氫氧化鑭灌胃對大鼠慢性腎功能衰竭高磷血癥的治療作用及其機制

王魯豫，高原，王琪雯，王勝男，元曉榮，張春生，日瓦德，李剛

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，呼和浩特 010110

成人腎臟的自我再生和恢復(fù)能力非常有限，隨著年齡的增長、受傷或各種疾病的出現(xiàn)，成人腎功能會下降，當(dāng)腎功能下降到一定程度時會發(fā)展為慢性腎臟病（CKD）［1-3］。慢性腎功能衰竭高磷血癥是慢性腎臟疾病患者常見的并發(fā)癥之一，臨床主要采用磷酸鹽結(jié)合劑或非磷酸鹽結(jié)合劑治療，然而這些藥物治療效果有限，且可能伴有不良反應(yīng)。氫氧化鑭（LH）是一種磷酸鹽結(jié)合劑，通過降低血液磷水平而抑制血管鈣化形成［4-5］，且伴隨有改善慢性腎功能衰竭高磷血癥持續(xù)發(fā)展的作用，但其可能的機制并未被發(fā)現(xiàn)。本研究觀察了LH 對大鼠慢性腎功能衰竭高磷血癥的治療作用，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6 周齡雄性Wistar 大鼠30 只，體質(zhì)量（200 ± 20）g，購自維通利華生物科技有限公司（北京，SCXK 2016-0006）。飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心屏障區(qū)大鼠飼養(yǎng)間，大鼠維持在12 h 的光/暗循環(huán)中，環(huán)境溫度為21～22 ℃，濕度為40%～50%，自由飲食。實驗開始前，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后進行后續(xù)實驗。

1.2 主要試劑及儀器 1.2%高磷飼料（北京科奧協(xié)力飼料有限公司，2021070107）；烏拉坦（DC08BA 0021，生工生物工程（上海）股份有限公司）；LH（實驗室合成，批號：2020 年9 月，純度：96%）；腺嘌呤（CAS：7324-5，Sigma-Aldrich）；磷檢測試劑盒（C006-1-1，南京建成生物工程研究所）；肌酐測定試劑盒（C011-2-1，南京建成生物工程研究所）；鈣測定試劑盒（C004-2-1，南京建成生物工程研究所）；尿素氮檢測試劑盒（南京建成生物工程學(xué)院C013-2-1）。Mo?lecular Devices 多功能酶標(biāo)儀（Spectra Max i3x，美谷分子儀器有限公司）；高速冷凍離心機（3-18K，Sig?ma）；Leica 顯微鏡（Gmb H，Wetzlar，Germany LEICA DM 2000）；脫水機（Donatello，DIAPATH）；包埋機（JB-P5，武漢俊杰電子有限公司）；病理切片機（RM2016，上海徠卡儀器有限公司）；凍臺（JB-L5，武漢俊杰電子有限公司）；組織攤片機（KD-P，浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）。

1.3 大鼠慢性腎功能衰竭高磷血癥模型制備及LH給予方法 30只Wistar大鼠按隨機數(shù)字表分為對照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組。對照組不制備慢性腎功能衰竭高磷血癥模型，模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組制備慢性腎功能衰竭高磷血癥模型，即大鼠每日灌胃2% 腺嘌呤混懸液（200 mg/kg），連續(xù)2周；在3～4周內(nèi)，所有模型大鼠隔天灌注腺嘌呤混懸液；在4周末，從大鼠眼底靜脈叢采血，利用Ca、PI、Scr、BUN 試劑盒測定Ca、PI、Scr、BUN，與對照組相比，模型組肌酐、尿素氮、磷和鈣水平顯著性升高，則證明慢性腎功能衰竭高磷血癥大鼠模型建立成功。制模成功后，低劑量組、中劑量組、高劑量組灌胃給予0.1、0.2、0.4 g/kg 的LH，共8周；模型組和對照組不予處理。

1.4 大鼠血清Ca、PI、Scr、BUN 檢測 給藥8 周后，分別從腹主動脈采集各組大鼠血液樣本，分離血清，并將其保存在-80 ℃環(huán)境中。采用Ca、PI、Scr、BUN試劑盒檢測各組血清Ca、PI、Scr、BUN。

1.5 大鼠腎臟組織病理學(xué)檢測 給藥8 周末處死動物，并取腎臟組織，保存于-80 ℃環(huán)境中。取對照組、模型組、低、中、高劑量組大鼠腎臟組織，分別行HE 染色和Masson's 染色。HE 染色步驟：將腎臟組織切片固定，用蘇木精染色使細(xì)胞核呈藍(lán)色，在酸性溶液中漂洗去除多余的染料，接著用酸性染料染色。最后，使用脫水劑轉(zhuǎn)移染料并加入透明劑，在顯微鏡下觀察。Masson's 染色步驟：固定腎臟組織切片，溶解蠟質(zhì)，用檸檬黃或橙G 染色使肌纖維、膠原和骨質(zhì)呈黃色或橙色，洗去多余染料，再用苯胺藍(lán)染色，最后轉(zhuǎn)移染料并加入透明劑，在顯微鏡下觀察組織切片。

1.6 大鼠腎功能差異代謝物篩選 處死前將所有動物提前1 天放入代謝籠，收集大鼠尿液，保存于-80 ℃環(huán)境中，備用。將對照組、模型組及低、中、高劑量組尿液樣品與預(yù)冷的甲醇按1︰3 的比例孵育10 min 以沉淀蛋白質(zhì)。在4 ℃下以12 000 r 的速度離心15 min，收集上清液待測。QC：取各組上清液等比混合后加3 倍甲醇等比混合后待測。QC 樣本聚合較集中，說明儀器運行穩(wěn)定，數(shù)據(jù)可靠，所建立方法可行，可用于后續(xù)大批量進樣。5 組待測尿液樣品上清液用Dionex Ulti Mate 3000 快速分辨率液相色譜儀和Q Exactive 質(zhì)譜儀分析。UPLC 色譜條件：Hypersil GOLD 色譜柱（100×2.1 mm，1.9 μm），流速為0.35 mL/min；進樣量為5 μL；流動相A：0.1%甲酸水溶液，流動相B：乙腈。梯度洗脫梯度，0～1 min，98%A；1～9 min，2%A；9～12 min，2%A；12～12.1 min，98%A；12.1～15 min，98%A。質(zhì)譜條件：使用電噴霧離子化源（ESI），溫度為350 ℃；毛細(xì)管內(nèi)電壓為3.8/3 kV；離子傳輸管溫度為320 ℃；鞘氣壓為40 arb；輔助氣壓為10 arb。采集質(zhì)量范圍為50～1 000 m/z。將上述液質(zhì)條件下采集到的尿液中小分子代謝物原始數(shù)據(jù)進行以下分析預(yù)測可能的代謝物和代謝通路［6-7］。a. 根據(jù)QC 樣本的變異系數(shù)（CV），篩選所獲得數(shù)據(jù)矩陣CV<30%的變量，減少來自基線或噪聲變量的影響；b. 利用軟件SIMCA-P（v14.1）進行主成分分析（PCA）［8］和正交—偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）［9］，了解組間變化趨勢；對不同組別的尿液代謝產(chǎn)物進行分析。c. 根據(jù)一級質(zhì)譜信息分析不同離子模式下特征峰保留時間、質(zhì)核比，并利用二級碎片信息搜庫（HMDB、Metlin、Mo?NA以及帕諾米克自建標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)庫）進行比對。d.利用MetaboAnalyst 分析工具對篩選到的差異性代謝物進行代謝通路分析。變量對投影值的影響被用來確定值VIP>1.0 和P<0.05 的顯著變量。使用顯著變量來識別光譜峰。用Spearman 相關(guān)系數(shù)評估屬的豐度與大鼠行為的相關(guān)性。

1.7 大鼠腎功能差異代謝物GO 功能、KEGG 富集分析 對模型組和對照組、模型組和高劑量組的尿液樣本篩選到的差異代謝物進行GO 功能和KEGG富集分析。對差異代謝物進行預(yù)處理，包括數(shù)據(jù)歸一化和過濾低表達(dá)代謝物。GO功能富集分析：對目標(biāo)代謝物進行GO 功能富集分析。使用在線工具Enrichr或R包clusterProfiler 進行分析。將差異代謝物列表輸入到相應(yīng)的工具，選擇物種和GO 數(shù)據(jù)庫版本。進行富集分析，獲取富集的GO 術(shù)語和相關(guān)統(tǒng)計結(jié)果。通過設(shè)定一定的統(tǒng)計指標(biāo)（如p 值或FDR 校正的p 值）來確定顯著富集的GO 術(shù)語。KEGG 分析主要針對于生物體中的代謝通路進行分析：即對GO富集到的代謝物進行KEGG功能富集分析，其余操作步驟同GO分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Graph Pad Prism 8.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 給藥8 周后各組大鼠血清Ca、PI、Scr、BUN 水平比較 大鼠血清Ca、PI、Scr、BUN 水平比較見表1。

表1 給藥8周后各組大鼠血清Ca、PI、Scr、BUN水平比較（± s）

表1 給藥8周后各組大鼠血清Ca、PI、Scr、BUN水平比較（± s）

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與低劑量組比較，＃P<0.05；與中劑量組比較，▲P<0.05。

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2.2 各組腎臟組織病理學(xué)變化 對照組腎小球內(nèi)皮細(xì)胞呈扁平形狀；腎小管上皮細(xì)胞呈立方形狀；細(xì)胞核呈深紫色，胞質(zhì)呈粉紅色，基底膜呈現(xiàn)出深染色；腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞染色均勻，細(xì)胞核清晰可見，細(xì)胞形態(tài)規(guī)整。與對照組相比，模型組大鼠腎臟樣本顯示出許多囊性擴張的小管、腺嘌呤結(jié)晶、蛋白鑄型和腎小球壞死皺縮；腎間充質(zhì)細(xì)胞伴有大量的炎癥細(xì)胞浸潤和間充質(zhì)纖維化。低劑量組及中劑量組和高劑量組腎損傷、腎小管囊性擴張、炎癥細(xì)胞浸潤均得到改善，高劑量改善更為明顯，顯著減輕了腎小管囊性擴張、炎癥細(xì)胞浸潤以及纖維化程度，且LH 呈劑量依賴性延緩大鼠腎損傷（詳見圖1～2）。

圖1 各組大鼠腎臟組織病理學(xué)變化（HE染色）

圖2 各組大鼠腎臟組織病理學(xué)變化（Masson's染色）

2.3 大鼠腎功能差異代謝物篩選結(jié)果 用液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀對五組動物尿液進行鑒定，正離子模式下共鑒定出4 370 個變量和負(fù)離子模式下732個變量。對高劑量組和模型組中檢測到的代謝物進行差異篩選，共檢測出47 個差異代謝物。其中，正離子模式篩選出9 個差異代謝物，負(fù)離子模式篩選出38個差異代謝物。由于空間的限制，箱線圖最多顯示了50 個特征。密度圖是基于所有的樣本而繪制的。我們歸一化前后的Box 圖和核密度圖（圖3A）。PCA 顯示，低劑量組、中劑量組、高劑量組尿液樣本間組分有很好的重復(fù)性均無明顯分離趨勢（圖3B～C）。接下來，我們又計算了一下每組離散情況（圖3D），QC 作為數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)。PLS-DA 得分圖可看出代謝物分離良好，在給藥組內(nèi)的離散度減小。該模型具有較高的解釋率和預(yù)測率（R2Y=0.92 和Q2Y=0.92）（圖3E～F）。排列實驗表明，R2和Q2截距分別為0.49和0.013。

圖3 各組大鼠尿液小分子代謝物分析及PCA、PLS-DA分析圖

2.4 大鼠腎功能差異代謝物GO 功能、KEGG 富集分析結(jié)果 根據(jù)以上結(jié)果，我們進行了模型和對照組、模型和高劑量組之間的S-plot 分析。由圖可見，組別間分散程度較高，代謝物差異顯著（圖4A、B）。通過相關(guān)分析將高劑量和模型組中47 個差異代謝物在各組中的表達(dá)情況根據(jù)VIP值和P值進行組間差異代謝物的篩選（圖4C）。共篩選出25 種顯著差異代謝物，分別為DL-瓜氨酸、2，3-前列腺素、鳥氨酸、2-磺氧基甲基、對羧基苯磺酰胺、1，2-二甲基呋喃-5-、3-苯基磺酰胺醛、對羥基苯乙烯酯、精氨酸、氯胺酮、L-阿拉伯糖醇、4-脫甲基葡萄堿、D-丙氨酰-D-丙氨酸、6-叔丁基磺酸、氨基二環(huán)二羧酸、1D-肌醇、乙酸-2-氨基二酸、α-氨基己二酸半醛、γ-氨基丁酸、11-4-氯苯胺、7-甲基黃嘌呤、β-D-葡萄糖核酸、α-胸腺肽、3-脫氧-D-甘露-2-新酮糖酸銨（圖4C）。由圖可以得出瓜氨酸、2，3-前列腺素、鳥氨酸、2-磺氧基甲基、對羧基苯磺酰胺、1，2-二甲基呋喃-5-、3-苯基磺酰胺 醛、對羥基苯乙烯酯、精氨酸、氯胺酮在高劑量組高表達(dá)（圖4C）。接下來，我們又通過GO 篩選高劑量和模型組中標(biāo)志性差異代謝物富集到代謝途徑，篩選出25 條代謝途徑，其中尿素循環(huán)較為顯著（圖4D）。將25 條代謝途徑通過KEGG 富集分析顯示，與慢性腎功能衰竭高磷血癥相關(guān)的代謝通路共8 條，分別為精氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝、戊糖和葡萄糖酸鹽相互轉(zhuǎn)換、磷酸戊糖途徑、賴氨酸降解途徑、D-谷氨酰胺和谷氨酸代謝、抗壞血酸鹽和醛酸鹽代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝（圖4E）。

圖4 對照組和模型組的S-plot分析及高劑量組和模型組的S-plot、GO、KEGG分析圖

3 討論

慢性腎功能衰竭高磷血癥是慢性腎臟疾病患者常見的并發(fā)癥之一，其臨床特征包括：①高磷血癥：血清磷濃度升高是慢性腎功能衰竭高磷血癥的主要特征［10］。正常情況下，腎臟能夠調(diào)節(jié)磷的排泄，但在腎功能不全的情況下，磷的排泄減少，導(dǎo)致血磷濃度升高。②骨骼病變：高磷血癥會導(dǎo)致鈣磷代謝紊亂，進而引起骨骼病變，如骨質(zhì)疏松和骨折。③血管鈣化：高磷血癥會促進血管內(nèi)鈣化，增加動脈粥樣硬化和心血管事件的風(fēng)險。④肌肉癥狀：高磷血癥還可引起肌肉癥狀，如肌無力和肌肉痙攣［11-13］。在過去，治療慢性腎功能衰竭高磷血癥主要采用磷酸鹽結(jié)合劑，如磷酸鋁凝膠或碳酸鈣，以幫助降低血磷濃度。這些藥物通過與食物中的磷結(jié)合，減少磷的吸收。此外，還可以采用非磷酸鹽結(jié)合劑，如鈣離子交換樹脂（如醋酸鈣），以增加磷的排泄。然而這些藥物治療高磷血癥的效果有限，且可能伴有不良反應(yīng)，如鈣負(fù)荷過高導(dǎo)致高鈣血癥。因此，近年來一些新型藥物被引入臨床，如鑭制劑，其與磷結(jié)合形成不溶性磷酸鑭鹽在腸道內(nèi)排除，從而減少磷酸鹽的吸收，且不影響維生素吸收且無明顯毒性?？偟膩碚f，治療慢性腎功能衰竭高磷血癥的藥物多樣，效果因個體差異而異［14］。

LH是一種磷酸鹽結(jié)合劑，用于治療慢性腎功能衰竭高磷血癥。其藥理學(xué)特征包括：①磷酸鹽結(jié)合作用：LH 能夠與食物中的磷酸鹽結(jié)合，形成不溶性的鑭磷酸鹽，從而減少磷的吸收。這樣可以降低血磷濃度，從而緩解慢性腎功能衰竭高磷血癥的癥狀。②高選擇性：LH 對磷酸鹽具有高度選擇性，不會與其他重要的陽離子（如鈣、鎂、鋁等）結(jié)合，從而減少了與其他礦物質(zhì)的相互作用和不良反應(yīng)的可能性。③鑭離子毒性較低：相比于其他稀土元素，鑭離子的毒性較低。研究［4］表明，LH 的劑量在治療范圍內(nèi)時，對腸道和骨骼沒有明顯的毒性影響。另外，LH 能夠有效地降低血磷濃度，并且與傳統(tǒng)的磷酸鹽結(jié)合劑相比，其不良反應(yīng)更少。此外，LH 還可以改善患者的生活質(zhì)量，并減少骨骼病變和血管鈣化的發(fā)生［5］。通過本文結(jié)果可知，與模型組相比，給予LH 各劑量組治療后慢性腎功能衰竭高磷血癥大鼠血清磷、肌酐、尿素氮水平均顯著降低，且LH 具有劑量依賴性；另外，在LH 治療后，腎損傷、腎小管囊性擴張和炎癥細(xì)胞浸潤均得到改善；高劑量組更優(yōu)，顯著減輕了腎小管囊性擴張、炎癥細(xì)胞浸潤以及纖維化程度，且LH 呈劑量依賴性延緩慢性腎功能衰竭高磷血癥大鼠腎損傷。因此推斷，LH對大鼠慢性腎功能衰竭高磷血癥具有治療作用［15］。

本研究我們使用了代謝組學(xué)來預(yù)測慢性腎功能衰竭高磷血癥大鼠有效候選藥物的可能機制。在以前的代謝組學(xué)研究中，通常給大鼠注射代謝物來觀察代謝流的變化［16-17］。本文結(jié)果顯示，瓜氨酸、鳥氨酸、精氨酸為尿素循環(huán)代謝途徑的主要氨基酸，參與腎臟代謝。在人體內(nèi)，精氨酸主要參與尿素循環(huán)的代謝過程［18］。精氨酸激發(fā)的第一個活性酶就是參與尿素循環(huán)的有五個主要的酶之一，腎臟也包含所有尿素循環(huán)酶。在尿素循環(huán)的兩個關(guān)鍵步驟中，精氨酸主要來源于瓜氨酸、鳥氨酸合成。肝臟和腎臟都通過尿素循環(huán)（也稱為鳥氨酸循環(huán)）將氨轉(zhuǎn)化為尿酸和尿素。尿素循環(huán)和多胺代謝、一氧化氮合成、檸檬酸循環(huán)和精氨酸代謝之間的代謝聯(lián)系使數(shù)據(jù)解釋變得復(fù)雜。腎衰竭的患者當(dāng)血液中精氨酸處于低水平時，補充適量的精氨酸，對患者是有益的。我們的結(jié)果表明，口服LH 可以促進大鼠精氨酸的吸收來介導(dǎo)尿素循環(huán)，進而延緩腎損失。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)慢性腎功能衰竭高磷血癥導(dǎo)致的腎臟谷氨酸合成減少。另外，精氨酸的腸道吸收涉及一個與賴氨酸、鳥氨酸和胱氨酸共享的運輸系統(tǒng)［19］。該轉(zhuǎn)運系統(tǒng)依賴于三磷酸腺苷和鈉，并具有底物特異性。理論上，該轉(zhuǎn)運體在慢性腎功能衰竭高磷血癥存在時可能會受到影響。一例人類短腸綜合征和慢性腎功能衰竭相關(guān)的繼發(fā)性高氨血癥已被報道。同時鳥氨酸血漿水平的下降支持了這一理論。因此，補充精氨酸、瓜氨酸，以促進尿素循環(huán)，降低血氨，有利于延緩慢性腎損傷［20-21］。

總之，LH 可能通過尿素循環(huán)、精氨酸代謝等途徑來改善慢性腎功能衰竭高磷血癥大鼠腎功能持續(xù)衰竭的作用，并且高劑量LH效果更顯著。