氯化鈣處理對發(fā)芽綠豆營養(yǎng)品質(zhì)和抗氧化能力的影響

靳曉琳,賈易天,張小梅,回傳胤,田小雨,侯銀臣,張一鳴

1(河南牧業(yè)經(jīng)濟學院 食品與生物工程學院,河南 鄭州,450046) 2(鄭州工程技術學院 化工食品學院,河南 鄭州,450044)

綠豆又名植豆,在我國有悠久的種植歷史,可藥食兼用,富含蛋白質(zhì)、碳水化合物和膳食纖維[1]。綠豆芽菜是一種傳統(tǒng)的芽菜食品,因其口感脆嫩而深受人們喜愛,綠豆在發(fā)芽過程中為維持生長需要,高分子蛋白、碳水化合物會在自身酶的作用下開始降解,形成小分子的生理活性物質(zhì),因而與綠豆相比,綠豆芽菜更易于被人體消化吸收。發(fā)芽豆類還含有多種抗氧化成分,可降低人體血糖和血壓、軟化血管、增強肌體免疫力,還能有效地將細胞中泄漏出來的多余活性氧清除掉,從而保護細胞和組織免遭氧化傷害,具有抗癌和抗衰老的功效[2]。

Ca2+是植物生長和發(fā)育過程中的重要調(diào)控者,尤其是調(diào)控植物生理代謝及加速發(fā)芽過程中的生化反應[3],Ca2+可激活機體內(nèi)多種酶、提高淀粉酶活性,增強質(zhì)膜透性,強化種子活力,在種子萌發(fā)過程中起重要作用[4-5]。適宜濃度的Ca2+能促進芽菜生長,縮短芽菜生產(chǎn)周期,提高營養(yǎng)品質(zhì),有研究表明,鈣能顯著促進青蒜苗生成可溶性糖、維生素C以及大蒜素[6]。陳士林等[7-8]研究發(fā)現(xiàn)鈣能顯著提高玉米、棉花種子的發(fā)芽勢,促進胚芽伸長,此外,外源Ca2+處理導致芽菜中的酚類物質(zhì)及其抗氧化活性增強[9-10]。目前,外源鈣已經(jīng)被用于農(nóng)產(chǎn)品保鮮,在果蔬生長季節(jié)和采后階段及時地補鈣,可提高園藝產(chǎn)品的保質(zhì)期和營養(yǎng)品質(zhì)。然而,有關鈣對綠豆芽菜營養(yǎng)品質(zhì)和抗氧化能力的影響則很少受到關注。

本研究使用不同濃度的鈣離子處理綠豆芽菜,就豆類在發(fā)芽過程中主要營養(yǎng)成分和抗氧化能力的變化規(guī)律進行研究,探索最適宜的發(fā)芽時間和施鈣濃度,為綠豆芽的工業(yè)化生產(chǎn)和豆類的深加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠豆種子:豫綠2號,購于河南省鄭州市秋樂種業(yè),于-20 ℃貯存?zhèn)溆?。DPPH、2,4,6-三吡啶基三嗪[2,4,6-tris(2-pyridyl)-S-triazine,TPTZ]、抗壞血酸、兒茶素,美國Sigma公司;牛血清白蛋白、福林-酚試劑、矢車菊素-3-葡萄苷,北京索萊寶科技有限公司;甲醇(色譜純),天津市康科德科技有限公司;鹽酸、硫酸、乙醇、草酸、硫酸亞鐵、碳酸鈉等(均為分析純),國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilgent 1200高效液相色譜儀,美國安捷倫公司;PGX-150智能培養(yǎng)箱,寧波海曙塞福實驗儀器廠;康麗A370豆芽機,佛山市順德區(qū)嘉壕實業(yè)有限公司;PYX-DHS-BS型隔水電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海躍進醫(yī)療器械廠;818型pH計,美國Orion公司;Multiskan FC型酶標儀,上海賽默飛世爾儀器有限公司;UV-2802型紫外-可見分光光度計,上海安亭科學儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 氯化鈣濃度處理

設置3個濃度梯度的CaCl2溶液,分別為0.5、2、5 mmol/L,以蒸餾水作為對照(CK),共4個處理。稱取40 g籽粒飽滿的綠豆種子,使用1.0%(體積分數(shù))的次氯酸鈉溶液浸泡15 min后,使用蒸餾水中漂洗至pH中性,在恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃浸泡4 h,然后放置到發(fā)芽機中30 ℃黑暗培養(yǎng)4 d。每隔12 h更換噴淋溶液,發(fā)芽機每1 h噴淋一次培養(yǎng)液,每次2 min。

1.3.2 指標測定

1.3.2.1 芽長和呼吸速率測定

隨機選取20株綠豆芽菜,用游標卡尺測定其芽長。

參照李海霞等[11]的方法,利用改良的小籃子法測定綠豆芽菜的呼吸速率,呼吸速率表示為mg CO2/(g·h)。

1.3.2.2 可溶性蛋白和游離氨基酸測定

分別采用考馬斯G-250染色法[12]和茚三酮顯色法[13]測定。

1.3.2.3 可溶性糖和總糖測定

總糖和可溶性糖參照張述偉等[14]的方法并稍作修改,總糖的提取:稱取0.5 g綠豆芽菜,加入10 mL 6 mol/L HCl和15 mL蒸餾水,沸水浴中加熱2 h后定容至25 mL,上清液即為提取液。可溶性糖的提取過程將6 mol/L HCl替換成蒸餾水,其余步驟同總糖的提取。取上述1.0 mL上清液依次加入0.5 mL蒽酮試劑和4.0 mL濃硫酸,充分振蕩,立即放入沸水浴,保溫1 min后自然冷卻至室溫于620 nm下測定吸光度。

1.3.2.4 總酚含量測定

參照SUN等[15]的方法并稍作修改,選取1.0 g綠豆芽菜粉,加入50 mL 1.0%(體積分數(shù))鹽酸甲醇溶液作為提取液,30 ℃下超聲30 min,提取液于3 000×g離心15 min,收集上清液,將沉淀按上述過程二次提取后合并上清液,每個樣品平行3次提取。取0.25 mL上清液,先加1.0 mL 0.2 mol/L福林酚試劑,再加入2.0 mL 2.0% Na2CO3溶液,在25 ℃下進行暗反應90 min,最后在765 nm處測定吸光度值。

1.3.2.5 總黃酮含量測定

參考SUN等[15]的方法并稍作修改,用兒茶素為標準品制作標準曲線。提取方法同總酚含量的測定。取0.3 mL上清液,先加1.5 mL蒸餾水和0.09 mL質(zhì)量分數(shù)為5.0%的NaNO2溶液,充分混勻后靜置5 min,再加0.18 mL質(zhì)量分數(shù)為10%的Al(NO3)3溶液,混勻,靜置6 min;最后再加入0.6 mL 1 mol/L NaOH溶液和0.33 mL蒸餾水,在510 nm處測定。

1.3.2.6 總花青素含量測定

總花青素的含量參照劉婷婷等[2]方法進行測定,結(jié)果以矢車菊素-3-葡萄苷當量表示(mg/g樣品)。

1.3.2.7 抗壞血酸含量測定

抗壞血酸含量測定參照SUN等[15]的方法進行測定。

1.3.2.8 DPPH自由基清除率測定

參考陳金祥等[16]的方法稍做改進,稱取1.0 g豆芽,加入8 mL體積分數(shù)為50%甲醇溶液進行研磨提取,于8 000×g離心10 min,取1.0 mL上清液,依次加入0.5 mL 0.4 mmol/L DPPH無水乙醇溶液,再加2.0 mL蒸餾水,混勻,避光反應30 min后,在517 nm處測定吸光值。清除率的計算如公式(1)所示:

(1)

式中:A0為對照實驗(水代替樣品溶液)的吸光值;A1為樣品實驗的吸光值;A2為樣品干擾實驗(無水乙醇代替DPPH溶液)的吸光值。

1.3.2.9 亞鐵還原能力測定

根據(jù)SUN等[15]的方法稍加修改,分別吸取0.1 mL濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8,1.0 mmol/L的FeSO4標準液,加入3.0 mL FRAP工作液[25 mL 0.3 mol/L的醋酸鹽緩沖液(pH 3.6)+2.5 mL 10 mmol/L TPTZ溶液+2.5 mL 20 mmol/L FeCl3混合而成,現(xiàn)用現(xiàn)配],再加入0.3 mL蒸餾水,混勻,于37 ℃下準確反應4 min后于593 nm處測定其吸光度,繪制標準曲線。然后取0.1 mL樣品提取液依次加入3.0 mL FRAP工作液和0.3 mL蒸餾水,混勻,37 ℃準確反應4 min后,于593 nm處測定其吸光度,樣品的抗氧化活性以達到相同吸光度所需FeSO4的毫摩爾數(shù)表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

進行3次生物學重復,實驗數(shù)據(jù)以X±SD表示,利用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,在0.05水平進行顯著性分析。采用Person相關分析對樣品的總酚含量、總黃酮、抗壞血酸含量與DPPH自由基清除能力和亞鐵還原能力進行相關性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 氯化鈣處理對發(fā)芽綠豆芽長的影響

由圖1可知,在發(fā)芽4 d內(nèi),與對照和其他濃度氯化鈣處理相比,外源噴淋2 mmol/L氯化鈣下綠豆芽長有顯著提高(P<0.05),在發(fā)芽第4天,芽長是對照的1.31倍,而5 mmol/L的氯化鈣生長最慢,在發(fā)芽第4天芽長較對照降低了23.96%(P<0.05)。此外,除發(fā)芽1～2 d外,0.5 mmol/L氯化鈣處理下綠豆芽長均顯著高于對照(P<0.05),而在發(fā)芽1～2 d與對照無顯著差異(P>0.05)。由此可見,這表明低濃度的鈣有促進綠豆芽菜生長的作用,而高濃度鈣則起抑制作用。

圖1 氯化鈣處理對發(fā)芽綠豆芽長的影響

2.2 氯化鈣處理對發(fā)芽綠豆呼吸速率的影響

由圖2可知,綠豆芽菜在生長過程中呼吸速率不斷增強,在發(fā)芽第4天達到最大(P<0.05),其中,0.5 mmol/L 和2 mmol/L氯化鈣處理下呼吸速率表現(xiàn)出相似的促進作用,在發(fā)芽第4天分別為對照的1.22 和1.37倍(P<0.05),而5 mmol/L氯化鈣處理下呼吸速率在發(fā)芽4 d內(nèi)均顯著低于對照(P<0.05)。

圖2 氯化鈣處理對發(fā)芽綠豆呼吸速率的影響

2.3 氯化鈣處理對發(fā)芽綠豆可溶性蛋白含量的影響

由圖3可知,在發(fā)芽4 d內(nèi),發(fā)芽綠豆中可溶性蛋白均呈先上升后下降趨勢,在發(fā)芽第3天達到最大(P<0.05)。其中在發(fā)芽第3天,0.5 mmol/L和2 mmol/L氯化鈣處理下可溶性蛋白顯著高于對照,分別較對照增加了11.7%和8.8%(P<0.05),而在發(fā)芽第4天,與對照相比無顯著性差異(P>0.05)。0.5 mmol/L氯化鈣處理下的可溶性蛋白含量在發(fā)芽4 d內(nèi)均顯著低于對照(P<0.05)。

圖3 氯化鈣處理對發(fā)芽綠豆可溶性蛋白含量的影響

2.4 氯化鈣處理對發(fā)芽綠豆游離氨基酸含量的影響

由圖4可知,發(fā)芽綠豆中游離氨基酸含量隨時間延長而增加(P<0.05),2 mmol/L氯化鈣處理下游離氨基酸含量最高,分別為對照的1.65、2.05、1.76和1.35倍(P<0.05)。同時,除發(fā)芽第1天外,0.5 mmol/L氯化鈣處理下游離氨基酸含量均顯著高于對照(P<0.05),而5 mmol/L氯化鈣處理下游離氨基酸含量在發(fā)芽2～4 d均顯著低于對照(P<0.05)。

圖4 氯化鈣處理對發(fā)芽綠豆游離氨基酸含量的影響

2.5 氯化鈣處理對發(fā)芽綠豆總糖含量的影響

由圖5可知,隨著時間的延長,發(fā)芽綠豆中總糖含量先升高后逐漸降低,在發(fā)芽第2天達到最大值(P<0.05)。與對照和其他氯化鈣處理相比,2 mmol/L氯化鈣處理下總糖含量在發(fā)芽1～3 d顯著提高(P<0.05)。在發(fā)芽第4天,5 mmol/L氯化鈣處理下總糖含量顯著低于其他氯化鈣處理(P<0.05),但與對照相比無顯著性差異(P>0.05)。

2.6 氯化鈣處理對發(fā)芽綠豆可溶性糖含量的影響

由圖6可知,綠豆芽菜中可溶性糖含量隨時間延長而增加(P<0.05),其中在發(fā)芽第4天,0.5 mmol/L和2 mmol/L氯化鈣處理下可溶性糖含量顯著高于對照,分別增加11.78%和18.38%(P<0.05),5 mmol/L氯化鈣處理下與對照相比無顯著性差異(P>0.05)。

圖6 氯化鈣處理對發(fā)芽綠豆可溶性糖含量的影響

2.7 氯化鈣處理下發(fā)芽綠豆總酚含量的變化

由圖7可知,綠豆芽菜中總酚含量在發(fā)芽1～4 d均呈增加趨勢(P<0.05),在發(fā)芽第4天,2 mmol/L氯化鈣處理下的總酚含量最高,達到10.47 mg/g(P<0.05),其次是0.5 mmol/L、對照和5 mmol/L氯化鈣處理,其中0.5 mmol/L氯化鈣處理下綠豆芽菜中的總酚含量,與對照相比無顯著性差異(P>0.05)。

圖7 氯化鈣處理對發(fā)芽綠豆總酚含量的影響

2.8 氯化鈣處理下發(fā)芽綠豆總黃酮含量的變化

圖8表明綠豆芽菜中總黃酮含量變化趨勢和總酚類似,均在發(fā)芽4 d內(nèi)顯著增加,其中,除發(fā)芽2 d外,氯化鈣處理下總黃酮含量均顯著高于對照(P<0.05)。在發(fā)芽第4天,0.5、2、5 mmol/L氯化鈣處理下的總黃酮分別比對照增加了15.95%、33.62%和7.89%(P<0.05)。

圖8 氯化鈣處理對發(fā)芽綠豆總黃酮含量的影響

2.9 氯化鈣處理下發(fā)芽綠豆總花青素含量的變化

由圖9可知,在發(fā)芽4 d內(nèi),5 mmol/L氯化鈣處理的總花青素含量呈持續(xù)增加趨勢,而對照和其他2個濃度氯化鈣處理下總花青素含量表現(xiàn)出相似的變化趨勢,即在發(fā)芽3 d達到最大值(P<0.05)。同時,在發(fā)芽4 d內(nèi),0.5 mmol/L和2 mmol/L氯化鈣處理下總花青素含量顯著高于對照,而5 mmol/L氯化鈣處理的總花青素僅在發(fā)芽第4天顯著高于對照,為對照的1.52倍(P<0.05)。此外,在發(fā)芽第4天,氯化鈣處理下的總花青素含量均顯著高于對照(P<0.05),但三者間無顯著性差異(P>0.05)。

圖9 氯化鈣處理對發(fā)芽綠豆總花青素含量的影響

2.10 氯化鈣處理下發(fā)芽綠豆抗壞血酸含量的變化

由圖10可知,在發(fā)芽4 d內(nèi),處理下的抗壞血酸含量均呈上升趨勢,其中在發(fā)芽1～2 d增加緩慢,在2～4 d急劇增加。此外,3個濃度氯化鈣處理均顯著增加綠豆芽菜中抗壞血酸含量(P<0.05),在發(fā)芽第4天,0.5、2、5 mmol/L氯化鈣處理下抗壞血酸含量分別較對照增加了15.8%、27.1%和23.8%,然而這3個濃度間含量無顯著性差異(P>0.05)。

圖10 氯化鈣處理對綠豆芽菜抗壞血酸含量的影響

2.11 氯化鈣處理下發(fā)芽綠豆DPPH自由基清除能力的變化

由圖11可知,在萌發(fā)過程中氯化鈣處理顯著提高了綠豆芽菜DPPH自由基清除能力,萌發(fā)時間、噴淋處理及其交互作用對清除能力有顯著影響(P<0.05),在發(fā)芽第4天,2 mmol/L氯化鈣處理下清除能力最高,其次為5、0.2 mmol/L氯化鈣和對照處理(P<0.05)。

圖11 氯化鈣處理對發(fā)芽綠豆DPPH自由基清除率的影響

2.12 氯化鈣處理下發(fā)芽綠豆亞鐵還原能力的變化

發(fā)芽期間,處理和對照的亞鐵還原能力顯著增加,其中2 mmol/L氯化鈣處理下還原能力最高(P<0.05)(圖12)。0.5 mmol/L氯化鈣在發(fā)芽2～4 d顯著高于對照,在發(fā)芽第1天無顯著性差異(P>0.05),而5 mmol/L氯化鈣僅在發(fā)芽3～4 d顯著高于對照。在發(fā)芽第4天,0.5、2、5 mmol/L氯化鈣處理下還原能力分別較對照增加了62.7%、74.0%和6.5%(P<0.05)。

圖12 氯化鈣處理對發(fā)芽綠豆亞鐵還原能力的影響

2.13 氯化鈣處理下發(fā)芽綠豆抗氧化成分與抗氧化性能的相關關系

DPPH自由基清除能力、亞鐵還原能力是目前衡量植物抗氧化性常用的指標。由表1可知,綠豆芽苗菜的DPPH自由基清除能力變化與亞鐵還原能力的相關系數(shù)為0.718,達到顯著水平,這說明這2種方法可以基本一致的反映不同發(fā)芽時期綠豆芽菜提取液的抗氧化活性。綠豆芽菜中總酚含量、總黃酮、抗壞血酸含量與DPPH自由基清除能力和亞鐵還原能力呈顯著相關(P<0.05)?？偦ㄇ嗨嘏cDPPH自由基清除能力和亞鐵還原能力間的相關性不顯著(P>0.05)。

表1 綠豆芽菜中總酚、總黃酮、原花青素和抗壞血酸含量與抗氧化活性之間的相關性

3 討論與結(jié)論

呼吸是種子萌發(fā)過程中胚芽的基礎生理代謝活動,種子中各種水解酶的合成和激活以及物質(zhì)轉(zhuǎn)化都跟呼吸密切相關,Ca2+通過鈣結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)種子萌發(fā)過程中的一些代謝酶,提高胚和胚乳中淀粉酶等水解酶的活性,用Ca2+處理糙米種子其呼吸速率有顯著提高[17],同時鈣元素是植物細胞的結(jié)構(gòu)組成元素,適當補充鈣元素可促進芽菜的生長[10],本研究的結(jié)果也證實了這一點,綠豆籽粒發(fā)芽期間經(jīng)0.5 mmol/L和2 mmol/L氯化鈣處理,其芽長和呼吸速率均顯著上升,干物質(zhì)消耗增加,表明發(fā)芽綠豆的生命活動受到氯化鈣處理,物質(zhì)代謝速度加快,其中2 mmol/L氯化鈣的促進作用最強,而高濃度氯化鈣(5 mmol/L)對芽菜生長有抑制作用,在發(fā)芽初期高強度的呼吸速率與種子高活力密切相關[18],從而更快地為細胞合成提供還原力及中間代謝產(chǎn)物。

綠豆作為一種高蛋白、中淀粉、低脂肪的豆類,在發(fā)芽期間,貯藏物質(zhì)水解釋放出大量的能量,轉(zhuǎn)化成易吸收的可溶性低分子物質(zhì),本研究中,在發(fā)芽4 d內(nèi),綠豆芽菜總糖和可溶性蛋白含量均呈先上升后下降趨勢,這可能是發(fā)芽后期消耗增加,而淀粉和貯藏蛋白水解補給有限,因而出現(xiàn)下降趨勢[19-20]。綠豆在發(fā)芽過程中,隨著淀粉酶、葡萄糖磷酸化酶等水解酶活力的提高,總糖不斷地被降解,可溶性糖含量增加。同樣,蛋白質(zhì)在蛋白水解酶的作用下降解成氨基酸,游離氨基酸顯著增加,這種變化趨勢與陳志剛等[21]對糙米的研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)0.5 mmol/L和2 mmol/L氯化鈣處理顯著提高可溶性糖和總糖含量,這與王艷穎等[22]在鮮切芹菜的研究結(jié)果相似,這可能是適宜的鈣能夠促進淀粉水解及脂類的分解轉(zhuǎn)化,從而使糖類增加[23]。

黃酮和酚類物質(zhì)具有較好的自由基清除能力,是近年來天然抗氧化劑研究的熱點之一。苯丙氨酸解氨酶作為苯丙烷代謝途徑中的關鍵酶,在豆類萌發(fā)過程中,苯丙烷類代謝增強[24],有報道認為鈣離子可顯著促進苯丙氨酸解氨酶解氨酶活性,該酶是苯丙烷類代謝途徑中的關鍵酶和限速酶,其活性的大小與多酚、生物堿等重要刺激代謝產(chǎn)物的積累有極其密切的關系,導致黃酮和酚類物質(zhì)的積累[25-26]。本實驗中總酚、總黃酮和抗壞血酸含量表現(xiàn)出相似的趨勢,在發(fā)芽4 d內(nèi)隨發(fā)芽時間延長而增加,并且2 mmol/L氯化鈣處理下表現(xiàn)出更高的總酚和總黃酮含量,這與趙艷等[27]和喻最新等[28]的研究結(jié)果一致,本實驗中總花青素與DPPH自由基清除能力和亞鐵還原能力間的相關性不顯著(P>0.05),這可能與花青素極易降解的特性有關[2]。由此表明總黃酮、總酚和抗壞血酸在綠豆芽菜的抗氧化中起主要作用,而不是總花青素,這與魏美霞等[29]和劉婷婷等[2]將豆類的主要抗氧化作用歸因于總酚和黃酮類物質(zhì)的研究結(jié)果相似。

發(fā)芽是一項有效改善豆類感官品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)的加工工藝。本實驗研究了氯化鈣處理對綠豆芽菜基礎營養(yǎng)物質(zhì)及其抗氧化活性的影響,結(jié)果表明,0.5 mmol/L和2.0 mmol/L的鈣濃度處理均可顯著提高綠豆芽菜中游離氨基酸、總糖、可溶性糖含量。2 mmol/L氯化鈣處理下表現(xiàn)出更高的總酚和總黃酮含量。此外,除總花青素外,總酚、總黃酮和抗壞血酸含量均隨著發(fā)芽時間的延長而有不同程度的增加。相關性結(jié)果表明,抗氧化能力主要與酚類物質(zhì)和抗壞血酸含量有關,因此綜合研究結(jié)果考慮,建議噴施2.0 mmol/L的鈣濃度對綠豆芽菜各方面的影響效果最優(yōu),同時發(fā)芽時間選取4 d,此時綠豆芽中含有較高的抗氧化物質(zhì)和較高的抗氧化能力,對人體最有益。