家蠶Gloverin 2 克隆、高效表達及其抗核型多角體病毒感染作用研究

唐芬芬，楊偉克，張祖蕓，李 娜，劉 娜，謝 昆

（1.紅河學(xué)院生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，云南 蒙自 661100；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661100）

家蠶（Bombyx mori）是我國主要的經(jīng)濟昆蟲，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要地位。由家蠶核型多角體病毒（BmNPV）引發(fā)的血液型膿病嚴(yán)重時甚至造成蠶繭顆粒無收[1-2]。對于BmNPV 的防控主要是在飼養(yǎng)環(huán)境進行消毒，無有效防控藥物，家蠶抗BmNPV 免疫機制也未完全解析[3-7]。BmNPV 嚴(yán)重制約蠶業(yè)發(fā)展?？咕模ˋntimicrobial peptides，AMPs）作為一類重要的免疫效應(yīng)因子，在昆蟲抵御微生物的侵染中發(fā)揮著重要的作用，其抗菌活性及機制已被報道，具有相對分子量小、受熱穩(wěn)定、水溶性強、抗菌譜廣等特點[8]。前人研究表明，抗菌肽具有抗病毒活性[9]，關(guān)于抗菌肽抗病毒的機制可分為4 種：通過免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、抑制病毒基因表達和蛋白質(zhì)合成、抑制病毒組裝及直接裂解病毒囊膜[10]。如蜂毒肽能抑制小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒、煙草花葉病毒和單純皰疹病毒（Herpes simplex virus，HSV）的復(fù)制[11-12]，這表明蜂毒肽具有抗病毒活性，其抗病毒機制類似于抗菌機制，是通過與病毒囊膜直接作用使其裂解從而抑制病毒增殖的。從爪蟾中分離出來的Magainin 家族蛋白能有效抑制動物體內(nèi)HSV 病毒；在體外試驗中，直接將抗菌肽與HSV 孵育，它們表現(xiàn)出更強的抑制效果。在昆蟲抗病毒免疫反應(yīng)中，抗菌肽也是潛在的抗病毒因子[13-14]。

在家蠶基因組中注釋了七大抗菌肽的基因家族，Cecropin、Moricin、Attacin、Enbocin、Gloverin、Defensin 和Lebocin，編碼抗菌肽的基因均以基因家族的形式存在[15-16]。家蠶抗菌肽的抗菌活性及機制已被報道[17]，而關(guān)于家蠶抗菌肽的抗病毒特性及機制研究較少。Gloverin 是鱗翅目昆蟲特有的抗菌肽之一，富含甘氨酸，不含半胱氨酸，抗革蘭氏陰性菌、真菌和病毒。在家蠶中Gloverin 有4 個基因成員（Gloverin 1-4），YI 等[18]對其結(jié)構(gòu)與活性進行了深入研究。KAWAOKA 等[19]研究表明，通過向家蠶注射大腸桿菌（Escherichia coli），能引起Gloverin 在中腸強烈免疫應(yīng)答。研究還發(fā)現(xiàn)，家蠶Cecropin、Moricin、Gloverin 基因家族成員中顯示主基因成員對微生物誘導(dǎo)的表達活性和抗菌活性最強的特征，其中Gloverin 2為Gloverin 家族主基因[20]。隨后，WANG 等[21]對Gloverin 2的抗菌機制進行研究發(fā)現(xiàn)，在家蠶絲腺中過表達Glovrin 2 能提高家蠶抗菌能力和蠶絲性能[22]。而關(guān)于Gloverin 抗病毒研究的報道較少[23]，Gloverin抗BmNPV效果及機制未見報道。為此，探究抗菌肽抗BmNPV 的作用及機制，旨在為研究家蠶抗病育種提供參考，同時可為昆蟲抗菌肽的有效利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試家蠶品種為箐松×皓月，BmNPV 為T3 株，均由紅河學(xué)院昆蟲生理生化與資源開發(fā)研究室提供。家蠶飼養(yǎng)至3齡，挑選發(fā)育一致的幼蟲進行試驗。

質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA 膠回收試劑盒為Axygen 公司產(chǎn)品；BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒、RNAiso Plus、pMD-19T 載體均購自寶生物工程（大連）有限公司；T4 DNA 連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶、DNA Marker、RT-PCR 試劑盒、大腸桿菌DH5α 和BL21（DE3）感受態(tài)細胞、蛋白質(zhì)Marker、Ni-IDA 親和層析柱等均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 BmGloverin 2基因的克隆與重組表達載體的構(gòu)建和檢測

根據(jù)家蠶GenBank 公布的BmGloverin 2的mRNA 序列（AB190864.1），利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計特異性引物，含NdeⅠ和XhoⅠ位點，序列為F：5′-CATATGGAAGTTTACGGACCTTCTGAT-3′，R：5′-CTCGAGCTCTAGG CGGTACTAACC-3′（下劃線分別為NdeⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶位點）。用Trizol 試劑提取經(jīng)BmNPV 誘導(dǎo)的3 齡3 日家蠶中腸總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以此為模板擴增除信號肽部分（1—18 aa）的BmGloverin 2目的片段，將PCR目的產(chǎn)物連接到pMD-19T 載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α后，陽性克隆經(jīng)PCR 鑒定并測序。然后，將正確的重組質(zhì)粒pMD-19T-BmGloverin 2和pET28a（+）載體經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒。

1.3 BmGlvoverin 2蛋白的表達與純化

將pET28a（+）-BmGloverin 2轉(zhuǎn)化至表達菌株大腸桿菌BL21（DE3）細胞，經(jīng)檢測的陽性菌落在37 ℃下接種于含氨芐青霉素（100 μg∕mL）的LB 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8，然后用0.5 mmol∕L IPTG在37 ℃下誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達6 h，通過在4 ℃下6 000×g離心20 min 收集菌體并重新懸浮于PBS（pH 值7.4），超聲破碎，收集上清液和沉淀并用SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達。以優(yōu)化后的條件擴大培養(yǎng)，按上述相同條件超聲破碎并收集上清用于純化目的蛋白?？咕腂mGlvoverin 2 重組蛋白的純化按Ni-IDA 說明書進行，對純化后的目的蛋白進行SDS-PAGE 鑒定，大量純化樣品進行透析，用PEG20000濃縮，經(jīng)0.45μm濾膜過濾后，BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測定重組蛋白濃度，于-80 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 BmGlvoverin 2抑菌活性檢測

為檢測BmGloverin 2 重組蛋白是否具有活性，對革蘭氏陰性菌大腸桿菌DH5α的抗菌活性進行檢測。采用瓊脂板孔穴擴散法。挑取供測菌單菌落，轉(zhuǎn)接于5 mL LB 液體培養(yǎng)基中，250 r∕min、30 ℃培養(yǎng)至OD 值為0.5～0.6。取20μL 的菌液注入到無菌的9 cm 培養(yǎng)皿中，加入經(jīng)熔化后冷卻到50～60 ℃的LB固體培養(yǎng)基，振蕩混勻，冷卻。用直徑2.7 mm 的打孔器打孔，每孔注入25 μL 質(zhì)量濃度為100 μg∕mL的經(jīng)純化的重組蛋白溶液，以無菌水和2.5 μL 10 mg∕mL 硫酸卡那霉素分別作為陰性和陽性對照，待蛋白質(zhì)溶液完全吸收后，倒置培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)12 h，每組3個重復(fù)，觀察并測量抑菌圈直徑。

1.5 BmGloverin 2 對BmNPV 感染家蠶的影響試驗

參照李偉燦等[24]的方法，略有改動。取500μL質(zhì)量濃度為50 μg∕mL 的重組蛋白溶液，與純化的500 μL BmNPV（4×105PIB∕mL）混合，室溫放置4 h后，均勻涂于切好的三角桑葉單葉面上，室溫晾干后，投喂已停止喂食12 h 的3 齡家蠶。同時，取1 mL 濃度為2×105PIB∕mL BmNPV 病毒液和無菌水，以相同方法飼喂家蠶，作為對照。以上處理每組30 頭家蠶，各設(shè)3 個重復(fù)。處理后，在室溫下正常飼養(yǎng)，每天投喂3 次桑葉，觀察記錄家蠶死亡情況，并對死亡家蠶進行鏡檢確認是否病毒感染導(dǎo)致。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用Excel 進行分析并繪圖，利用軟件SPSS 20.0 進行獨立樣本T檢驗，分別比較BmGlolverin 2蛋白和BmNPV 混合液處理組與BmNPV 對照組感染家蠶后不同時間點家蠶存活率的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 BmGloverin 2基因的擴增結(jié)果

以經(jīng)BmNPV 誘導(dǎo)的3 齡3 日家蠶中腸cDNA 為模板，通過PCR 技術(shù)擴增出去除信號肽部分（1—18 aa）的BmGloverin 2目的片段，取8 μL PCR 產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖電泳，結(jié)果顯示，擴增得到單一的條帶，大小約為465 bp（圖1），與目的基因大小相符。將PCR 目的產(chǎn)物克隆到pMD-19T 載體，并經(jīng)測序表明序列一致。

圖1 家蠶抗菌肽BmGloverin 2基因的RT-PCR擴增結(jié)果Fig.1 The RT-PCR amplification of antibacterial peptide gene BmGloverin 2 from B.mori

2.2 重組表達載體pET28a（+）-BmGloverin 2的鑒定

將BmGloverin2基因片段（不含信號肽序列）插入表達載體pET28a（+），選擇酶切位點NdeⅠ、XhoⅠ構(gòu)建重組表達載體pET28a（+）-BmGloverin 2，經(jīng)酶切鑒定（圖2），呈現(xiàn)2 條帶，大小分別為5 900、465 bp，符合預(yù)測，表明目的基因片段插入表達載體中。

圖2 重組質(zhì)粒pET28a（+）-BmGloverin 2酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pET28a（+）-BmGloverin 2 by enzyme digestion

2.3 BmGloverin 2重組蛋白的表達與純化

目的蛋白融合載體含His 標(biāo)簽，即構(gòu)建的表達載體表達6×His-BmGloverin 2，后續(xù)利用His標(biāo)簽進行蛋白質(zhì)檢測和純化。經(jīng)過多次優(yōu)化條件后，利用SDS-PAGE 檢測融合蛋白，發(fā)現(xiàn)0.5 mmol∕L IPTG 在37 ℃誘導(dǎo)6 h，目的蛋白在上清和沉淀中均高效表達，大小約19.1 ku，與預(yù)期目標(biāo)大小相符（圖3）。BmGloverin 2 可溶性重組蛋白經(jīng)親和層析純化，僅檢出1 條明顯的約19.1 ku 蛋白質(zhì)條帶（圖4），表明目的蛋白純化結(jié)果良好。

圖3 SDS-PAGE分析BmGloverin 2重組蛋白表達Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant BmGloverin 2

圖4 SDS-PAGE分析純化的BmGloverin 2重組蛋白Fig.4 SDS-PAGE analysis of purified recombinant BmGloverin 2

2.4 BmGloverin 2重組蛋白生物活性檢測

用純化的25 μL 質(zhì)量濃度為100 μg∕mL BmGloverin 2 重組蛋白進行抑菌試驗，分別以無菌水和硫酸卡那霉素溶液為陰性對照和陽性對照。37 ℃培養(yǎng)12 h后觀察抑菌圈的形成，并測量抑菌圈直徑。結(jié)果表明，BmGloverin 2 重組蛋白對大腸桿菌DH5α 具有抑制作用（圖5a），抑菌直徑達6 mm（圖5b）。說明表達純化的BmGloverin 2重組蛋白具有生物活性，可用于后續(xù)試驗。

圖5 BmGloverin 2重組蛋白對大腸桿菌DH5α的抑菌效果Fig.5 Bacteriostatic effect of recombinant BmGloverin 2 protein on E.coli DH5α

2.5 BmGloverin 2重組蛋白對BmNPV感染家蠶的影響

對家蠶3 齡幼蟲喂食重組蛋白和BmNPV 混合液處理組與喂食BmNPV 對照組進行累計存活率比較。結(jié)果顯示（圖6），家蠶喂食BmNPV 后24 h 開始死亡，72～96 h 是家蠶死亡的高峰期。在96 h 后，喂食重組蛋白和BmNPV 混合液的處理組累計存活率與喂食BmNPV 對照組的存活率相比差異顯著（P＜0.05）。而在168 h，喂食重組蛋白和BmNPV 混合液的處理組累計存活率與直接喂食BmNPV 的對照組相比高7.78個百分點，但差異不顯著（P＞0.05）。以上結(jié)果表明，喂食混合液中添加的BmGloverin 2重組蛋白在病毒感染初期有明顯降低病毒感染的作用。

圖6 喂食BmNPV和重組蛋白混合液對家蠶3齡幼蟲存活率的影響Fig.6 Effects of feeding BmNPV and recombinant protein mixture on the survival rate of the 3 rd instar larvae of Bombyx mori

3 結(jié)論與討論

Gloverin 是一種富含甘氨酸的抗菌肽，主要存在于鱗翅目昆蟲，具有抗細菌、真菌和病毒的活性。BmGloverin 2屬于Gloverin 家族，不僅具有抗革蘭氏陽性、陰性菌和真菌活性，且對苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（Autographa californicamultiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）具有抗病毒活性[25]。本研究中，為了獲得具有生物活性的BmGloverin 2，并研究其可能的抗病毒相關(guān)功能，選擇pET28a（+）載體作為BmGloverin 2基因的表達載體，將目的基因插入pET28（+）載體上的NdeⅠ酶和XhoⅠ酶之間的多克隆位點，使BmGloverin 2 蛋白帶有1 個His-tag，便于利用His-tag 進行親和層析分離純化。最終，通過分離純化獲得重組蛋白BmGloverin 2，并通過抑菌活性檢測表明其具有生物活性。

Gloverin 在其他昆蟲的抗病毒免疫中發(fā)揮重要作用，如Gloverin 可通過破壞AcMNPV 的囊膜，使其內(nèi)容物釋放，從而抑制病毒增殖[25]；在亞洲舞毒蛾（Lymantria dispar）中沉默Gloverin基因，LdMNPV 在感染后48 h和72 h的DNA 復(fù)制水平顯著升高，表明LdGloverin 可以抑制LdMNPV 的DNA 復(fù)制[26]。結(jié)合前期qRT-PCR 檢測BmNPV 誘導(dǎo)BmGloverin 2 上調(diào)表達的結(jié)果[27]，提示BmGloverin 2 可能在家蠶防御BmNPV感染中發(fā)揮重要作用。于是，在蟲體水平檢測BmGloverin 2 對BmNPV 侵染家蠶的影響。結(jié)果顯示，在BmNPV 和BmGloverin 2混合處理后喂食家蠶3齡幼蟲可以降低BmNPV 對幼蟲的感染率，且在96 h 顯著提高存活率。這說明BmGloverin 2 在家蠶抵抗BmNPV中很可能發(fā)揮著重要作用。

前人研究表明，抗菌肽之間通過協(xié)同作用消除外來微生物的感染[28]。本研究中，只探討了單一BmGloverin 2 對BmNPV 感染幼蟲的影響，有一定的局限性。是否BmGloverin 2會與其他抗菌肽協(xié)同作用防御BmNPV 有待進一步研究。本研究為制定家蠶抗病毒策略提供了新的方向，為更好地利用抗菌肽奠定基礎(chǔ)。