大蒜2個中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因AsNI的克隆與表達(dá)分析

周倩怡,黃思杰,田 潔

(1.青海大學(xué) 農(nóng)林科學(xué)院,青海省高原種質(zhì)資源研究與利用實驗室,青海 西寧 810016;2.生態(tài)環(huán)境部 南京環(huán)境科學(xué)研究所,江蘇 南京 210042)

蔗糖轉(zhuǎn)化酶是植物體內(nèi)蔗糖代謝的關(guān)鍵酶,高等植物體內(nèi)的蔗糖需要通過水解為己糖才能被吸收利用[1]。蔗糖從光合活性組織(主要為成熟的葉片)運(yùn)輸?shù)椒枪夂献饔玫膸?如花、果實、根),進(jìn)而被降解成為己糖等其他衍生物,用于各種生物過程[2]。轉(zhuǎn)化酶催化蔗糖的裂解將蔗糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖和果糖,在植物的初級代謝中起著關(guān)鍵作用[1],蔗糖轉(zhuǎn)化酶不僅參與了植物的生長發(fā)育,還可以作為信號物質(zhì)調(diào)節(jié)植物對非生物脅迫的抗性[3]。根據(jù)發(fā)揮作用的最適的pH,可分為酸性轉(zhuǎn)化酶(Acid invertase,AI)和中性/堿性轉(zhuǎn)化酶(Netural/alkaline invertase,NI)[4]。在之前的研究中,酸性轉(zhuǎn)化酶的功能及調(diào)控機(jī)制已經(jīng)被廣泛報道,如酸性轉(zhuǎn)化酶可以調(diào)控碳同化物庫器官的發(fā)育和庫強(qiáng)調(diào)節(jié)[5],由于中性/堿性轉(zhuǎn)化酶活性不穩(wěn)定,難以純化,導(dǎo)致人們對其功能知之甚少。最近的研究中,人們發(fā)現(xiàn)中性/堿性轉(zhuǎn)化酶在植物的生長發(fā)育過程中同樣具有至關(guān)重要的作用。目前,已經(jīng)鑒定并從芒果[6]、番茄[7]、石斛[8]、木薯[9]等植物中克隆出中性/堿性轉(zhuǎn)化酶。Liu等[10]克隆得到3個橡膠中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因(HbNI),其中HbNI2表現(xiàn)出NI基因功能,其動力特征與蔗糖濃度呈正相關(guān)。在茶樹中鑒定出的中性/堿性轉(zhuǎn)化酶在非生物脅迫下提高了植株的抗性[11]。

大蒜(AlliumsativumL.)是百合科蔥屬植物,富含多種營養(yǎng)和藥用價值。蔗糖是大蒜糖積累的主要形式[12],其含量不僅是影響大蒜的風(fēng)味品質(zhì)的重要因素,也是植株抗逆性的體現(xiàn)[13]。樂都紫皮大蒜是青海特有品種,具有喜冷涼、產(chǎn)量高、品質(zhì)好、商品性高的特點(diǎn),但青海年平均溫度低,降水量少,會影響大蒜幼苗的生長發(fā)育[14]。目前,關(guān)于中性/堿性氧化酶對提高大蒜的抗逆作用研究較少,對大蒜的中性/堿性氧化酶基因的克隆及脅迫下表達(dá)模式也鮮有報道。本研究以樂都紫皮大蒜為試材,利用TA克隆法對AsNI進(jìn)行克隆并進(jìn)行生物學(xué)信息分析,分析這2個基因在不同脅迫處理下不同組織的表達(dá)模式,為探明逆境脅迫下大蒜AsNI基因的分子響應(yīng)機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗以樂都紫皮大蒜為材料,播種于栽培基質(zhì)配比為草炭∶珍珠巖∶蛭石=2∶1∶1的盆缽中,置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。設(shè)置培養(yǎng)條件晝/夜:25 ℃/15 ℃,14 h/10 h;相對濕度70%;光照強(qiáng)度:300 μmol/(m2·s)。培養(yǎng)至大蒜苗高為12 cm左右時,進(jìn)行分組培養(yǎng)處理:

正常培養(yǎng)(CK):培養(yǎng)條件不變,相對濕度保持70%,定期澆水保持土壤濕潤;干旱脅迫處理(DT):通過停止?jié)菜M(jìn)行人工控水[15],保持空氣相對濕度25%～30%,土壤濕度為45%左右,光周期及光照強(qiáng)度不變;低溫脅迫處理(CT): 將大蒜幼苗放置在晝/夜:4 ℃/4 ℃,14 h/10 h的培養(yǎng)條件下培養(yǎng),相對濕度保持70%,定期澆水保持土壤濕潤,光周期及光照強(qiáng)度不變。

分別取對照、低溫脅迫處理(4,12,24 h)、干旱脅迫處理(1,6,9 d)大蒜根、假莖、鱗莖、葉片用于RNA的提取和cDNA的合成,上述采集樣品立即用液氮速凍,于-80 ℃保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA的合成 將采集的脅迫處理不同時期的大蒜組織材料的總RNA的提取利用TRNzol Universal(TRNzol Universal,DP424)總RNA提取試劑進(jìn)行。采用1%瓊脂糖凝膠和TGem微量分光光度計(OSE-260,天根生化科技有限公司)分別檢測RNA完整性和質(zhì)量。cDNA的合成按照HonorTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR試劑盒進(jìn)行。合成的cDNA放在-20 ℃冰箱進(jìn)行保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 大蒜AsNI基因的克隆 從大蒜基因組數(shù)據(jù)檢索得到2條中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因序列,據(jù)此設(shè)計克隆引物AsNI1-F(5′-ATGGCTTTAAGGGCTTCGCTCAC-3′)、AsNI1-R(5′-T CTAACCTGGCCAAGATCCTCCAT-3′)和AsNI2-F(5′-ATGGCTTTAAGGGCTTCGCTCA-3′)、AsNI2-F(5′-CTAACCTGGCCAAGATCCTCCA-3′)。PCR擴(kuò)增模板為樂都紫皮大蒜假莖cDNA。PCR擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min 30 s,進(jìn)行35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳回收產(chǎn)物,連接pMD19-T載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài),選取單克隆進(jìn)行菌液PCR驗證,陽性克隆送至北京六合華大基因科技有限公司測序。

1.2.3 序列分析 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)通過Ex PaSy(https://web.expasy.org/protparam/)在線網(wǎng)站進(jìn)行預(yù)測分析,跨膜結(jié)構(gòu)域利用TMHMM(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)在線網(wǎng)站分析。亞細(xì)胞定位和信號肽預(yù)測利用Softberry(http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=protcomppl&group=programs&subgroup=proloc)和SignalP 3.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-3.0)進(jìn)行。利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)和Phyre 2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)分別進(jìn)行蛋白質(zhì)二、三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測。利用NetPhos 3.1 Server(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1)和NetNGlyc-1.0 Server(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0)預(yù)測AsNI蛋白的磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)。利用MEME(https://meme-suite.org/meme/)在線分析蛋白基序的保守性;使用 STRING網(wǎng)站(https://cn.string-db.org/)預(yù)測蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)。在NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得擬南芥等其他植物的NI序列,使用MEGA 6.0對系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行測試和編輯,生成報告圖形。利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預(yù)測AsNI啟動子序列的順式作用元件。利用PlantRegMap網(wǎng)站(http://plantregmap.gao-lab.org/binding_site_prediction.php)預(yù)測轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)。

1.2.4 實時熒光定量PCR 根據(jù)熒光定量試劑盒(Unique AptamerTMQpcr SYBR?Green Master Mix)在Roche LightCycler?480 ℃上進(jìn)行實時熒光定量PCR。參考Liu等[16]的研究,以大蒜CYP基因為內(nèi)參基因,其引物序列為CYP-F(5′-AAGGACGAGAACTTCATC-3′)、CYP-R(5′-TCAATATCTCTCACCACTTC-3′);根據(jù)克隆得到序列設(shè)計引物AsNI1-F(5′-GGCGGTTATTTTGTTGGA-3′)、AsNI1-R(5′-ATAGATTGCTCGGGTGTA-3′)、AsNI2-F(5′-ATCTCCAGCCTGCTCACA-3′)、AsNI2-R(5′-TCCCATTTCTCTTCCATT-3′)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達(dá)水平[17]。顯著性差異采用SPSS的Duncan法(P<0.05)進(jìn)行分析。圖表利用Origin 2021軟件進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜轉(zhuǎn)化酶基因AsNI的克隆

以樂都紫皮大蒜的cDNA為模板,使用特異性引物AsNI1-F、AsNI1-R和AsNI2-F、AsNI2-R進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,得到一條長度約為500 bp和一條長度約為1 200 bp的目的條帶(圖1),片段大小與預(yù)期一致。測序結(jié)果表明,AsNI1基因開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)全長522 bp,編碼173個氨基酸(圖2),AsNI2基因ORF全長1 203 bp,編碼400個氨基酸(圖3)。AsNI1基因與AsNI2基因ORF序列的相似性為26.25%。

*.終止密碼子。圖3同。

圖3 大蒜AsNI2基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列

2.2 大蒜AsNI基因氨基酸序列分析

2.2.1 大蒜AsNI蛋白的理化性質(zhì)分析及亞細(xì)胞定位預(yù)測 利用ExPaSy-ProtParam等對AsNI1與AsNI2基因編碼的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行分析(表1)。結(jié)果表明,2個蛋白均為親水性蛋白,均不穩(wěn)定,AsNI1有18個磷酸化位點(diǎn),AsNI2含有41個磷酸化位點(diǎn);AsNI1未檢測到糖基化位點(diǎn),AsNI2含有一個糖基化位點(diǎn);亞細(xì)胞預(yù)測定位表明2個蛋白均位于細(xì)胞質(zhì)。

表1 大蒜AsNI的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)

2.2.2 大蒜AsNI的蛋白結(jié)構(gòu)分析 利用SOPMA對蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測(圖4,5),結(jié)果表明,AsNI1二級結(jié)構(gòu)包含的α-螺旋、延伸結(jié)構(gòu)、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲分別為43.00%,15.00%,6.25%和35.75%;AsNI2則分別包含45.09%,12.27%,2.31%和39.88%。利用Phyre 2軟件進(jìn)行同源建模,并通過PyMOL軟件分析蛋白三級結(jié)構(gòu),其結(jié)果顯示AsNI1蛋白的三維結(jié)構(gòu)由9個α螺旋和2個β折疊所構(gòu)成;AsNI2蛋白的三維結(jié)構(gòu)由15個α螺旋和4個β折疊所構(gòu)成。

藍(lán)色.α螺旋;綠色.β轉(zhuǎn)角;黃色.無規(guī)則卷曲;紅色.延伸結(jié)構(gòu)。圖5同。

圖5 AsNI2蛋白二級(A)、三級(B)結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.2.3 大蒜AsNI蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析 利用MEME在線分析AsNI蛋白基序的保守性(圖6),結(jié)果表明,AsNI1和AsNI2均含有10個保守基序列,但結(jié)構(gòu)相差較大,其中二者的3,9,10號基序相同且位置一致,AsNI1的4號與AsNI2的6號、5號與7號、7號與8號基序相同,但位置存在差異。通過NCBI網(wǎng)站的BlastP的程序?qū)sNI蛋白進(jìn)行功能域分析,結(jié)果表明(圖7),AsNI1蛋白在1—172氨基酸位點(diǎn)間有Glyco_hydro_100結(jié)構(gòu)域,AsNI2蛋白在1—399氨基酸位點(diǎn)存在Glyco_hydro_100結(jié)構(gòu)域,此結(jié)構(gòu)域是植物中性/堿性轉(zhuǎn)化酶的保守結(jié)構(gòu)域。

圖6 AsNI蛋白的保守基序分析

2.2.4 大蒜AsNI的多序列對比和系統(tǒng)進(jìn)化分析 利用NCBI BlastP對AsNI與其他植物的NI氨基酸序列進(jìn)行同源性對比,選取相似度較高的幾個物種進(jìn)行多重比較分析(圖8),AsNI1與AsNI2氨基酸序列的相似性為25.75%,AsNI1與擬南芥的相似性分別為86.71%;AsNI2與鐵皮石斛、野生稻、姜、玉米、高粱、黑麥草和短柄草的相似性分別為84.50%,85.50%,84.50%,85.25%,85.50%,86.00%和85.25%;表明大蒜與其他物種的AsNI的氨基酸序列具有較高的同源性,兩端與其他蛋白沒有相似性,且N端比其他蛋白少約110個氨基酸殘基。

利用MEGA 6.0軟件中的Neighbor-Joining法將大蒜與其他植物的NI構(gòu)建同源進(jìn)化樹(圖9)。結(jié)果表明,AsNI1與擬南芥屬于同一分支,在進(jìn)化關(guān)系上最為接近,AsNI2與鐵皮石斛、野生稻和姜同屬一個大分支,親緣關(guān)系較為接近,AsNI1與AsNI2屬于不同分支,親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖9 大蒜與其他作物NI氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 大蒜AsNI的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測

利用STRING網(wǎng)站,以擬南芥為模板構(gòu)建大蒜AsNI的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(圖10)。結(jié)果表明,AsNI1和AsNI2均與參與糖代謝的細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶作用,但AsNI2與3種細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶作用,多于AsNI1。此外,AsNI1也和參與氨基酸磷酸化的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AT1G29720)、聚腺苷酸結(jié)合蛋白(PAB2、短柄草(XP_003558048.1∶222-620)、鳳梨(OAY70851.1)、柑橘(KAH9692069.1)、高粱(XP_002465359.1∶227-625)、姜(XP_042399050.1∶235-634)、蘆筍(XP_020247438.1)、木槿(XP_039002564.1)、擬南芥(KAG7589826.1∶297-469)、鐵皮石斛(AVA07409.1∶212-610)、小麥(XP_044375374.1)、野生稻(XP_006645848.2∶240-637)、黑麥草(XP_047072902.1∶223-621)、玉米(XP_008655058.1∶226-624)。

圖10 大蒜AsNI1和AsNI2的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

PAB8)和4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(DEP1)相互作用。AsNI2與蔗糖合酶(SSA)、參與脫落酸形成的脫落酸缺乏酶(ABA4),糖介導(dǎo)的根系發(fā)育調(diào)控過程中的1-磷脂酰肌醇-4-磷酸5-激酶(PIP5K9)也相互作用。

2.4 大蒜AsNI基因啟動子序列分析及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測

利用PlantCARE在線網(wǎng)站對2個AsNI基因進(jìn)行啟動子元件預(yù)測分析,結(jié)果表明AsNI基因不僅包含典型的CAAT-box和TATA-box,還包含其他重要元件,部分重要元件見表2。AsNI1和AsNI2基因啟動子均具有多種逆境響應(yīng)元件,但調(diào)控元件的種類和數(shù)量存在差異,如AsNI1和AsNI2的啟動子序列都含有干旱誘導(dǎo)的MYC結(jié)合位點(diǎn),但數(shù)量上AsNI2比AsNI1多1個;AsNI2含有3種不同的逆境響應(yīng)元件,而AsNI1只含有1種,且數(shù)量上少于AsNI2;AsNI1含有7種激素調(diào)節(jié)元件,AsNI2含有2種,但彼此之間的元件類型不同。

表2 AsNI基因啟動子部分順式作用元件

通過PlantRegMap在線網(wǎng)站以擬南芥為模板預(yù)測AsNI啟動子的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果表明,AsNI1和AsNI2分別可以與31,28個轉(zhuǎn)錄因子家族具有結(jié)合位點(diǎn),與順式作用元件預(yù)測結(jié)果相符,AsNI1和AsNI2均可以參與植物逆境調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,如MYB、NAC、ERF等。其中,AsNI1與MYB家族的結(jié)合位點(diǎn)出現(xiàn)頻率最高,出現(xiàn)了28次。預(yù)測發(fā)現(xiàn),AsNI1和AsNI2基因啟動子的正負(fù)鏈均分布有上述轉(zhuǎn)錄因子,推測該啟動子具有豐富的調(diào)控機(jī)制,控制基因的表達(dá),并通過調(diào)節(jié)不同轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄起始參與行使不同的功能。

2.5 大蒜AsNI基因在不同組織和逆境條件下的表達(dá)分析

通過qRT-PCR對AsNI在大蒜不同部位的表達(dá)模式進(jìn)行分析(圖11),結(jié)果表明,正常生長條件下,AsNI在大蒜的4個組織(根、假莖、鱗莖和葉片)中均有表達(dá),其中AsNI1基因在根中表達(dá)量最高,分別比鱗莖、假莖和葉片高4.17,5.00,14.29倍,而AsNI2基因在鱗莖中表達(dá)量最高,分別比根、假莖和葉片高2.29,5.09,1.89倍。

不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。

低溫脅迫下,大蒜不同組織AsNI1和AsNI2的表達(dá)模式差異顯著(圖12)。與脅迫前(CK 0 h)相比,低溫處理除了使根系A(chǔ)sNI1的表達(dá)量在脅迫12 h顯著提高以外,其他3個組織在整個處理期間均顯著下調(diào)。與之不同,低溫處理能夠顯著提高各部位AsNI2的表達(dá)量。同時,低溫下根、假莖、鱗莖、葉AsNI2的最大表達(dá)量分別比對照高4.75,2.18,3.16,14.51倍,即葉片AsNI2對低溫脅迫的響應(yīng)較其他組織更強(qiáng)。綜上可得,低溫脅迫對AsNI2的誘導(dǎo)強(qiáng)于AsNI1,其中以葉片AsNI2對低溫逆境的響應(yīng)更為明顯。

圖12 AsNI基因在低溫脅迫處理下不同組織相對表達(dá)水平

干旱脅迫對大蒜各組織AsNI1和AsNI2表達(dá)的影響具有顯著差異(圖13)。干旱處理下,AsNI1除了在假莖和鱗莖于脅迫6～9 d顯著高于對照以外,其他組織表達(dá)并未受到顯著上調(diào)表達(dá)。而對于干旱脅迫的AsNI2,其表達(dá)量在4個組織中均出現(xiàn)1個或多個顯著高于對照的時間點(diǎn)。其中,根、假莖、鱗莖、葉AsNI2的表達(dá)量分別于干旱處理1,1,6,1 d達(dá)到峰值,較對照高出5.01,1.06,1.41,1.10倍,即根系A(chǔ)sNI2對干旱脅迫的響應(yīng)明顯強(qiáng)于其他組織。由此可知,與AsNI1相比,干旱脅迫對AsNI2的誘導(dǎo)更明顯;與其他組織相比,根系A(chǔ)sNI2對干旱逆境的響應(yīng)更強(qiáng)。

圖13 AsNI基因在干旱脅迫處理下不同組織相對表達(dá)水平

3 結(jié)論與討論

植物在生長發(fā)育的過程中常常會遭受低溫、干旱、鹽堿等非生物脅迫,這會影響植物的正常生長發(fā)育以及農(nóng)作物的生產(chǎn)力,因此,植物進(jìn)化出多種調(diào)節(jié)機(jī)制來抵抗非生物脅迫[18]。研究表明,可溶性糖具有清除逆境脅迫下植物體內(nèi)產(chǎn)生的ROS的功能[10],蔗糖作為主要的碳水化合物來源,運(yùn)輸?shù)綆炱鞴俸?在酶的作用下降解為己糖,供應(yīng)庫器官的生長,如果實、根和塊莖[19],蔗糖降解產(chǎn)生的己糖是合成纖維素、蛋白質(zhì)、果聚糖、淀粉和抗氧化物質(zhì)所必需的[3]。轉(zhuǎn)化酶介導(dǎo)的蔗糖代謝不僅參與了植物的正常生長,還響應(yīng)多種非生物脅迫[20]。玉米在中等水分脅迫下,其液泡轉(zhuǎn)化酶的活性會增強(qiáng),表達(dá)量升高并促進(jìn)己糖的積累[21]。Qi等[22]研究發(fā)現(xiàn),NaCl和PEG處理下,甘薯根和葉中的中性/堿性轉(zhuǎn)化酶表達(dá)量增加。因此,轉(zhuǎn)化酶是植物生長發(fā)育和逆境響應(yīng)的關(guān)鍵酶。本研究利用TA克隆法從大蒜基因組克隆了2個中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因,分別編碼173,400個氨基酸,2個基因的ORF和氨基酸序列差異較大,相似性分別為26.25%和25.75%。多重序列對比發(fā)現(xiàn),AsNI蛋白兩端與其他蛋白沒有相似性,且N端比其他蛋白少約110個氨基酸殘基;AsNI1與擬南芥的相似性為86.71%,AsNI2與鐵皮石斛等物種的相似度為85.25%～86.00%,表明不同物種的中性/堿性轉(zhuǎn)化酶序列具有較高保守性。與本研究結(jié)果類似,Shen等[23]克隆了7個辣椒中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因,發(fā)現(xiàn)各基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸殘基數(shù)存在較大差異,從286—655個氨基酸殘基不等;錢文俊等[24]在分析茶樹中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因CsINV10的氨基酸序列時發(fā)現(xiàn),CsINV10與其他物種的在氨基酸序列在N端和C端的同源性較低,但在中間的450個氨基酸具有較高的保守性。通過保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)這2個基因均含有糖苷水解酶100(GH100)家族典型的Glyco_hydro_100結(jié)構(gòu)域;亞細(xì)胞定位預(yù)測2個基因均位于細(xì)胞質(zhì)中,因此,AsNI1和AsNI2較大可能是細(xì)胞質(zhì)中的中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)結(jié)果表明,AsNI2含有糖基化位點(diǎn),而AsNI1未檢測到糖基化位點(diǎn)。糖基化對蛋白質(zhì)起重要的修飾作用,可以通過糖基化調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能,因此,推測2個基因的功能有所差異。通過構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測發(fā)現(xiàn),2個基因可能參與不同的生化過程,AsNI1可能主要參與蛋白質(zhì)的磷酸化過程,而AsNI2可能參與糖代謝過程。

植物調(diào)控抗逆相關(guān)基因的表達(dá)依賴基因啟動子中特定的順式作用元件[25]。王運(yùn)林等[9]克隆了木薯中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因MeNINV1的啟動子序列,發(fā)現(xiàn)其序列上存在激素相關(guān)響應(yīng)順式作用元件,進(jìn)而利用熒光定量證明外源激素調(diào)控MeNINV1基因的表達(dá)。楊梅等[26]鑒定并分離出水稻中一個受干旱脅迫誘導(dǎo)的基因Oshox24,實時熒光定量結(jié)果和GUS活性檢測均表明該基因強(qiáng)烈受到干旱脅迫的誘導(dǎo)并上調(diào)表達(dá),其啟動子Oshox24P是干旱誘導(dǎo)型啟動子,積極響應(yīng)植物的抗旱應(yīng)答。通過對AsNI基因啟動子序列的順式作用元件預(yù)測分析,發(fā)現(xiàn)2條基因的啟動子區(qū)域除了包含 TATA-box 和 CAAT-box 等核心元件外,還包含逆境響應(yīng)元件等。核心啟動元件TATA-box是決定基因轉(zhuǎn)錄起始的選擇,含有TATA-box的基因?qū)D(zhuǎn)錄起始較為敏感,CAAT-box調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始的頻率,可以增強(qiáng)啟動子的強(qiáng)度[27],因此,可以推測AsNI的啟動子具有正常的轉(zhuǎn)錄功能;此外AsNI1和AsNI2含有不同種類及數(shù)量的逆境響應(yīng)元件,推測AsNI1和AsNI2具有不同的逆境調(diào)控機(jī)制。啟動子上的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)是轉(zhuǎn)錄開始的關(guān)鍵部位,研究表明,轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)具有保守性,相似的序列就可以結(jié)合同樣的轉(zhuǎn)錄因子[28-29]。預(yù)測結(jié)果表明,AsNI1和AsNI2的啟動子有多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),表明AsNI1和AsNI2可行使不同的基因功能。

在脅迫下,植物通過提高轉(zhuǎn)化酶基因的表達(dá)水平,促進(jìn)蔗糖的水解,以此來緩解逆境損傷[30]。在本研究中,AsNI1和AsNI2在不同脅迫下具有不同的表達(dá)模式。低溫脅迫下,根系中AsNI1的表達(dá)量顯著提高,AsNI2在葉片中的響應(yīng)更為明顯;干旱脅迫下,AsNI1在假莖和鱗莖中表達(dá)量顯著增加,AsNI2則以根系的響應(yīng)最為強(qiáng)烈,且在2個脅迫下,AsNI2基因的響應(yīng)程度均強(qiáng)于AsNI1。低溫破壞細(xì)胞膜的穩(wěn)定性[31],植物光合作用的主要部位在膜結(jié)構(gòu)上,低溫會降低光合相關(guān)酶的活性,抑制光合作用[32]。因此,低溫脅迫下葉片通過上調(diào)基因的表達(dá)以緩解逆境損傷。植物會通過合成滲透物質(zhì)來抵抗脅迫,中性/堿性轉(zhuǎn)化酶通過將蔗糖分解為葡萄糖和果糖,參與調(diào)節(jié)滲透平衡,減輕逆境脅迫對植物的損傷。根系是植物應(yīng)對干旱脅迫的關(guān)鍵器官[33],當(dāng)植株遭受干旱脅迫時,根部加快可溶性糖的合成,并運(yùn)輸至庫器官,彌補(bǔ)光合產(chǎn)量的降低[34],緩解逆境損傷。

本研究利用生物信息學(xué)的方法分析了2條AsNI基因的序列,綜合對比序列特征發(fā)現(xiàn)AsNI1與AsNI2在編碼氨基酸個數(shù)、糖基化位點(diǎn)個數(shù)、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)、啟動子順式作用元件類型及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)等方面存在差異,因此,推測二者可能在逆境響應(yīng)中表現(xiàn)出不同的功能;通過分析不同逆境脅迫下2個基因表達(dá)的變化趨勢,發(fā)現(xiàn)低溫和干旱處理下AsNI2的響應(yīng)程度均強(qiáng)于AsNI1。其中,低溫脅迫主要誘導(dǎo)葉片AsNI2的表達(dá),干旱脅迫以誘導(dǎo)根系A(chǔ)sNI2的表達(dá)為主。通過本研究結(jié)果表明,AsNI參與大蒜的逆境響應(yīng),為解析AsNI響應(yīng)大蒜逆境脅迫的分子機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。