自擬調(diào)氣湯灌胃對順鉑誘導(dǎo)大鼠腎損傷的修復(fù)作用及其機(jī)制

阿依古麗·買合木提，古扎力努爾·艾爾肯，加依娜提·熱馬贊

1 新疆醫(yī)科大第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，烏魯木齊 830054；2 新疆醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室

順鉑是一種廣譜抗腫瘤藥物，在肺癌及胃癌等消化道腫瘤的治療中廣泛應(yīng)用，但因有腎毒性臨床應(yīng)用受到限制［1］。由順鉑引起的腎毒性通常表現(xiàn)出少尿、蛋白尿及腎小球?yàn)V過率降低等主要臨床特征，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量。以往臨床中對于順鉑引起的腎損傷主要采用甘露醇、氨磷汀等藥物治療，但存在有效率低，患者依從性差，同時易引起電解質(zhì)紊亂等不良反應(yīng)，因此對于順鉑誘導(dǎo)的腎損傷治療藥物的研發(fā)已成為當(dāng)前工作重點(diǎn)。調(diào)氣湯是本課題組以中醫(yī)理論為指導(dǎo)自擬的一種中藥方劑，由黨參、白術(shù)、大黃等藥材組成，具有健脾益氣、燥濕利水、活血行氣的功效。2022年6—12月，我們觀察了自擬調(diào)氣湯對順鉑誘導(dǎo)大鼠腎損傷的修復(fù)作用，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SD 大鼠90 只，雄性，健康清潔級，8 周齡，體質(zhì)量（200 ± 20）g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK（新）2018-0002。大鼠飼養(yǎng)于動物房，光照12 h/d，自由飲食，溫度22～25 ℃，濕度40%～70%。

1.2 主要藥品及試劑、儀器 自擬調(diào)氣湯（黨參20 g，白茅根、土茯苓各30 g，白術(shù)、茯苓、萊菔子、雞內(nèi)金、佩蘭、丹參、川芎、川牛膝各15 g，陳皮、酒大黃、砂仁、清半夏各10 g，紫蘇葉、黃連各12 g），將藥材飲片浸泡至3 000 mL 蒸餾水中4 h，沸水煎煮1 h，過濾，留取濾液，將藥材殘渣置于1 500 mL 水中再次煎煮1 h，過濾，取濾液，合并兩次濾液后，蒸發(fā)濃縮，制成每毫升含5 g 生藥的制劑（北京同仁堂藥業(yè)）；順鉑注射液（江蘇豪森藥業(yè)，規(guī)格6 mL︰30 mg）；氨磷?。ㄉ钲谑匈Y福藥業(yè)，規(guī)格0.5 g）。超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（北京伊塔生物科技有限公司）；丙二醛（MDA）試劑盒（上海廣銳生物科技有限公司）；白介素（IL-1）試劑盒（北京義翹神州科技股份有限公司）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）兔單克隆抗體（上海碧云天生物科技有限公司）；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光法（ECL）化學(xué)發(fā)光液（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；腫瘤壞死因子（TNF）-α試劑盒（本生健康科技有限公司）；IL-6試劑盒（武漢菲恩生物科技有限公司）；Toll 樣受體4（TLR4）、核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）p65 兔抗體、山羊抗兔IgG（艾博抗貿(mào)易有限公司）；蘇木精—伊紅（HE）染色試劑盒、RIPA 裂解液（北京索萊寶科技有限公司）；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）試劑盒（萬類生物科技有限公司）。BX53 顯微鏡（日本Olympus 公司）；himac CR22N 高速冷凍離心機(jī)（艾本德中國有限公司）；200 Pro 多功能酶標(biāo)儀（帝肯貿(mào)易有限公司）；Intas Gel IX Imager凝膠成像儀（德國Royal 公司）；Atellica CH930 全自動生化分析儀（德國西門子公司）；石蠟切片機(jī)（瑞沃德生命科技有限公司）。

1.3 順鉑誘導(dǎo)大鼠腎損傷模型制備、分組及自擬調(diào)氣湯灌胃方法 將90 只大鼠隨機(jī)分為調(diào)氣湯低劑量組、調(diào)氣湯中劑量組、調(diào)氣湯高劑量組、氨磷汀組、模型組、正常對照組各15只。正常對照組不制備模型，其余5 組均參照文獻(xiàn)［2］方法制備腎損傷模型，即尾靜脈注射順鉑（2.5 mg/kg），1次/d，連續(xù)5 d，檢查腎組織病理變化及血清BUN、SCr 水平以驗(yàn)證造模是否成功，若腎組織出現(xiàn)病理性損傷，血清BUN、SCr 顯著升高則認(rèn)為造模成功；造模完成后，調(diào)氣湯低劑量組、調(diào)氣湯中劑量組、調(diào)氣湯高劑量組分別灌胃給予10、20、40 g/kg 調(diào)氣湯，濃度均為5 g/mL（以生藥含量計），氨磷汀組腹腔注射氨磷?。? mg/kg）［3］，模型組和對照組給予生理鹽水，1 次/d，連續(xù)60 d。

1.4 大鼠腎損傷評價指標(biāo)檢測 ①血清BUN、SCR：每組取15 只大鼠，末次給藥24 h 后，按照35 mg/kg 腹腔注射戊巴比妥鈉，取腹主動脈血，4 ℃冰箱靜置1 h，以6 000 r/min速度離心10 min（4 ℃），取上清，使用全自動生化分析儀檢測血清BUN、SCR。②腎組織TNF-α、IL-6、IL-1β、SOD、MDA 檢測每組取15只大鼠，末次給藥24 h取完腹主動脈血后，以頸椎脫臼法處死大鼠，取腎組織4份（各8.5 g），一份置于冰盒上，加入組織裂解液，組織勻漿器勻漿后充分裂解，以8 000 r/min 速度離心10 min（4 ℃），取上清液，使用ELISA試劑盒檢測腎組織TNF-α、IL-6、IL-1β、SOD、MDA。③腎組織病理學(xué)檢查：取“②”處死大鼠腎組織，經(jīng)甲醛（體積分?jǐn)?shù)為4%）固定，制成4 μm 厚的石蠟切片，按照常規(guī)HE 染色方法分別依次使用蘇木精、伊紅染色后，中性樹膠封片，每只大鼠取3張切片，在顯微鏡下。每張切片隨機(jī)取5個視野，觀察病理性改變。

1.5 大鼠腎組織TLR4 和NF-κB mRNA、蛋白檢測 ①腎組織TLR4、NF-κB mRNA：采用RT-qPCR法。取“1.4 中②”處死大鼠腎組織，用PCR 試劑盒提取總RNA 并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)引物序列，使用PCR 儀檢測GAPDH、TLR4、NF-κB mRNA，以2-ΔΔCt表示，采用GAPDH mRNA 表達(dá)量作為參照，以TLR4、NF-κB mRNA 與GAPDH mRNA 的比值記為相對表達(dá)量。②腎組織TLR4、NF-κB 蛋白：采用Western blot 法。取“1.4 中②”處死大鼠腎組織，充分裂解勻漿后，以12 000 r/min 速度離心10 min（4 ℃），取上清，BCA 試劑盒測定總蛋白含量，取含50 μg 蛋白的裂解液，電泳分離，轉(zhuǎn)膜，牛血清白蛋白封閉，TLR4、NF-κB 及GAPDH 兔抗體按照1︰500的比例稀釋后，與蛋白條帶在4 ℃冰箱中孵育12 h，PBST 洗滌3 次，5 min/次，室溫下山羊抗兔IgG（1︰1 000 稀釋）孵育1 h，在凝膠成像儀中使用顯影液成像拍照，結(jié)果以TLR4、NF-κB 灰度值與GAPDH 的比值表示。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK 檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清BUN、SCr 水平比較 各組大鼠血清BUN、SCr水平比較見表1。

表1 各組大鼠血清BUN、SCr水平比較（mmol/L，± s）

表1 各組大鼠血清BUN、SCr水平比較（mmol/L，± s）

注：與正常對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與調(diào)氣湯低劑量組比較，cP<0.05；與調(diào)氣湯中劑量組比較，dP<0.05。

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2.2 各 組 大 鼠 腎 組 織 TNF- α 、IL-6 、IL-1 β 、SOD 、MDA 比較 各組大鼠腎組織TNF- α 、IL-6 、IL-1 β 、SOD 、MDA 比較見表2。

表2 各組大鼠腎組織TNF-α、IL-6、IL-1β、SOD、MDA比較（± s）

表2 各組大鼠腎組織TNF-α、IL-6、IL-1β、SOD、MDA比較（± s）

注：與正常對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與調(diào)氣湯低劑量組比較，cP<0.05；與調(diào)氣湯中劑量組比較，dP<0.05。

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2.3 各組大鼠腎組織病理學(xué)變化 正常對照組大鼠腎組織無異常改變，組織細(xì)胞形態(tài)正常，無病理性改變；與正常對照組比較，模型組腎小球萎縮，腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤，并有纖維化改變，腎小管細(xì)胞壞死、脫落；與模型組相比，給予大鼠不同劑量的調(diào)氣湯后，調(diào)氣湯各劑量組及氨磷汀組腎小球病理學(xué)恢復(fù)，腎間質(zhì)纖維化明顯減輕，炎癥細(xì)胞浸潤減少。見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織病理學(xué)變化（400×）

2.4 各組大鼠腎組織TLR4和NF-κB mRNA、蛋白比較 大鼠腎組織TLR4和NF-κB mRNA、蛋白比較見表3。

表3 各組大鼠腎組織TLR4和NF-κB mRNA、蛋白比較（± s）

表3 各組大鼠腎組織TLR4和NF-κB mRNA、蛋白比較（± s）

注：與正常對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與調(diào)氣湯低劑量組比較，cP<0.05；與調(diào)氣湯中劑量組比較，dP<0.05。

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3 討論

順鉑作為常用的抗腫瘤藥物，其臨床常見不良反應(yīng)為腎損傷，主要以尿量減少、血肌酐升高等腎功能損害為主要臨床特征［4］。臨床中用于預(yù)防和治療順鉑誘導(dǎo)的腎損傷的藥物有限，泮托拉唑、褪黑素、茶堿等藥物用于預(yù)防和治療順鉑誘導(dǎo)的腎損傷的臨床試驗(yàn)均以失敗告終［5］。目前，甘露醇及安磷汀具有顯著的腎損傷修復(fù)作用，且能夠顯著降低順鉑引起的腎損傷發(fā)生率。使用甘露醇治療順鉑引起的腎損傷時患者更容易發(fā)生水、電解質(zhì)紊亂，引起低鈉血癥的發(fā)生［6］。研究［7］證實(shí)，安磷汀能夠顯著降低順鉑相關(guān)腎毒性的發(fā)生率，同時較少引起電解質(zhì)紊亂。然而甘露醇及安磷汀在臨床研究中表現(xiàn)出有效率有限且不良反應(yīng)大等缺點(diǎn)，因此順鉑誘導(dǎo)的腎損傷治療藥物的研發(fā)已成為臨床的迫切需求。

自擬調(diào)氣湯是由本課題組根據(jù)中國古典醫(yī)學(xué)著作中記載的多種調(diào)脾益腎方劑，以中醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)理論為指導(dǎo)重新組合的一種具有調(diào)脾益氣補(bǔ)腎的中藥方劑，方中黨參、白術(shù)、大黃等藥材歸脾、胃經(jīng)，具有養(yǎng)血生津、理氣健脾、利水祛濕等功效；茯苓、川牛膝、白茅根等藥材歸脾、腎經(jīng)，具有涼血清熱、化瘀通經(jīng)、利尿通淋等功效；川芎、丹參等藥材歸肝、心包經(jīng)，具有活血行氣、涼血通經(jīng)等功效。BUN 及SCr 作為臨床中常用的腎功能評價指標(biāo)，其水平升高提示腎功能下降［8］；TNF-α、IL-6、IL-1β 是常用的反映體內(nèi)炎癥反應(yīng)發(fā)生及進(jìn)展的體內(nèi)敏感的炎癥信號分子，炎癥反應(yīng)時TNF-α、IL-6、IL-1β 水平則會顯著升高［9］；SOD 作為腎組織中典型的抗氧化損傷分子，其是敏感的氧化應(yīng)激損傷標(biāo)志物，組織細(xì)胞受損時其水平降低，MDA 是機(jī)體脂質(zhì)氧化的終產(chǎn)物，其水平的升高是細(xì)胞氧化損傷的典型表現(xiàn)［10］。本文結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠血清BUN 及SCr 水平升高，提示腎功能下降；同時腎組織TNF-α、IL-6、IL-1β 及MDA 升高，SOD 下降，提示大鼠腎組織出現(xiàn)明顯的氧化應(yīng)激損傷及炎癥反應(yīng)。與模型組比較，給予大鼠不同劑量調(diào)氣湯后，大鼠血清BUN 及SCr水平明顯降低，腎功能明顯好轉(zhuǎn)，同時腎組織炎癥因子水平下降，MDA 水平降低，SOD 水平升高，提示調(diào)氣湯起到活血化瘀，利尿通淋，行氣生津之功效，進(jìn)而修復(fù)大鼠腎組織的炎癥損傷及氧化應(yīng)激損傷。

TLR蛋白家族是機(jī)體產(chǎn)生非特異性免疫過程中不可或缺的重要蛋白家族，也是連接特異性免疫及非特異性免疫的重要信號傳遞分子，TLR4是該家族的主要成員之一［11］。近年來研究［12］發(fā)現(xiàn)，TLR4的異常激活是誘導(dǎo)腎臟損傷的重要因素，同時機(jī)體炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生及傳遞也與該蛋白密切相關(guān)。NF-κB通路及上下游相關(guān)蛋白的激活與炎癥反應(yīng)加重有關(guān)［13］。在正常機(jī)體細(xì)胞中，NF-κB 與其抑制蛋白以非活性復(fù)合物的形式存在，在外源性刺激及毒性代謝產(chǎn)物的作用下，會促進(jìn)其抑制蛋白的磷酸化，進(jìn)而與NF-κB 解離，激活NF-κB 通路。研究［14］表明，NF-κB 能夠通過誘導(dǎo)激活天然免疫系統(tǒng)，從而介導(dǎo)急、慢性腎臟疾病的發(fā)病過程，并與多種腎臟疾病的發(fā)病及疾病轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。陳華等［15］發(fā)現(xiàn)，TLR4、NF-κB 水平的升高與大鼠腎組織炎癥損傷密切相關(guān)，抑制TLR4、NF-κB的異常激活能夠改善大鼠腎功能，緩解腎組織損傷；姜瑞鳳等［16］認(rèn)為，TLR4/NF-κB通路的異常激活會導(dǎo)致腎損傷的發(fā)生，而松果菊苷能夠通過抑制TLR4/NF-κB 通路進(jìn)而發(fā)揮其抗炎及腎損傷修復(fù)作用，由此可見TLR4/NF-κB 通路在腎損傷相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。本研究給予順鉑引起的腎損傷大鼠調(diào)氣湯，大鼠腎組織TLR4、NF-κB 隨調(diào)氣湯劑量增加逐漸降低，同時體內(nèi)炎癥因子減少及抗氧化應(yīng)激相關(guān)分子水平則明顯升高，表明調(diào)氣湯能夠呈劑量依賴性抑制順鉑誘導(dǎo)腎損傷后腎組織TLR4/NF-κB 通路的激活，逆轉(zhuǎn)順鉑對腎組織造成的病理性損傷，同時修復(fù)受損腎細(xì)胞，恢復(fù)腎功能。

總之，自擬調(diào)氣湯具有顯著的腎功能恢復(fù)作用，其可能通過調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB 信號通路，提升腎組織抗氧化應(yīng)激能力，抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生及進(jìn)展，進(jìn)而修復(fù)腎組織病理損傷。