玉米bZIP轉(zhuǎn)錄因子ZmbZIP26的分子特征、亞細(xì)胞定位及響應(yīng)非生物脅迫的表達(dá)分析

曹麗茹,馬晨晨,龐蕓蕓,葉飛宇,王振華,魯曉民

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所,河南 鄭州 450002;2.神農(nóng)種業(yè)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450002)

隨著全球氣候變暖,加劇了極端干旱天氣發(fā)生的程度和頻率,導(dǎo)致植物在生長過程中受到干旱的影響愈加嚴(yán)重,使糧食生產(chǎn)受到嚴(yán)重威脅。玉米(ZeamaysL.)是世界上主要的糧食作物之一,在全球的種植范圍較為廣泛,其產(chǎn)量在糧食作物中居于首位[1]。我國是農(nóng)業(yè)大國,玉米不僅是我國重要的糧食作物和飼料作物,工業(yè)生產(chǎn)中也是必不可少的原料[2]。隨著我國人口數(shù)量的增加以及對能源的需求逐漸增長,在有限的耕地面積下,保證玉米的高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)是保障糧食安全的重要途徑[3]。玉米在生長過程中需水量大,對水分脅迫十分敏感,干旱會導(dǎo)致玉米產(chǎn)量降低,甚至嚴(yán)重時導(dǎo)致玉米絕收[4],應(yīng)對干旱脅迫最有效的途徑是培育抗旱玉米新品種,而利用分子育種技術(shù)改良創(chuàng)制抗旱新種質(zhì)是最有效的途徑之一,因此,對玉米抗旱基因的挖掘和遺傳解析是當(dāng)前重中之重的工作。

植物體內(nèi)都存在著自我調(diào)節(jié)機(jī)制和自我恢復(fù)能力,當(dāng)環(huán)境發(fā)生改變時,作物會出現(xiàn)恢復(fù)原生長的趨勢。干旱脅迫條件下,作物為適應(yīng)環(huán)境會減慢生長,在干旱后復(fù)水又會加快生長,在一定程度上彌補(bǔ)干旱脅迫造成的損失,產(chǎn)生了補(bǔ)償效應(yīng)或者超補(bǔ)償效應(yīng)[5]。補(bǔ)償效應(yīng)在自然界普遍存在,是植物應(yīng)對逆境脅迫的自我調(diào)節(jié)機(jī)制[6]。Wang等[7]研究發(fā)現(xiàn),秈稻幼苗在干旱脅迫程度未超過其耐受閾值時,對其補(bǔ)水后可以產(chǎn)生補(bǔ)償或超補(bǔ)償效應(yīng),表現(xiàn)出其恢復(fù)力和適應(yīng)性。劉婷婷等[8]通過對高粱幼苗干旱復(fù)水處理,發(fā)現(xiàn)干旱時,高粱的相對含水量、葉綠素含量等生理指標(biāo)均有所下降,復(fù)水后各項(xiàng)生理指標(biāo)恢復(fù)正常,高粱干旱適應(yīng)能力與復(fù)水后的恢復(fù)性呈正相關(guān)。飼料大麥的株高、穗長、單株產(chǎn)量等指標(biāo)隨著干旱脅迫時間的增加顯著下降,在復(fù)水后這些指標(biāo)都得到了不同程度的恢復(fù),且恢復(fù)程度隨著復(fù)水量的增加而增加[9]。

植物面臨干旱脅迫時體內(nèi)除了生理生化發(fā)生變化,在分子水平和蛋白質(zhì)水平也會發(fā)生一系列的變化,分子水平上的改變起著決定性作用[10]。響應(yīng)干旱脅迫的基因按照其作用的方式可以分為2種,即功能基因和調(diào)控基因,其中調(diào)控基因包括蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子[11]。轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factors,TF) 是一種能和基因啟動子區(qū)中的順式作用元件特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)分子,調(diào)控植物的生長發(fā)育過程,并在抵御逆境脅迫過程中發(fā)揮著重要作用[12]。bZIP轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄因子中家族成員最多,且廣泛存在于植物中,在調(diào)節(jié)植物響應(yīng)非生物脅迫的生理過程中起著十分重要的作用[13]。擬南芥中存在多個與抗逆性相關(guān)的AtbZIP基因。干旱脅迫下,AtbZIP62基因被強(qiáng)烈誘導(dǎo),該基因過表達(dá)后擬南芥的抗旱能力明顯增強(qiáng)[14];AtbZIP1過表達(dá)使擬南芥的抗鹽、抗旱能力都提高[15];在擬南芥中過表達(dá)玉米ZmbZIP72基因,發(fā)現(xiàn)其激活了Rd29B、Rab18、His1-3等脫落酸(ABA)誘導(dǎo)基因的高表達(dá),增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性[16]。沉默OsbZIP71基因后,發(fā)現(xiàn)水稻轉(zhuǎn)基因植株對鹽和干旱脅迫十分敏感[17]。SlbZIP1基因通過調(diào)節(jié)ABA的合成從而影響番茄對鹽和旱脅迫的抗性[18]。

目前,有關(guān)bZIP轉(zhuǎn)錄因子與植物生長發(fā)育關(guān)系的研究較多,其在植物抗逆中的作用研究也逐漸增多,但關(guān)于其響應(yīng)玉米干旱-復(fù)水處理的研究較少。本研究利用高通量測序技術(shù)對玉米正常、干旱和恢復(fù)澆水條件下的葉片和根系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,篩選到一個bZIP轉(zhuǎn)錄因子,暫時命名為ZmbZIP26。對ZmbZIP26進(jìn)行生物信息學(xué)分析,同時運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)分析其在玉米不同組織器官中的表達(dá)情況,以及在干旱、高溫、高鹽、氮脅迫處理下的表達(dá)特性,為深入研究玉米ZmbZIP26基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ),也為挖掘抗逆相關(guān)分子資源、培育抗逆品種提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理方法

以玉米優(yōu)良自交系鄭36作為試驗(yàn)材料,當(dāng)玉米生長到三葉一心時進(jìn)行干旱脅迫(土壤含水量45%～50%)和復(fù)水澆水(土壤含水量大于95%)處理,取脅迫前、干旱脅迫5 d以及復(fù)水3 d后的葉片和根系,分別命名為T0dY、T5dY、TR3dY和T0dG、T5dG、TR3dG,5株為一個樣品,每個樣品3個生物學(xué)重復(fù),用于轉(zhuǎn)錄組測序和后期差異基因表達(dá)量的驗(yàn)證。取在田間正常生長到三葉一心的玉米幼葉、幼莖、幼根,以及抽雄后的成熟葉、成熟莖、成熟根、雄穗、雌穗組織樣品進(jìn)行基因時空表達(dá)分析。溫室中采用光培養(yǎng)16 h、培養(yǎng)溫度為30 ℃,暗培養(yǎng)8 h、培養(yǎng)溫度為26 ℃,相對濕度33%～55%。當(dāng)鄭36生長到三葉一心時,取生長一致的玉米苗進(jìn)行處理,干旱組用20% PEG-6000(Hoagland營養(yǎng)液+20% PEG)處理,鹽脅迫組用濃度200 mmol/L的NaCl處理,氮脅迫組將玉米幼苗移至缺乏銨態(tài)氮的 Hoagland 營養(yǎng)液中,高溫組42 ℃培養(yǎng),在處理0,4,8,12,24,32,36,48,52,60,72,84 h以及解除脅迫后的12,24 h取玉米根系,3株為一個重復(fù),取3個生物學(xué)重復(fù),用于分析基因響應(yīng)非生物脅迫的表達(dá)量變化。取完樣品迅速放入液氮中,并存放在-80 ℃的超低溫冰箱中。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測序與差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子基因篩選

將樣品委托廣州基迪奧科技有限公司做高通量測序分析,基因表達(dá)量的計算采用FPKM(Fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments)算法,根據(jù)FPKM值計算基因在處理組和對照組之間的差異倍數(shù),差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為∣log2(fold change)∣≥1,篩選玉米干旱-復(fù)水過程中的差異表達(dá)bZIP轉(zhuǎn)錄因子,參考Maize GDB(https://www.maizegdb.org/)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行命名。

1.3 ZmbZIP26基因的克隆

對玉米鄭36總RNA提取利用RNAprep Pure 多糖多酚植物總 RNA 提取試劑盒(天根生化科技有限公司)的方法,根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)提供的反應(yīng)程序(25 ℃,5 min;55 ℃,15 min;85 ℃,5 min)合成cDNA。

在MaizeGDB網(wǎng)站上搜索ZmbZIP26(Zm00001d034199)基因的序列,設(shè)計特異性引物(ZmbZIP26-F:ATGGACTGGGCAGCGGCGT和ZmbZIP26-R:CTACTGCCAAGAGAATGGC),以cDNA為模板對ZmbZIP26基因的開放閱讀框(ORF)進(jìn)行擴(kuò)增,將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMDTM18-T載體(TaKaRa)上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑選出陽性單克隆(至少5個樣品)送到華大公司進(jìn)行測序,測序結(jié)果與MaizeGDB數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。

1.4 ZmbZIP26基因的生物信息學(xué)分析

利用ProtParam對ZmbZIP26基因編碼蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量、疏水性及穩(wěn)定性等進(jìn)行預(yù)測;采用NetPhoS對蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測;利用SOPMA對ZmbZIP26蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析;利用軟件MEGA 中的PHYLOGENY構(gòu)建ZmbZIP26蛋白與不同物種同源蛋白的進(jìn)化樹;利用MEME對蛋白質(zhì)的保守基序(Motif)進(jìn)行分析,將基序的最大數(shù)值設(shè)置為6;利用STRING在線工具預(yù)測ZmbZIP26的互作蛋白;從 數(shù) 據(jù) 庫 Ensembl Plants(http://plants.ensembl.org/index.html)獲取ZmbZIP26基因上游 2 000 bp序列,用Plantcare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對ZmbZIP26基因啟動子區(qū)的順式作用元件進(jìn)行分析。

1.5 實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析

根據(jù)ZmbZIP26基因序列設(shè)計特異的熒光定量引物(DL-Zm00001d034199-F:CCTTTTCCCCGATTCTCTACTC和DL-Zm00001d034199-R:ACTACGATCTACGACTCTACGA),以玉米18SrDNA作為內(nèi)參(引物18S-L:CCTGCGGCTTAATTGACTC和18S-R:GTTAGCAGGCTGAGGTCTGG),以上面不同組織、不同脅迫環(huán)境的樣品RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA作為模板,參考SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒上的程序,采用兩步法(95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,40個循環(huán))進(jìn)行qRT-PCR,采用2-ΔΔCt法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.6 ZmbZIP26蛋白的亞細(xì)胞定位分析

亞細(xì)胞定位使用表達(dá)載體pMDC83-GFP,結(jié)合酶切位點(diǎn)SpeⅠ和AscⅠ設(shè)計引物(ZmbZIP26-83-GFP-F:CTAGACTAGTATGGACTGGGCAGCGGCGT和ZmbZIP26-83-GFP-R:TTGGCGCGCCCCTACTGCCAAGAGAATGGC)對ZmbZIP26基因進(jìn)行擴(kuò)增,經(jīng)SpeⅠ和AscⅠ雙酶切后,用T4-DNA連接酶連接表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化。將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)到農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)中,利用注射法將農(nóng)桿菌菌液浸染七葉期生長強(qiáng)壯的煙草葉片,注射48 h后對浸染的葉片通過共聚焦顯微鏡觀察煙草表皮組織細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmbZIP26基因的篩選

對三葉期玉米幼苗進(jìn)行干旱和復(fù)水處理,取根系和葉片部位進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,對基因的FPKM值和功能注釋進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)了27個bZIP轉(zhuǎn)錄因子成員響應(yīng)干旱和復(fù)水處理,其中ZmbZIP26基因的表達(dá)量在正常、干旱和復(fù)水處理下達(dá)到差異極顯著水平(P<0.01)。使用FPKM值計算27個轉(zhuǎn)錄因子之間的相關(guān)系數(shù)(R>0.5),并將這些基因?qū)胲浖﨏ytoscape來構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò),鑒定處于核心節(jié)點(diǎn)的關(guān)鍵基因。通過分析,發(fā)現(xiàn)ZmbZIP26基因在共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)上與其他基因有較高的關(guān)聯(lián)度(圖1),說明ZmbZIP26基因是共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的核心關(guān)鍵基因。對玉米葉片和根系中ZmbZIP26進(jìn)行qRT-PCR分析,發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫后,該基因在葉片和根系中相對表達(dá)量均顯著升高,復(fù)水后逐漸恢復(fù)正常(圖2),且定量結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致,表明ZmbZIP26基因在玉米干旱-復(fù)水過程中發(fā)揮著重要的作用。

圖1 差異表達(dá)bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖5—6同。

2.2 ZmbZIP26基因的克隆和編碼蛋白質(zhì)性質(zhì)分析

利用RT-PCR技術(shù)對ZmbZIP26基因進(jìn)行擴(kuò)增,利用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳,得到了一條大小約為600 bp的條帶(圖3),切膠回收后連接克隆載體,篩選出陽性單克隆。測序結(jié)果表明,該段序列是一個完整的558 bp的開放閱讀框,編碼了185個氨基酸,與MaizeGDB數(shù)據(jù)庫中B73的參考序列是一致的。

M.2 000 bp DNA Marker;1.ZmbZIP26。

采用ProtParam軟件對蛋白質(zhì)性質(zhì)進(jìn)行分析,結(jié)果表明,ZmbZIP26的相對分子質(zhì)量為20.188 07 ku,分子式為C856H1 439N285O263S8,理論等電點(diǎn)為10.50;蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)為71.82,屬于不穩(wěn)定蛋白;ProtScale分析發(fā)現(xiàn),親水性值(GRAVY值)為-0.443,屬于親水性蛋白;預(yù)測PHD跨膜螺旋區(qū)顯示,該蛋白質(zhì)無跨膜結(jié)構(gòu)域;利用軟件SOPMA進(jìn)行預(yù)測,發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)α螺旋占比73.51%,β轉(zhuǎn)角占比0.54%,無規(guī)則卷曲占比20.54%,表明該蛋白質(zhì)以α 螺旋結(jié)構(gòu)為主(表1)。NetPhoS分析顯示,該蛋白質(zhì)含有14個絲氨酸和5個蘇氨酸磷酸化位點(diǎn),表明ZmbZIP26蛋白可能被絲氨酸和蘇氨酸激酶激活,調(diào)控下游響應(yīng)基因,從而參與植物的生長發(fā)育、信號傳導(dǎo)及逆境脅迫過程等。

表1 ZmbZIP26蛋白性質(zhì)分析

2.3 ZmbZIP26蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化以及保守序列分析

為了揭示ZmbZIP26的進(jìn)化關(guān)系,利用軟件MEGA構(gòu)建了多物種同源蛋白的進(jìn)化樹,發(fā)現(xiàn)ZmbZIP26蛋白與高粱(Sorghumbicolor)和芒草(Miscanthuslutarioriparius)同源蛋白的關(guān)系比較緊密,且與水稻(Oryzasativa)同源蛋白的進(jìn)化關(guān)系比較遠(yuǎn)(圖4)。為進(jìn)一步分析ZmbZIP26蛋白與其他物種同源蛋白的保守性,利用軟件MEME鑒定6個保守基序,發(fā)現(xiàn)玉米不僅與高粱和芒草同源性較高,而且在同一氨基酸位置上的保守基序相同,與水稻的保守基序相差較大(圖4),說明了不同物種間的同源性越高,保守基序相似度越高,其親緣關(guān)系也就越近。

圖4 ZmbZIP26蛋白與其他物種同源蛋白進(jìn)化樹及保守基序分析

2.4 ZmbZIP26基因啟動子順式作用元件分析

為分析ZmbZIP26基因的潛在功能,利用在線軟件Plantcare對ZmbZIP26基因ATG上游2 000 bp的順式作用元件進(jìn)行了預(yù)測,結(jié)果顯示,該轉(zhuǎn)錄因子基因除了啟動子本身含有的最基本元件CAAT-box、TATA-box等,還含有ABRE、MBS、TGACG-motif、CGTCA-motif、TCA-element等多個結(jié)合位點(diǎn)(表2)。ABRE參與脫落酸信號傳導(dǎo)途徑,響應(yīng)干旱脅迫;MBS是MYB結(jié)合位點(diǎn),參與干旱誘發(fā)過程;TGACG-motif、CGTCA-motif參與茉莉酸信號傳導(dǎo)途徑;TCA-element是水楊酸響應(yīng)元件,誘導(dǎo)水楊酸途徑相關(guān)基因的表達(dá)。此外,還有大量的響應(yīng)光刺激的元件Sp1、G-Box、Box 4、I-box等,因此,推測ZmbZIP26基因還可能調(diào)控植物開花、參與光合作用等。

表2 ZmbZIP26基因啟動子順式作用元件分析

2.5 ZmbZIP26基因組織表達(dá)模式分析

為了解ZmbZIP26基因的表達(dá)模式,采用qRT-PCR技術(shù)對該基因在玉米組織中表達(dá)情況進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)其在幼葉、幼莖、幼根、成熟葉、成熟莖、成熟根、雄穗、雌穗中均有表達(dá),其中在幼莖、雌穗、幼根、成熟根中的表達(dá)量較高(圖5)。ZmbZIP26是一個組成型表達(dá)基因,在不同組織、不同時期的表達(dá)水平存在差異,表明ZmbZIP26基因在玉米生長發(fā)育的過程中起著重要的作用。

圖5 ZmbZIP26基因在不同組織中的相對表達(dá)量

2.6 ZmbZIP26基因在干旱、高溫、高鹽、氮脅迫下的表達(dá)模式分析

通過對ZmbZIP26基因啟動子順式調(diào)控元件分析,發(fā)現(xiàn)其中含有多個脅迫響應(yīng)元件,因此對干旱、高溫、高鹽、氮脅迫處理?xiàng)l件下ZmbZIP26基因在根系中的表達(dá)量進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,干旱、高溫、高鹽、氮脅迫條件下,ZmbZIP26表達(dá)量顯著上調(diào),其中在高鹽、氮脅迫下表達(dá)量上調(diào)15～20倍,干旱、高溫脅迫下表達(dá)量上調(diào)5～10倍(圖6)。在干旱脅迫24 h,表達(dá)量達(dá)到峰值,復(fù)水后表達(dá)量逐步下降;高溫脅迫84 h,表達(dá)量達(dá)到峰值,解除脅迫24 h后表達(dá)量又顯著降低;高鹽脅迫48 h,其表達(dá)量達(dá)到最高,解除脅迫后表達(dá)量顯著降低,但解除脅迫24 h后,表達(dá)量仍高于處理前,推測高鹽脅迫嚴(yán)重傷害了玉米生長;氮處理36 h,其表達(dá)量達(dá)到最高,解除脅迫后表達(dá)量顯著降低。以上結(jié)果表明,ZmbZIP26基因積極響應(yīng)干旱、高溫、高鹽、氮脅迫等非生物脅迫,并且在恢復(fù)生長過程中也起著重要作用。

R.解除脅迫。R.Restoring.

2.7 ZmbZIP26蛋白的亞細(xì)胞定位分析

構(gòu)建載體ZmbZIP26-pMDC83-GFP,利用農(nóng)桿菌法瞬時轉(zhuǎn)化生長較壯的煙草葉片,通過激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),pMDC83-GFP處理在細(xì)胞膜和細(xì)胞核中都檢測到了綠色熒光信號,但ZmbZIP26-pMDC83-GFP處理中,僅在細(xì)胞核中觀察到了綠色熒光信號(圖7),表明ZmbZIP26定位在細(xì)胞核上,屬于核蛋白。

圖7 ZmbZIP26蛋白的亞細(xì)胞定位

2.8 ZmbZIP26的互作蛋白網(wǎng)絡(luò)預(yù)測

為探索ZmbZIP26基因可能的網(wǎng)絡(luò)作用機(jī)制,采用STRING在線預(yù)測了ZmbZIP26的互作蛋白,結(jié)果顯示,與ZmbZIP26互作的蛋白質(zhì)主要有6個功能結(jié)構(gòu)域(表3)。GRMZM2G159402編碼的蛋白質(zhì)包含鋅指蛋白結(jié)構(gòu),是對基因調(diào)控起著十分重要作用的一類轉(zhuǎn)錄因子,主要參與細(xì)胞分化過程[19];GRMZM2G008109編碼的蛋白質(zhì)包含枯草桿菌蛋白酶sbt3.5結(jié)構(gòu),是一類絲氨酸蛋白酶,影響細(xì)胞壁的形成;GRMZM2G018943編碼的蛋白質(zhì)包含翻譯起始因子eIF-2B亞基結(jié)構(gòu),eIF-2B是與細(xì)胞生存緊密相關(guān)的真核起始因子,是多亞基復(fù)合物,參與調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑;GRMZM2G056612編碼的蛋白質(zhì)具有鈣依賴性蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinase,CDPK)活性,是植物鈣信號系統(tǒng)中重要的蛋白激酶;GRMZM2G471517編碼的是NPR1(Nonexpressor of pathogenesis-related genes 1)互作子,能激活細(xì)胞的免疫反應(yīng),保護(hù)植物的生長;gst21是谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶,作為谷胱甘肽結(jié)合反應(yīng)的關(guān)鍵酶,催化谷胱甘肽結(jié)合反應(yīng)的起始步驟,在生物體的防御系統(tǒng)中發(fā)揮著非常重要的作用。推測ZmbZIP26蛋白與互作蛋白共同構(gòu)建了一張調(diào)控網(wǎng)絡(luò),調(diào)控著植物的生長發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答過程。

表3 ZmbZIP26的互作蛋白預(yù)測

3 結(jié)論與討論

目前,在分析非生物脅迫下植物的代謝通路中,轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用[20],前人對茶樹、棉花等植物響應(yīng)非生物脅迫的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序分析,從分子層面解析了非生物脅迫下功能基因和調(diào)節(jié)基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[21-22]。轉(zhuǎn)錄因子在植物非生物脅迫應(yīng)答生理過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用,近年來,在不同物種中bZIP基因家族的功能得到了廣泛的研究,尤其是在擬南芥和水稻中[23-24],在玉米中也有170多個bZIP蛋白被鑒定[25],但迄今為止,只有少數(shù)玉米bZIP基因的功能被報道[26]。本研究通過對玉米幼苗在干旱-復(fù)水過程的根系和葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,篩選到一個響應(yīng)干旱和復(fù)水處理的bZIP轉(zhuǎn)錄因子(ZmbZIP26),基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn),ZmbZIP26處于網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)的核心節(jié)點(diǎn)位置。進(jìn)化樹和保守基序分析顯示,玉米中該蛋白質(zhì)與高粱和芒草的同源性較高,且在相同氨基酸位置具有相同的保守基序;對ZmbZIP26基因ATG上游2 000 bp啟動子序列進(jìn)行順式調(diào)控元件分析,結(jié)果顯示,啟動子序列中包含著與植物的生長發(fā)育、光反應(yīng)、逆境脅迫和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)的結(jié)合位點(diǎn),且參與玉米脫落酸、茉莉酸、水楊酸等多種激素的信號傳導(dǎo)途徑。

本研究發(fā)現(xiàn),ZmbZIP26在玉米的多個組織部位均有表達(dá),表明ZmbZIP26是組成型表達(dá)基因,該結(jié)果與ZmbZIP9、ZmbZIP17、ZmbZIP19等大部分ZmbZIP的研究結(jié)果是一致的[27],但ZmbZIP26在幼莖、雌穗和根中表達(dá)量較高,與其他ZmbZIP基因的表達(dá)模式存在著明顯的差異,可見ZmbZIP基因的表達(dá)模式存在保守性和多樣性。ZmbZIP26基因在干旱、高溫、高鹽、氮脅迫處理?xiàng)l件下根系中的表達(dá)量顯著上調(diào)5～20倍,這與擬南芥和蘋果中的表達(dá)趨勢是一致的[28],解除脅迫后,ZmbZIP26基因表達(dá)量顯著下降,說明ZmbZIP26基因有較強(qiáng)的抗逆性和恢復(fù)補(bǔ)償能力。亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn),ZmbZIP26定位在細(xì)胞核上,這與大多數(shù)的ZmbZIP定位結(jié)果是一致的。轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核大多數(shù)借助核定位信號,使靶基因表達(dá),楊艷歌[29]證實(shí)玉米中ZmbZIP確實(shí)發(fā)揮著轉(zhuǎn)錄因子功能,但也有報道顯示ZmbZIP60定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上[30],擬南芥中AtbZIP60也定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用[31],說明同一家族的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控作用機(jī)制也會存在不同。

為進(jìn)一步研究ZmbZIP26基因的互作網(wǎng)絡(luò)機(jī)制,本研究對ZmbZIP26的互作蛋白進(jìn)行預(yù)測,發(fā)現(xiàn)互作蛋白中包含鋅指蛋白結(jié)構(gòu)、枯草桿菌蛋白酶sbt3.5結(jié)構(gòu)、翻譯起始因子eIF-2B δ亞基、鈣依賴性蛋白激酶、NPR1互作子、谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶21等。鋅指蛋白在植物生長發(fā)育和逆境應(yīng)答中發(fā)揮重要作用,在煙草中CsZFP2基因能夠積極響應(yīng)干旱脅迫,過表達(dá)CsZFP2的轉(zhuǎn)基因植株比野生型植株更具抗旱性[32];OsC3H10的過表達(dá)通過調(diào)控脅迫相關(guān)基因提高了水稻的抗旱性[33]?？莶輻U菌蛋白酶sbt3.5結(jié)構(gòu)在植物果膠甲基酯酶PME17的處理過程中起作用,在根系發(fā)育過程中高度共表達(dá)[34]。鈣依賴性蛋白激酶是一類主要的鈣信號受體,在植物的生長發(fā)育和非生物應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[35]。低溫脅迫下CDPK20基因在山藥中具有調(diào)控功能,提高山藥的耐低溫能力[36];水稻基因OsCDPK7/13過表達(dá)后,轉(zhuǎn)基因植株提高了對鹽脅迫和干旱脅迫的耐受性[37]。NPR1在植物抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要作用,甘蔗ShNPR1基因在煙草對青枯菌(Ralstoniasolanacearum)和茄病鐮刀菌藍(lán)色變種(Fusariumsolanivar.coeruleum)的防御反應(yīng)中起積極作用[38]。因此推測,ZmbZIP26可能與鋅指蛋白、絲氨酸蛋白、鈣依賴性蛋白、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移蛋白等互作構(gòu)建了一張調(diào)控網(wǎng)絡(luò),協(xié)同調(diào)節(jié)玉米生長發(fā)育和脅迫應(yīng)答過程。

綜上,從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選到一個響應(yīng)干旱和復(fù)水處理的bZIP轉(zhuǎn)錄因子ZmbZIP26,基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn),ZmbZIP26處于網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)的核心節(jié)點(diǎn)位置;qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn),該基因?qū)儆诮M成型表達(dá)基因,在幼葉、幼莖、幼根、成熟葉、成熟莖、成熟根、雄穗、雌穗中均有表達(dá),且在幼莖、雌穗和根中的表達(dá)量較高;通過非生物脅迫處理發(fā)現(xiàn),ZmbZIP26基因積極響應(yīng)干旱、高溫、高鹽、氮脅迫和恢復(fù)正常過程,可能在植物的抗逆過程中發(fā)揮著重要作用;亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn),ZmbZIP26屬于核蛋白,定位在細(xì)胞核上;蛋白質(zhì)互作預(yù)測發(fā)現(xiàn),ZmbZIP26可能與鋅指蛋白、絲氨酸蛋白、鈣依賴性蛋白、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移蛋白等互作構(gòu)建了一張調(diào)控網(wǎng)絡(luò),協(xié)同調(diào)控玉米的生長發(fā)育過程和脅迫應(yīng)答過程。研究結(jié)果為揭示ZmbZIP26基因在玉米生長發(fā)育過程和非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)中的作用機(jī)制提供了參考,也為創(chuàng)制抗逆種質(zhì)提供了分子資源。