中線粒體過度累積，細(xì)胞出現(xiàn)功能障礙，外周血有核細(xì)胞數(shù)量明顯減少。另外，中性粒細(xì)胞對(duì)病原體的殺傷依賴于細(xì)胞吞噬作用和ROS 的產(chǎn)生釋放，而自噬與吞噬功能密切相關(guān)，膜識(shí)別受體在抗原刺激下被激活，誘導(dǎo)選擇性自噬的發(fā)生，自噬蛋白LC3與單模的吞噬體結(jié)合促進(jìn)吞噬溶酶體形成和成熟，吞噬功能明顯增強(qiáng)，同時(shí)自噬有助于病原體碎片的消除［31］。研究還發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞ATG5基因沉默后，細(xì)胞對(duì)金黃色葡萄球菌的吞噬能力明顯降低［32］。脫顆粒是指活化的中性粒細(xì)胞釋放含有大量炎性蛋白和堿性磷酸酶的顆粒至細(xì)胞質(zhì)，該顆粒物質(zhì)具有病原體殺傷作用［33］。Bhattacharya等［34］研究發(fā)現(xiàn)，抑制自噬后中性粒細(xì)胞脫顆粒減少，而自噬基因敲除小鼠中，由中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)減弱。當(dāng)中性粒細(xì)胞受到一定強(qiáng)度刺激后，細(xì)胞內(nèi)膜失去完整性，核膜崩解，釋放出細(xì)胞組蛋白和DNA 形成NETs，該纖維網(wǎng)絡(luò)上密集分布著高活性的中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶和過氧化物酶等，具有捕獲并殺滅病原體的作用［33］，而自噬有助于該纖維網(wǎng)的形成。Guo等［35］使用海藻糖誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞發(fā)生自噬后，NETs 形成增加；相反，用3-甲基腺嘌呤抑制自噬后不能有效形成NETs。以上研究提示中性粒細(xì)胞自噬可促進(jìn)中性粒細(xì)胞成熟，促進(jìn)病原體的清除，對(duì)ARDS有保護(hù)性作用。

2.3 上皮細(xì)胞自噬與ARDS 上皮細(xì)胞是肺暴露于外界的主要細(xì)胞，是保護(hù)肺組織免受環(huán)境侵害的機(jī)械屏障［36］。機(jī)械通氣是當(dāng)前治療ARDS 的主要措施，長(zhǎng)時(shí)間的呼吸機(jī)治療會(huì)造成上皮細(xì)胞的應(yīng)激性損傷，導(dǎo)致并發(fā)癥發(fā)生率及病死率增加［37］。Tsai等［38］研究發(fā)現(xiàn)，在過氧化氫誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中，補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD46可增強(qiáng)細(xì)胞自噬，從而減輕炎癥反應(yīng)并減少細(xì)胞凋亡；而給予3-甲基腺嘌呤抑制自噬后，氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，白細(xì)胞介素前體（pro-IL-6、pro-IL-1β）和NLRP3 炎性小體表達(dá)水平升高，細(xì)胞凋亡數(shù)量增多，提示上皮細(xì)胞自噬可抑制氧化應(yīng)激介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。LPS可誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞mTOR 蛋白磷酸化，抑制細(xì)胞自噬，造成細(xì)胞炎性損傷；給予自噬抑制劑干預(yù)后促炎因子表達(dá)水平升高，細(xì)胞損傷加?。?9］。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)小鼠氣道上皮細(xì)胞和人支氣管上皮細(xì)胞暴露于顆粒物后，細(xì)胞自噬能力增強(qiáng)；敲低mTOR 基因促進(jìn)細(xì)胞自噬后，炎癥反應(yīng)加重［40］。Tan 等［41］通過抑制LPS 誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞A549 過度自噬后，細(xì)胞活力增加，細(xì)胞凋亡數(shù)量減少，白細(xì)胞介素和腫瘤壞死因子等促炎因子表達(dá)水平降低。以上研究提示上皮細(xì)胞自噬在ARDS進(jìn)程中具有雙重作用，可以減輕或加重肺損傷，該結(jié)果取決于誘導(dǎo)因素及自噬程度。

2.4 血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬與ARDS 血管內(nèi)皮細(xì)胞是血液與下層組織之間的一道屏障，控制血液與組織液之間的物質(zhì)交換。相鄰內(nèi)皮細(xì)胞間的鈣黏蛋白是內(nèi)皮屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，鈣黏蛋白減少可使肺組織蛋白液集聚或多種炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)致ARDS 的發(fā)生［42］。Slavin 等［43］在LPS 誘導(dǎo)的ARDS 小鼠模型中加入3-甲基腺嘌呤抑制自噬后，肺組織中性粒細(xì)胞滲出減少，肺血管損傷減輕；在凝血酶誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障障礙模型中加入自噬抑制劑后發(fā)現(xiàn)，鈣黏蛋白的降解被抑制，應(yīng)力纖維的形成減少，有效恢復(fù)了內(nèi)皮屏障功能，提示自噬可促進(jìn)鈣黏蛋白的降解，加重肺損傷。然而，Reglero-Real等［44-45］研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬可調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附分子的表達(dá)及降解，以降低血管通透性，有效防止中性粒細(xì)胞的過度跨上皮遷移。此外，內(nèi)皮細(xì)胞自噬可通過抑制ROS的產(chǎn)生降低血管的通透性，從而維持內(nèi)皮屏障的完整［46］。Kong等［47］研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞自噬可激活A(yù)MPK 信號(hào)通路，促進(jìn)受損線粒體的降解及重新合成，維持內(nèi)皮細(xì)胞自身正常的能量代謝，進(jìn)而減輕LPS對(duì)內(nèi)皮黏附連接功能的損害。以上研究提示內(nèi)皮細(xì)胞自噬通過調(diào)節(jié)血管通透性對(duì)ARDS炎癥進(jìn)程有重要影響，但其是發(fā)揮保護(hù)性作用還是損傷性作用，需進(jìn)一步研究論證。

3 小結(jié)與展望

自噬是應(yīng)激狀態(tài)下維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的主要適應(yīng)性反應(yīng)，作為固有免疫的重要組成，在炎癥調(diào)節(jié)及免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。自噬可通過調(diào)節(jié)相應(yīng)細(xì)胞功能促進(jìn)病原體的清除，同時(shí)也可通過抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生而減輕ARDS；相反，過度自噬會(huì)使細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡，加劇ARDS。因此，維持適度的細(xì)胞自噬有助于減輕炎癥反應(yīng)。目前已開發(fā)的自噬調(diào)節(jié)劑包括PI3K抑制劑、mTOR抑制劑、氯喹與羥氯喹等，其中PI3K 抑制劑3-甲基腺嘌呤、氯喹等在抗腫瘤方面的應(yīng)用已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段［48］，但是其在ARDS炎癥性疾病方面作用的研究仍處于動(dòng)物或細(xì)胞實(shí)驗(yàn)階段。未來有待深入研究細(xì)胞自噬機(jī)制以及自噬對(duì)炎癥的調(diào)節(jié)作用，為ARDS 的防治提供新思路。