銀杏葉渣中多糖和黃酮的綜合提取及其抗氧化活性研究

王敬赫，胡慶豐，劉 婕，程耀波，嚴(yán)雪溶，王 健，惠愛(ài)玲，張文成

（1.合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230601；2.邳州恒翔生物制品有限公司，江蘇 邳州 221332）

銀杏葉中含有黃酮、多糖、內(nèi)酯、有機(jī)酸等多種活性物質(zhì)，以銀杏葉提取物（GBE）為主要成分的銀杏葉片、“金納多”注射液、“悅康通”注射液等廣泛用于心腦血管疾病的臨床治療[1-2]。GBE 制備過(guò)程中產(chǎn)生大量銀杏葉渣，約占銀杏葉原料的60%～70%。目前，大多數(shù)銀杏葉渣或丟棄，或焚燒，或烘干曬干、粉碎處理作為飼料、肥料（或添加劑）低價(jià)出售[3]，這在一定程度上造成環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。

銀杏葉渣除含有粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、葉綠素等物質(zhì)外，也殘存多糖、黃酮、內(nèi)酯等活性成分。對(duì)于銀杏葉渣的二次利用，多以微生物菌種發(fā)酵提高其蛋白質(zhì)、纖維素等利用率，其發(fā)酵產(chǎn)物可作為蛋白質(zhì)飼料或微生物菌劑[4-5]。高樹峰等[6]以地衣芽孢桿菌-納豆芽孢桿菌或產(chǎn)朊假絲酵母-黑曲霉為菌種對(duì)銀杏葉渣進(jìn)行雙菌株混合發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物在肉仔雞上具有較好的抗氧化作用。ZHOU 等[7]以銀杏葉渣為底物，利用熱帶假絲酵母和米曲霉進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵后基質(zhì)中銀杏酸含量由14.8 mg∕g 降至1.5 mg∕g。此外，也有采用溶劑提取法從廢棄葉渣中獲取活性成分的報(bào)道，如邵金華等[3]通過(guò)超聲波-微波輔助法獲得提取率為5.07%的銀杏多糖；唐仕榮等[8]以純水回流提取銀杏葉渣中多糖，濃縮去蛋白質(zhì)后，銀杏葉渣多糖純度可達(dá)51.42%；高坤等[9]用銀杏葉下腳料制備葉綠素銅鈉鹽；吳巧攀等[10]采用水提醇沉法從銀杏葉渣提取多糖；李明飛[11]采用有機(jī)溶劑提取法從銀杏葉渣獲取抗氧化物質(zhì)；閆精楊等[12]以水煎煮后的銀杏葉廢渣為原料，分別以石油醚、95%乙醇得到聚戊烯醇和總黃酮提取物；簡(jiǎn)悅[13]采用高速勻質(zhì)-超聲輔助提取法從銀杏葉渣中提取雙黃酮。以上研究針對(duì)銀杏葉渣中活性物質(zhì)提取和利用進(jìn)行了探索，有利于實(shí)現(xiàn)活性物質(zhì)利用，可在一定程度避免資源浪費(fèi)，但仍存在活性物質(zhì)提取效率不佳、利用率以及經(jīng)濟(jì)效益低等問(wèn)題。

銀杏多糖、黃酮均具有抗氧化等活性[14-16]，可作為功能性食品以及醫(yī)藥用品原料，常規(guī)提取得到的銀杏黃酮仍多以黃酮糖苷形式存在[17]，其生物利用率低，在動(dòng)物體內(nèi)的吸收遠(yuǎn)不及槲皮素、山奈酚、異鼠李素等游離苷元[18]。且有研究表明，游離苷元的抗氧化活性高于黃酮糖苷[19]，當(dāng)前多采用生物酶將糖苷轉(zhuǎn)化為苷元的方法實(shí)現(xiàn)苷元含量的提升與利用[20]。結(jié)合生物酶轉(zhuǎn)化的方法開(kāi)發(fā)一種綜合提取銀杏葉渣中多糖、黃酮活性成分的工藝，尤其是獲得富含游離苷元的高效價(jià)黃酮提取工藝，可以提升銀杏葉渣的利用率，改善當(dāng)前存在的環(huán)境和資源問(wèn)題。為此，采用復(fù)合酶輔助醇水溶劑提取法提取銀杏葉渣多糖和總黃酮，并研究其抗氧化活性，旨在為銀杏葉廢棄物的進(jìn)一步高效利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

銀杏葉渣來(lái)自邳州恒翔生物制品有限公司，為銀杏葉提取內(nèi)酯和黃酮后的殘?jiān)?，?jīng)干燥，適當(dāng)粉碎至約5 mm大小，備用。

1.2 試驗(yàn)試劑

蘆丁、水仙苷、槲皮素、山奈酚、異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司）；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（國(guó)藥化學(xué)試劑公司）；95 %乙醇（江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)公司）；無(wú)水乙醇（國(guó)藥化學(xué)試劑公司）；5%NaNO2（國(guó)藥化學(xué)試劑公司）；10%NaOH（國(guó)藥化學(xué)試劑公司）；10% Al（NO3）3（國(guó)藥化學(xué)試劑公司）；硫酸（國(guó)藥化學(xué)試劑公司）；果膠酶（國(guó)藥化學(xué)試劑公司）；纖維素酶（上海源葉生物科技有限公司）；β-葡萄糖苷酶（上海源葉生物科技有限公司）；一水合檸檬酸（國(guó)藥化學(xué)試劑公司）；十二水合磷酸氫二鈉（國(guó)藥化學(xué)試劑公司）；抗壞血酸（國(guó)藥化學(xué)試劑公司）；DPPH（國(guó)藥化學(xué)試劑公司）；ABTS 二銨鹽（國(guó)藥化學(xué)試劑公司）；過(guò)二硫酸鉀（國(guó)藥化學(xué)試劑公司）；七水合硫酸亞鐵（國(guó)藥化學(xué)試劑公司）；水楊酸（國(guó)藥化學(xué)試劑公司）；30%過(guò)氧化氫（國(guó)藥化學(xué)試劑公司）。

1.3 試驗(yàn)儀器

F-020SD 型超聲清洗機(jī)（福洋科技集團(tuán)有限公司）；SHZ-DⅢ型循環(huán)水真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；W205B 型數(shù)控恒溫水浴鍋（申勝生物技術(shù)有限公司）；UV-1800PC 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（翱義儀器有限公司）；TDZ5-WS 型低速離心機(jī)（湘儀儀器有限公司）；1260 型高效液相色譜儀（Agilent Technologies）；Eclipse Plus C18（Agilent Technologies）；PHS-3C 型pH 計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 銀杏葉渣多糖提取 以純水為溶劑、85°C左右加熱3 h[18，21-22]，對(duì)葉渣與水的不同料液比（1∶7、1∶8、1∶9、1∶10）進(jìn)行優(yōu)化探究。待提取結(jié)束，趁熱抽濾得到殘?jiān)ù乱徊教崛°y杏葉渣總黃酮或黃酮苷元）和水提液。水提液減壓濃縮至1∕3，加95%乙醇，調(diào)整乙醇含量至75%，過(guò)夜醇沉；收集不溶物，冷凍干燥，即得粗多糖，稱質(zhì)量，計(jì)算粗多糖得率；以葡萄糖作為對(duì)照，采用苯酚-硫酸法測(cè)多糖含量，并計(jì)算粗多糖提取率。

1.4.2 銀杏葉渣總黃酮提取

1.4.2.1 醇水溶劑法提取總黃酮 醇水熱提法是獲取銀杏總黃酮的通用方法，普遍認(rèn)為乙醇含量對(duì)總黃酮提取效果至關(guān)重要。參考有關(guān)研究[23]，將料液比設(shè)為1∶8，于80 ℃加熱提取4 h，研究不同乙醇含量（50%、60%、70%、80%、90%）對(duì)葉渣中總黃酮得率的影響。提取結(jié)束，趁熱過(guò)濾葉渣得醇水粗提液，將粗提液減壓濃縮、冷凍干燥得到總黃酮，稱質(zhì)量，計(jì)算得率；以蘆丁為對(duì)照，Al（NO3）3顯色法測(cè)總黃酮含量，高效液相色譜法（HPLC）測(cè)槲皮素、山奈酚及異鼠李素3 種游離黃酮苷元含量，并以此計(jì)算銀杏葉渣總黃酮和游離苷元的提取率。

1.4.2.2 酶輔助醇水溶劑法提取總黃酮 酶輔助溶劑提取法是獲取黃酮苷元的常用方法[21，24]。以上述醇水熱提法確立的較優(yōu)乙醇含量為參照，分別采用單一β-葡萄糖苷酶及復(fù)合酶（β-葡萄糖苷酶、纖維素酶、果膠酶）輔助醇水熱浸提法獲取銀杏總黃酮，以HPLC 法檢測(cè)的游離黃酮苷元含量為考查指標(biāo)，確立酶輔助醇水提取的較優(yōu)條件。

單一酶：將β-葡萄糖苷酶（0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 g）溶于50.0 mL 檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液（pH 值為5），加入10 g銀杏葉渣中并于50 ℃酶法提取2.5 h；高溫滅酶，將酶解液減壓濃縮并調(diào)整醇含量至80%，料液比1∶8，于80 ℃加熱提取4 h，減壓濃縮至干，檢測(cè)黃酮苷元含量。

復(fù)合酶：將β-葡萄糖苷酶、纖維素酶、果膠酶2種或3 種酶組合，溶于50.0 mL 檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液（pH 值為5），其余操作與單一酶提取銀杏葉渣總黃酮方法相同。

1.4.3 銀杏多糖含量測(cè)定 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：配制0.8 mg∕mL 葡萄糖母液，取0.2、0.5、1.0、1.5、2.5 mL母液分別置于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度；取上述稀釋液1.0 mL 置于比色管中，加5%重蒸苯酚溶液1.0 mL，搖勻后迅速加入濃硫酸5.0 mL，加水定容至25.0 mL，靜置30 min，于490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，吸光度Y為縱坐標(biāo)，建立線性回歸方程。

樣品測(cè)定：取5 mg 粗多糖樣品，加水定容至25.0 mL；取樣品稀釋液1.0 mL 置于比色管，其余操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。以測(cè)得的吸光度計(jì)算多糖質(zhì)量濃度，并折算葉渣中多糖提取率。

1.4.4 銀杏葉渣總黃酮及其苷元含量測(cè)定

1.4.4.1 銀杏葉渣總黃酮含量測(cè)定 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：配制2 mg∕mL 蘆丁母液，取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL 分別置于10.0 mL 比色管中，補(bǔ)加95%乙醇至10.0 mL；取2.0 mL樣品溶液，隨后加入5%NaNO2水溶液0.3 mL，搖勻靜置6 min，再加10% Al（NO3）3水溶液0.3 mL，搖勻靜置6 min，最后加10% NaOH水溶液3.0 mL，搖勻靜置15 min，于510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，吸光度Y為縱坐標(biāo)，建立線性回歸方程。

樣品測(cè)定：取20 mg粗黃酮樣品，加95%乙醇定容至10.0 mL；取2.0 mL 樣品溶液，其后NaNO2、Al（NO3）3、NaOH 等加入量與操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。以測(cè)得的吸光度數(shù)值計(jì)算蘆丁質(zhì)量濃度，并折算葉渣中總黃酮提取率。

1.4.4.2 游離黃酮苷元含量測(cè)定 色譜條件：Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫35 ℃；甲醇（A）-0.4%磷酸水（B）二元流動(dòng)相（0～15 min，35%～40% A；15～30 min，40%～45% A；45～70 min，50%～55%A），0.7 mL∕min；檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm。

取蘆丁、水仙苷、槲皮素、山奈酚、異鼠李素對(duì)照品少許，混標(biāo)20μL 注入HPLC 檢測(cè)；在上述色譜條件下，銀杏黃酮提取物中主要的黃酮苷（蘆丁、水仙苷）及其典型的3種苷元（槲皮素、山奈酚、異鼠李素）基線分離或完全分離。

槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：首先配制80μg∕mL 槲皮素儲(chǔ)備液，精密取儲(chǔ)備液0.25、1.0、3.0、6.0、10.0 mL，補(bǔ)加70%甲醇定容至10.0 mL；過(guò)濾后取20μL注入HPLC，按上述色譜條件進(jìn)行檢測(cè)。以峰面積A為縱坐標(biāo)，槲皮素質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，建立線性回歸方程。

樣品測(cè)定：取銀杏葉渣黃酮粗提物樣品0.8 mg，加70%甲醇稀釋到10.0 mL；取20μL注入HPLC，從色譜圖上得出槲皮素、山奈酚和異鼠李素的峰面積，依據(jù)槲皮素校正因子法[25]折算銀杏葉渣中黃酮苷元（以槲皮素、山奈素、異鼠李素三者含量之和）提取率。

1.4.5 銀杏多糖、總黃酮抗氧化活性測(cè)定

1.4.5.1 DPPH 自由基清除能力測(cè)定 參考張康逸等[26]的方法，精密移取0.018 mmol∕L DPPH-乙醇溶液2.0 mL，分別加入至含1.0 mL 不同梯度質(zhì)量濃度的抗壞血酸、多糖以及總黃酮樣品溶液的比色管中，避光反應(yīng)30 min，作為試驗(yàn)組；另精密移取無(wú)水乙醇2.0 mL，分別加入至含有1.0 mL 不同梯度質(zhì)量濃度的抗壞血酸、多糖以及總黃酮樣品溶液的比色管中，作為對(duì)照組；精密移取0.018 mmol∕L DPPH-乙醇溶液2.0 mL，加入至含1.0 mL 對(duì)應(yīng)樣品溶液的溶劑的比色管中，作為空白組。各組均在517 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，每組進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。

DPPH自由基清除率=[1-（A1-A0）∕A]×100%

其中，A1為試驗(yàn)組的吸光度，A0為對(duì)照組的吸光度，A為空白組的吸光度。

1.4.5.2 ABTS+自由基清除能力測(cè)定 參考程鵬等[27]的方法，將7 mmol∕L ABTS 二銨鹽與140 mmol∕L的過(guò)硫酸鉀溶液按比例混合，室溫下避光反應(yīng)12 h，用無(wú)水乙醇稀釋30～50 倍，保證所配ABTS 工作液在734 nm波長(zhǎng)下吸光度范圍在0.68～0.72。

精密移取1.0 mL 不同梯度質(zhì)量濃度的抗壞血酸、多糖以及總黃酮樣品溶液至比色管中，分別加入ABTS 工作液3.0 mL，混合均勻，避光反應(yīng)6 min，作為試驗(yàn)組；精密移取1.0 mL 不同梯度質(zhì)量濃度的抗壞血酸、多糖以及總黃酮樣品溶液至比色管中，加無(wú)水乙醇3.0 mL，混合均勻，作為對(duì)照組；精密移取1.0 mL 對(duì)應(yīng)樣品溶液的溶劑至比色管中，分別加入ABTS 工作液3.0 mL，混合均勻，作為空白組。各組均在734 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，每組進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)。

ABTS+自由基清除率=[1-（A1-A0）∕A]×100%

其中，A1為試驗(yàn)組的吸光度，A0為對(duì)照組的吸光度，A為空白組的吸光度。

1.4.5.3 羥自由基清除能力測(cè)定 參考趙叢叢等[28]的方法，在比色管中依次加入9 mmol 硫酸亞鐵溶液、9 mmol 水楊酸-乙醇溶液各1.0 mL，精密移取1.0 mL 不同梯度質(zhì)量濃度的抗壞血酸、多糖以及總黃酮樣品溶液至比色管，試驗(yàn)組加入8.8 mmol 過(guò)氧化氫1.0 mL，對(duì)照組加入蒸餾水1.0 mL 代替過(guò)氧化氫，分別用蒸餾水補(bǔ)足至15.0 mL；在比色管中依次加入9 mmol 硫酸亞鐵溶液、9 mmol 水楊酸-乙醇溶液各1.0 mL，加入8.8 mmol過(guò)氧化氫1.0 mL，蒸餾水補(bǔ)至15.0 mL，作為空白組。各組均在510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，每組進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。

羥自自由基清除率=[1-（A1-A0）∕A]×100%

其中，A1為試驗(yàn)組的吸光度，A0為對(duì)照組的吸光度，A為空白組的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀杏多糖、總黃酮及其苷元含量分析

依據(jù)1.4.2、1.4.3 和1.4.4 所述檢測(cè)方法及處理?xiàng)l件，多糖、總黃酮及黃酮苷元含量測(cè)定的線性回歸方程如表1所示，粗多糖、總黃酮和黃酮苷元含量測(cè)定方法在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好（R2≥0.992），證明本研究中測(cè)定粗多糖、總黃酮和黃酮苷元含量的方法可靠。

表1 銀杏多糖、總黃酮及苷元含量測(cè)定的線性回歸方程Tab.1 Linear regression equation for the content determination of ginkgo polysaccharide，total flavonoids and aglycones

2.2 銀杏葉渣中多糖的提取

對(duì)于銀杏葉渣中多糖提取，借鑒銀杏葉多糖提取的較優(yōu)工藝進(jìn)行微調(diào)，即以純水為溶劑，85 ℃提取3 h，僅就料液比對(duì)多糖得率、提取率的影響進(jìn)行考察，結(jié)果列于圖1 中。由圖1 可知，隨著料液比由1∶7逐漸增至1∶9，多糖得率和提取率呈現(xiàn)逐步上升趨勢(shì)。當(dāng)料液比1∶9 時(shí)，其多糖得率和提取率分別達(dá)到17.90%和3.03%，相比料液比1∶7 時(shí)分別增加26.1%和73.1%；若繼續(xù)增大提取水量至料液比1∶10時(shí)，則粗多糖得率下降至14.0%，這時(shí)多糖提取率也有小幅度降低。因此，將銀杏葉渣與純水料液比控制在1∶9，在85 ℃加熱提取3 h，其銀杏葉渣中多糖提取率可達(dá)3.03%。

圖1 料液比對(duì)銀杏葉渣中粗多糖提取效果的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on extraction effect of crude polysaccharide from Ginkgo biloba residue

2.3 銀杏葉渣中總黃酮和黃酮苷元的提取

2.3.1 銀杏葉渣中總黃酮的提取 不同含量乙醇對(duì)銀杏葉渣中總黃酮提取效果的影響列于圖2 中。由圖2 可知，當(dāng)乙醇含量在50%～80%依次增加時(shí)，其總黃酮得率隨之升高，相應(yīng)的提取率也增加。若繼續(xù)增大乙醇含量至90%，此時(shí)總黃酮得率較乙醇含量為80%時(shí)下降，而提取率也隨之降低。結(jié)果表明，當(dāng)銀杏葉渣與80%乙醇在料液比1∶8、80 ℃加熱提取4 h，其銀杏葉渣總黃酮提取率達(dá)最大為0.25‰。

圖2 乙醇含量對(duì)銀杏葉渣中總黃酮提取效果的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction ecfect of total flavonoids from Ginkgo biloba residue

2.3.2 銀杏葉渣中黃酮苷元的提取 上述80%乙醇熱提法所得的銀杏總黃酮提取物，仍含有較多以蘆丁、水仙苷為代表的黃酮苷（圖3），經(jīng)復(fù)合酶輔助提取后，黃酮苷元含量增加（圖4），以槲皮素、山奈酚、異鼠李素3 類苷元之和計(jì)算的苷元提取率為0.46‰（表2）。

圖3 HPLC法測(cè)定溶劑提取法所得銀杏葉渣中總黃酮Fig.3 Determination of total flavonoids in Ginkgo biloba residue obtained by solvent extraction method by HPLC

圖4 HPLC法測(cè)定酶輔助溶劑提取法所得銀杏葉渣中總黃酮Fig.4 Determination of total flavonoids from Ginkgo biloba residue obtained by enzyme-assisted solvent extraction by HPLC

表2 不同提取方法的總黃酮及其黃酮苷元含量Tab.2 Contents of total flavonoids and flavonoid aglycones obtained by different extraction methods

當(dāng)加入1.0%～3.0%β-葡萄糖苷酶時(shí)，其黃酮苷元含量?jī)H有少量增加（表2）；當(dāng)以β-葡萄糖苷酶中復(fù)配纖維素酶，其對(duì)苷元增幅甚微。因此，考慮將果膠酶、纖維素酶與β-葡萄糖苷酶三者復(fù)配使用，隨著果膠酶的加入，苷元提取率有相對(duì)明顯的增長(zhǎng)，當(dāng)三者以8.0%添加時(shí)，其總苷元提取率達(dá)到0.93‰（表2），這一結(jié)果相較溶劑提取法提高102.2%，與此同時(shí)，銀杏葉渣總黃酮含量也提高近1.3倍。

2.4 多糖、總黃酮抗氧化活性測(cè)定

2.4.1 DPPH 自由基清除能力測(cè)定結(jié)果 圖5 為銀杏葉渣多糖、總黃酮對(duì)DPPH 自由基清除結(jié)果，銀杏葉渣多糖、溶劑提取法所得銀杏葉渣總黃酮以及復(fù)合酶輔助醇水溶劑提取法所得銀杏葉渣總黃酮對(duì)DPPH 自由基清除能力呈現(xiàn)劑量依賴性，但三者的變化趨勢(shì)略有不同。當(dāng)銀杏葉渣多糖質(zhì)量濃度在2.0～3.0 mg∕mL 時(shí)，其清除率基本維持在67%左右，此質(zhì)量濃度范圍內(nèi)2種總黃酮的清除率卻呈現(xiàn)穩(wěn)步增加的趨勢(shì)，溶劑提取法所得銀杏葉渣總黃酮清除率由78.57%增至84.53%，增加了5.96 個(gè)百分點(diǎn)，而質(zhì)量濃度在2.0～3.0 mg∕mL時(shí)，復(fù)合酶輔助醇水溶劑提取法所得銀杏葉渣總黃酮的清除率則增加10.36個(gè)百分點(diǎn)。另外，在所測(cè)試的范圍內(nèi)，銀杏葉渣多糖及2 種銀杏葉渣總黃酮對(duì)DPPH 自由基清除能力次序基本一致：復(fù)合酶輔助醇水溶劑提取法所得銀杏葉渣總黃酮＞溶劑提取銀杏葉渣總黃酮＞銀杏葉渣多糖，IC50值分別為0.63、0.88、0.99 mg∕mL。它們?nèi)呔患皩?duì)照物抗壞血酸（IC50=0.14 mg∕mL）。

圖5 銀杏多糖、總黃酮對(duì)DPPH自由基清除能力的影響Fig.5 Effects of Ginkgo biloba polysaccharides and total flavonoids on DPPH free radical scavenging ability

2.4.2 ABTS+自由基清除能力測(cè)定結(jié)果 銀杏葉渣多糖、總黃酮對(duì)ABTS+自由基清除試驗(yàn)結(jié)果列于圖6中，3 種測(cè)試物在0.2～3.0 mg∕mL 時(shí)，其清除ABTS+自由基能力與質(zhì)量濃度呈現(xiàn)正相關(guān)；三者的清除曲線幾乎一致，其清除能力次序與DPPH 自由基類似：復(fù)合酶輔助醇水溶劑提取法提取銀杏葉渣總黃酮＞溶劑提取銀杏葉渣總黃酮＞銀杏葉渣多糖。當(dāng)測(cè)試物質(zhì)量濃度達(dá)到3.0 mg∕mL 時(shí)，三者的清除率分別達(dá)到68.82%、63.38%、52.56%，ABTS+自由基清除率均低于同濃度下DPPH 自由基清除率。另外，抗壞血酸、復(fù)合酶輔助醇水溶劑提取法提取銀杏葉渣總黃酮、溶劑提取銀杏葉渣總黃酮、銀杏葉渣多糖的IC50分別為0.14、1.08、1.44、2.14 mg∕mL。由此推知，銀杏葉渣多糖、總黃酮對(duì)ABTS+自由基具有中等清除能力，而對(duì)DPPH具有較強(qiáng)的清除能力。

圖6 銀杏多糖、總黃酮對(duì)ABTS+自由基清除能力的影響Fig.6 Effects of Ginkgo biloba polysaccharides and total flavonoids on ABTS+free radical scavenging ability

2.4.3 羥自由基清除能力測(cè)定結(jié)果 在機(jī)體氧化過(guò)程中，羥自由基與抗氧化活性關(guān)系密切[29-30]，銀杏葉渣多糖、總黃酮對(duì)羥自由基的清除試驗(yàn)結(jié)果（圖7）表明，當(dāng)測(cè)試物質(zhì)量濃度在0.2～1.0 mg∕mL 時(shí)，其羥自由基清除能力隨質(zhì)量濃度增加呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)趨勢(shì)，銀杏葉渣多糖清除率增至50%～60%，銀杏葉渣總黃酮清除率普遍增至80%～90%；若繼續(xù)增加測(cè)試物質(zhì)量濃度至3.0 mg∕mL，其清除率較1.0 mg∕mL時(shí)增長(zhǎng)不超過(guò)5%。對(duì)比3 種測(cè)試物對(duì)羥自由基清除能力，以復(fù)合酶輔助醇水溶劑提取法提取銀杏葉渣總黃酮最優(yōu)（IC50=0.35 mg∕mL），溶劑提取銀杏葉渣總黃酮居中（IC50=0.42 mg∕mL），而銀杏葉渣多糖清除能力最弱（IC50=1.33 mg∕mL），這一結(jié)果與DPPH 自由基、ABTS+自由基均類似。但是，銀杏葉渣多糖與復(fù)合酶輔助醇水溶劑提取法提取銀杏葉渣總黃酮對(duì)羥自由基清除率差值高達(dá)33.67%，而它們二者對(duì)DPPH 自由基、ABTS+自由基清除率差值均不高于20%，這說(shuō)明與銀杏葉渣多糖相比，銀杏葉渣總黃酮對(duì)羥自由基清除具有更明顯的優(yōu)勢(shì)。

圖7 銀杏多糖、總黃酮對(duì)羥自由基清除能力的影響Fig.7 Effects of Ginkgo biloba polysaccharides and total flavonoids on hydroxyl radical scavenging ability

3 結(jié)論與討論

對(duì)于銀杏葉渣多糖、總黃酮提取的研究報(bào)道較多，徐紅欣等[31]、何康[32]研究中通過(guò)調(diào)整提取時(shí)間、提取次數(shù)、提取溫度以及料液比等影響因素，對(duì)多糖、總黃酮等的提取進(jìn)行工藝優(yōu)化。本研究設(shè)計(jì)了水提醇沉獲取多糖、復(fù)合酶輔助醇水溶劑提取法提取銀杏葉渣總黃酮的分步提取方案。考慮銀杏葉渣來(lái)源的特定性，僅就多糖提取時(shí)料液比、總黃酮提取時(shí)醇水比例這2 個(gè)關(guān)鍵因素進(jìn)行深入研究，初步確立了從銀杏葉渣中提取多糖和總黃酮的適宜條件；在此基礎(chǔ)上，采取生物酶輔助醇水提取法以期提高總黃酮中游離苷元含量，最終提升總黃酮抗氧化效能。然而，單用β-葡萄糖苷酶提取黃酮的效果并不理想，這可能與銀杏葉渣中黃酮苷及其相對(duì)組成有聯(lián)系，陳春[33]研究提示，復(fù)合酶較單一酶輔助溶劑提取能夠產(chǎn)生協(xié)同作用，其提取效果更優(yōu)。據(jù)此，本研究選擇將β-葡萄糖苷酶、纖維素酶、果膠酶以1∶1∶2 復(fù)配加入提取多糖后的銀杏葉渣中，當(dāng)復(fù)合酶添加量8.0%，在pH 值為5、50 ℃下酶解2.5 h，酶滅活、濃縮提取液后，再按料液比1∶8 比例加入80%乙醇，于80 ℃提取4 h，其總黃酮和游離苷元提取率分別達(dá)0.59‰和0.93‰，與僅用80%乙醇提取相比，其總黃酮及其游離苷元提取率分別提高126.9%和102.2%。以上結(jié)果表明，本研究通過(guò)對(duì)水提醇沉、復(fù)合酶輔助醇水溶劑提取法的改進(jìn)實(shí)現(xiàn)了對(duì)銀杏葉渣中多糖、總黃酮的綜合提取，且游離苷元含量也得以提升。

當(dāng)銀杏葉渣中多糖、總黃酮兩類物質(zhì)得以富集后，本研究對(duì)其抗氧化性能進(jìn)行了測(cè)試。3.0 mg∕mL的銀杏葉渣多糖對(duì)DPPH 自由基、ABTS+自由基及羥自由基清除率均在50%～70%，其對(duì)應(yīng)的IC50值分別為0.99、2.14、1.33 mg∕mL。相比而言，銀杏葉渣總黃酮對(duì)3 種自由基的清除效果普遍優(yōu)于多糖，3.0 mg∕mL 銀杏葉渣總黃酮的清除率介于60%～100%。進(jìn)一步地，對(duì)溶劑提銀杏葉渣總黃酮和復(fù)合酶提銀杏葉渣總黃酮的抗氧化性能也做一對(duì)比。復(fù)合酶輔助醇水溶劑提取法提取銀杏葉渣總黃酮對(duì)DPPH 自由基、ABTS+自由基及羥自由基的IC50值分別為0.63、1.08、0.35 mg∕mL，較溶劑提取銀杏葉渣總黃酮的IC50值（0.88、1.44、0.42 mg∕mL）則降低17%～28%，這提示復(fù)合酶輔助醇水溶劑提取法所得總黃酮的清除能力較溶劑提取法更優(yōu)，該結(jié)果與游離苷元提取率大小基本一致。

本研究實(shí)現(xiàn)了銀杏葉渣中多糖和總黃酮兩類活性成分的綜合提取，且復(fù)合酶輔助醇水溶劑提取法所得銀杏葉渣總黃酮及游離苷元提取率較溶劑提取法分別提升1 倍以上，其對(duì)DPPH 自由基、ABTS+自由基及羥自由基清除的IC50值也有明顯降低，均證實(shí)了復(fù)合酶輔助醇水溶劑提取法提升了游離黃酮苷元含量，最終增強(qiáng)了自由基清除能力。本研究針對(duì)銀杏葉渣資源利用性與其功能性兩方面進(jìn)行了探究，其研究結(jié)果為銀杏葉廢棄物的高值化利用提供了有益參考，具有重要的經(jīng)濟(jì)和理論價(jià)值。