嗜熱鏈球菌S131對巨噬細胞的免疫調(diào)節(jié)作用研究

李旭陽,郭潤晴,路江浩,鄢夢潔,張鵬,劉明月,楊玲

(河北一然生物科技股份有限公司,河北 石家莊,050800)

益生菌制劑是天然的免疫激活劑,可以激活巨噬細胞并提高干擾素的含量,激活機體免疫力和抗病能力[1]。當益生菌進入機體后,其可定殖于腸道并繁殖,在機體消化過程中可以產(chǎn)生多種維生素、氨基酸、過氧化氫和乳酸等物質(zhì),可抑制腸道內(nèi)病原菌的生產(chǎn)繁殖,維持腸道健康,促進機體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收[2-3]。

免疫是機體通過識別和排除抗原性異物,從而保持體內(nèi)外環(huán)境穩(wěn)定的一種特異性生理反應[4]。在新冠疫情的大環(huán)境下,如何提升機體免疫力引起了越來越多人的關注。機體的細胞免疫應答過程主要由T細胞介導,有研究表明,鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus,LGG)能夠促進動物腸道T淋巴細胞的有效增殖,表現(xiàn)為成熟T淋巴細胞(CD3+)和輔助性T細胞(CD4+)數(shù)量升高[5];WANG等[6]通過在飼料中添加植物乳桿菌和低聚果糖,顯著提高了動物血清中IgG和IgA含量,從而有效介導機體體液免疫應答反應;此外,腸道免疫屏障作為腸道黏膜免疫系統(tǒng)的第一道防線,益生菌能夠通過對細胞因子分泌量的調(diào)節(jié)來改善腸道免疫屏障功能,例如,動物腸道白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)、Toll樣受體2和γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ)的基因表達可經(jīng)唾液乳桿菌B1進行增強[7],同時,植物乳桿菌ZLP001能夠?qū)Ξa(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(enterotoxigenicEscherichiacoli,ETEC)誘導的動物小腸上皮細胞中IL-6、IL-8以及TNF-α分泌的增加產(chǎn)生顯著的抑制作用[8];YANG等[9]報道證實,植物乳桿菌通過NF-κB和MAPK信號通路能夠在一定程度上抑制ETEC K88誘導的IL-6、IL-8、TNF-α和IL-1α表達的增強及抗炎細胞因子PPAR-γ表達的減弱。目前,益生菌及其制劑對機體免疫功能的調(diào)節(jié)機制的研究已經(jīng)日趨全面,然而,對于某單個菌株腸道定殖穩(wěn)定性及其免疫調(diào)節(jié)機制的綜合研究較少。

對于人體,具有較強腸道定殖穩(wěn)定特性的益生菌菌株更能夠有效地發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)機制,從而增強人體免疫力。因此,本研究主要針對嗜熱鏈球菌S131腸道定殖穩(wěn)定性及其對巨噬細胞免疫調(diào)節(jié)的功能特性進行研究,并對其提升免疫力的作用機制進行解析,為益生菌及其免疫力調(diào)節(jié)功能產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯化鈉、三氯乙酸、95%(體積分數(shù))乙醇、苯酚、濃硫酸、透析袋(10 kDa)、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)、青鏈霉素混合液、CCK-8試劑盒、0.4%臺盼藍染色液,生工生物工程(上海)股份有限公司;MRS液體培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基,北京陸橋技術股份有限公司;2型豬胃黏蛋白(Sigma M2 378-100G)、吐溫20、曲拉通X-100,生工生物工程(上海)股份有限公司;DMEM高糖培養(yǎng)液,美國Invitrogen公司;快速細胞凍存液(無血清),上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司;脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),美國Sigma公司;中性紅細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒,碧云天;ELISA試劑盒,北京四正柏生物科技有限公司;DMEM完全培養(yǎng)液由90%(體積分數(shù))的DMEM、10%(體積分數(shù))的胎牛血清和1%(體積分數(shù))的青鏈霉素混合液組成。

1.2 儀器與設備

CX41顯微鏡,日本奧林巴斯公司;Micro21R離心機、Multiscan Go多功能酶標儀,美國Thermo公司;Accri C6 Plus流式細胞儀,君曉電子。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株活化富集及細胞培養(yǎng)

將嗜熱鏈球菌S131和陽性對照組鼠李糖乳桿菌LGG在MRS液體培養(yǎng)基中活化3代及以上,分別離心后收集各菌泥;用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液對菌泥進行重懸,0.9%(體積分數(shù))生理鹽水對重懸菌液進行梯度稀釋,用流式細胞儀檢測菌液濃度,調(diào)整菌液濃度1.5×108CFU/mL左右,得到活菌菌懸液。滅活菌菌體收集同上,重懸菌體,置于80 ℃水浴鍋中30 min進行滅活,鹽水稀釋后調(diào)整菌懸液濃度為1.5×108CFU/mL左右。

將RAW264.7細胞于含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液中復蘇,于37 ℃、5%(體積分數(shù))CO2細胞培養(yǎng)箱中進行孵育,待細胞生長狀態(tài)良好且密度達80%左右進行傳代,傳代3次后進行后續(xù)實驗。

1.3.2 菌株黏附能力測定

向96孔板中各孔加入100 μL質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL黏蛋白溶液,4 ℃過夜孵育,向過夜孵育后的96孔板中每孔加入含1%(體積分數(shù))吐溫20的PBS封閉1 h;去除PBS后,向各孔中加入菌懸液,每組3個平行,空白對照組加入PBS,37 ℃孵育3 h,待孵育完畢后,加入含0.05%吐溫20的PBS,清洗2次,去除未黏附的菌,在60 ℃烘箱中干燥1 h;干燥后向每孔加入結(jié)晶紫溶液,室溫放置染色45 min;PBS清洗后加入無水乙醇,靜置10 min;于595 nm波長下使用酶標儀測各孔的吸光值[10]。

1.3.3 菌株產(chǎn)胞外多糖能力檢測

參考李嘉文等[11]的方法對待測菌懸液中的胞外多糖進行粗提取,樣品測定采用苯酚-硫酸法[12],建立葡萄糖標準曲線,并依據(jù)標準曲線方程計算胞外多糖含量。

1.3.4 菌株對細胞增殖和吞噬能力影響的實驗

用自動細胞計數(shù)儀檢測1.3.1節(jié)中活化后的細胞數(shù)量并調(diào)整細胞濃度為1.5×105個/mL,接種于96孔板,每孔100 μL細胞懸液在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜孵育。

細胞貼壁后,棄去上清液,每孔加入100 μL細胞培養(yǎng)液(DMEM培養(yǎng)基,10%胎牛血清)和100 μL的活菌菌懸液或滅活菌懸液(1.3.1節(jié)中已調(diào)整好),空白對照組為100 μL細胞培養(yǎng)液,每組5個重復,在37 ℃、5% CO2條件下活菌組與RAW264.7細胞一起孵育4 h,滅活菌組與細胞RAW264.7一起孵育24 h。

用CCK-8法檢測細胞活性及增殖情況[13-14]。按公式(1)計算細胞增殖率:

(1)

式中:As表示各個實驗組OD值;Ac表示空白對照組OD值。

中性紅試劑盒檢測細胞吞噬效果[15-16]。按公式(2)計算細胞吞噬率:

(2)

式中:As表示各個實驗組OD值;Ac表示空白對照組OD值。

1.3.5 菌株對細胞免疫因子分泌能力影響的測定

RAW264.7細胞以2×105個/mL濃度接種于24孔板中,待細胞貼壁后,去除上清液,進行不用分組試驗。各組設置如下(每組5個重復):

陰性對照組(DMEM):各孔中加100 μL DMEM,陰性對照組一孵育4 h,陰性對照組二孵育24 h;陽性對照組(LPS):加入LPS,陽性對照組一孵育4 h,陽性對照組二孵育24 h;LGG組:各孔中加100 μL鼠李糖乳桿菌LGG活菌菌懸液或滅活菌菌懸液,活菌組孵育4 h(24 h)。S131組:各孔中加100 μL嗜熱鏈球菌S131活菌菌懸液或滅活菌菌懸液,活菌組孵育4 h(24 h);競爭組(S131+LPS):在各孔中同時加入LPS和嗜熱鏈球菌S131活菌菌懸液或滅活菌菌懸液,活菌組孵育4 h(24 h);預防組(S131+LPS):各孔中先加入嗜熱鏈球菌S131活菌菌懸液或滅活菌菌懸液,然后再加入LPS,活菌組孵育4 h+4 h(12 h+12 h);治療組(LPS+S131):各孔中先加入LPS,然后再加入嗜熱鏈球菌S131活菌菌懸液或滅活菌菌懸液,活菌組孵育4 h+4 h(12 h+12 h)。(注:括號內(nèi)的時間為滅活菌需孵育時間,孵育均于37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中進行。)

收集細胞培養(yǎng)上清液,1 000 r/min離心10 min后分裝到無菌離心管中,-80 ℃保藏備用。

按ELISA試劑盒說明書測定上述7種不同組中的TNF-α、IL-6和IL-10的細胞因子的分泌量[17-18]。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株黏附能力的測定

通過對不同菌株黏附能力的檢測試驗,結(jié)果顯示,嗜熱鏈球菌S131和鼠李糖乳桿菌LGG菌株的活菌與滅活菌均顯示出一定的黏附能力。同一菌株(嗜熱鏈球菌S131或鼠李糖乳桿菌LGG)的活菌與滅活菌的黏附能力未表現(xiàn)出顯著性差異,通過對比不同菌株的黏附能力檢測結(jié)果,發(fā)現(xiàn)活化3代之后的嗜熱鏈球菌S131相較于鼠李糖乳桿菌LGG,其活菌和滅活菌株均表現(xiàn)出較強的黏附能力,且滅活菌結(jié)果具有顯著性差異(P<0.01),結(jié)果見圖1。從該結(jié)果可以推論,具有較好黏附能力的嗜熱鏈球菌S131,也應具備更加優(yōu)異的機體腸道定殖穩(wěn)定性潛力。該結(jié)論可以為嗜熱鏈球菌S131益生菌相關產(chǎn)品的開發(fā)與創(chuàng)新提供腸道定殖穩(wěn)定性的理論依據(jù),為后續(xù)研究提供良好的基礎。

圖1 菌株黏附實驗各組吸光度值

2.2 嗜熱鏈球菌S131菌株產(chǎn)胞外多糖能力檢測

以MRS為對照組,葡萄糖標準曲線為y=0.005x-0.01,R2=0.998時胞外多糖含量為(304.2±0.416 3) μg/mL[19]。同條件下,嗜熱鏈球菌S131的胞外多糖產(chǎn)量測定結(jié)果為(444.2±2.013) μg/mL,存在極顯著差異(P<0.000 1)。研究表明,不同乳酸菌產(chǎn)胞外多糖的能力不同,產(chǎn)量大致在25～600 μg/mL[20]。本研究結(jié)果S131胞外多糖的產(chǎn)量在合理范圍之內(nèi)。此外,胞外多糖作為一種具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤和調(diào)節(jié)機體免疫的作用的活性生物大分子[21-22],嗜熱鏈球菌S131高產(chǎn)胞外多糖的生物特性,為其在調(diào)節(jié)免疫功能方面的應用提供理論依據(jù)。同時,結(jié)合糖代謝和生物信息學分析研究其菌株遺傳背景,為運用基因工程獲得高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)胞外多糖菌株奠定基礎。

2.3 嗜熱鏈球菌S131對巨噬細胞增殖和吞噬能力的影響

通過對嗜熱鏈球菌S131對RAW264.7細胞增殖和吞噬試驗結(jié)果進行分析。如圖2所示,嗜熱鏈球菌S131的活菌與滅活菌對巨噬細胞均具有一定的促增殖能力;且進一步試驗研究表明,在同為活性菌株或者同為滅活菌株條件下,嗜熱鏈球菌S131對巨噬細胞的增殖能力高于鼠李糖桿乳菌LGG,且無顯著性差異。

圖2 不同菌株處理RAW264.7細胞的增殖率

如圖3所示,嗜熱鏈球菌S131的活菌與滅活菌均可促進巨噬細胞的吞噬作用,且在同為活菌或同為滅活菌株條件下,滅活的嗜熱鏈球菌S131對巨噬細胞吞噬能力的促進作用高于鼠李糖乳桿菌LGG,且該結(jié)果具有顯著性差異(P<0.01)。巨噬細胞在宿主抵抗外來物質(zhì)入侵機體,免疫防御和創(chuàng)傷修復等過程中發(fā)揮著重要作用[23],結(jié)果顯示,嗜熱鏈球菌S131可以提高巨噬細胞增殖和吞噬能力,說明S131可以激活巨噬細胞,進而可以改善機體免疫力。此結(jié)果與FOO等[24]的結(jié)果相近,益生菌可以促巨噬細胞RAW264.7細胞增殖和吞噬,進而提升機體免疫力。

圖3 不同菌株處理RAW264.7細胞的吞噬率

2.4 菌株對巨噬細胞炎癥因子分泌量的影響結(jié)果

由表1可知,與陰性對照相比,S131活菌組和LGG活菌組與細胞共孵育可促進細胞因子IL-10、IL-6和TNF-α的分泌,活菌組S131可上調(diào)TNF-α、IL-6和IL-10的分泌,引起生理性炎癥反應,提高機體免疫,且活菌組促細胞分泌IL-10的能力高于LGG活菌組,表現(xiàn)出較良好的激活免疫系統(tǒng)的能力;當LPS誘導細胞形成炎癥細胞時,S131活菌的競爭組、治療組、預防組的TNF-α和IL-6值沒有出現(xiàn)差異,且分泌抑炎因子IL-10增多,說明S131活菌可以增加炎癥反應中抑炎因子IL-10的分泌,從而調(diào)節(jié)細胞炎癥反應。細胞因子是由多種組織細胞合成分泌的小分子多肽或糖蛋白,且具有多種生物學功能,可以直接表征細胞功能。此結(jié)果與王琳琳[25]的研究結(jié)果相似,益生菌具有菌株特異性,部分菌株可以降低由LPS誘導的巨噬細胞炎癥模型中促炎因子TNF-α和IL-6的分泌量,還可促抗炎因子IL-10的分泌。結(jié)果表明,S131在細胞處于正常狀態(tài)時,可以促細胞分泌細胞因子,進而激活免疫細胞,提升免疫系統(tǒng)免疫能力;同時,當細胞處于炎癥狀態(tài)時,S131可以下調(diào)促炎因子的分泌量,提升抗炎因子的分泌量,進而緩解細胞炎癥狀態(tài),說明S131可以雙向調(diào)控巨噬細胞分泌細胞因子,證明其可激活細胞的免疫功能,進而提升機體免疫力。

表1 各組中RAW264.7細胞分泌細胞因子結(jié)果

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,嗜熱鏈球菌S131具有良好的黏附能力,即可以較好地在腸道內(nèi)定殖;對菌株產(chǎn)胞外多糖能力的測定結(jié)果表明,嗜熱鏈球菌S131相較于對照組具有更優(yōu)良的產(chǎn)胞外多糖特性,大量研究表明,胞外多糖是益生菌生長代謝過程中的主要次級代謝產(chǎn)物,其具有多種生理功能,可增強人體免疫力等[26]。同時,也可作為增稠劑、穩(wěn)定劑、乳化劑等運用到食品、醫(yī)藥及生化產(chǎn)品等領域[27]。為進一步研究S131代謝產(chǎn)物的開發(fā)利用提供基礎。

巨噬細胞在機體免疫系統(tǒng)中處于關鍵位置,在機體免疫過程中,它發(fā)揮著監(jiān)視、防御、抗原識別和呈遞、調(diào)節(jié)和清除凋亡細胞等功能,是免疫反應的第一道防線[28]。S131可以提升巨噬細胞的增殖和吞噬能力,其中增殖率和吞噬率作為巨噬細胞的活化能力最顯著的特征,具有增強宿主防御和自身免疫的能力[29]。說明S131可以活化巨噬細胞,并提升機體的免疫力系統(tǒng)的免疫能力。

綜上,嗜熱鏈球菌S131可以定殖于腸道,并且可以高產(chǎn)胞外多糖,為之后繼續(xù)研究S131的功能方向提供良好的基礎實驗依據(jù)。同時通過免疫細胞實驗,S131不僅可以激活正常狀態(tài)下的免疫細胞,增加其增殖和吞噬能力,還可促其分泌相關細胞因子;此外,S131還可降低炎癥狀態(tài)下促炎因子的分泌量,提升抗炎因子的分泌量,進而緩解細胞的炎癥狀態(tài),S131可雙向調(diào)節(jié)免疫細胞,改善不同狀態(tài)下免疫細胞的相關指標。因此,認為嗜熱鏈球菌S131具有調(diào)節(jié)免疫的功能,對于應用于保健食品和提升機體免疫力益生菌產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。