黔產(chǎn)鐵皮石斛不同部位混菌發(fā)酵米酒品質(zhì)的比較

張琳,李秋月,邱樹毅,王春曉,韋朝陽(yáng)

(貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院,貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽(yáng),550025)

鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)在藥食同源中分類屬于名貴中藥材,被廣泛應(yīng)用于各種滋補(bǔ)、營(yíng)養(yǎng)的食品、保健品中,在我國(guó)已經(jīng)有2 000多年的發(fā)展應(yīng)用歷史。鐵皮石斛中富含多糖、聯(lián)芐衍生物、石斛生物堿、類黃酮和氨基酸類等多種活性成分,鐵皮石斛的功效作用有抗氧化活性、降血糖、抗腫瘤、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等[1-3],其藥用價(jià)值在藥食同源中極高,因此鐵皮石斛被廣泛應(yīng)用于食品中。

鐵皮石斛的傳統(tǒng)藥用及食用部位為莖,且研究側(cè)重于莖方面,石斛莖采收時(shí)石斛花、葉、根通常會(huì)被忽視而做廢棄處理。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道鐵皮石斛經(jīng)微生物發(fā)酵后多糖、黃酮、酚類等活性物質(zhì)含量會(huì)增加[4],可增強(qiáng)其抗氧化、降血糖的活性[5]。越來(lái)越多的人研究報(bào)道鐵皮石斛在發(fā)酵酒中的應(yīng)用。任紅運(yùn)等[6]、史學(xué)琴等[7]、趙紅等[8]利用混菌發(fā)酵的方法,有利于鐵皮石斛的各種活性物質(zhì)更好地溶出,使發(fā)酵酒的風(fēng)味更加豐富,營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)提升。將鐵皮石斛滲入黃酒發(fā)酵工藝中,得到的黃酒口感爽快,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富[9]。隨著鐵皮石斛在創(chuàng)新產(chǎn)品深加工多樣性方面的不斷豐富發(fā)展,被人們忽視的鐵皮石斛葉、花和根的活性成分含量等各種研究和深加工利用也開始備受關(guān)注。譬如,鐵皮石斛花與人參果共同發(fā)酵得到清香爽口的人參果鐵皮石斛花復(fù)合果酒[10],鐵皮石斛葉與苦蕎發(fā)酵得到苦蕎鐵皮石斛葉復(fù)合發(fā)酵酒[11]。

近年來(lái),基于鐵皮石斛莖豐富的活性物質(zhì),其在發(fā)酵酒中的應(yīng)用較多,鐵皮石斛花和葉在發(fā)酵酒中的應(yīng)用也有極少的研究報(bào)道,而根在發(fā)酵酒中的應(yīng)用幾乎沒(méi)有。該文從鐵皮石斛根、莖、葉、花的活性成分在混菌發(fā)酵米酒的含量變化和理化指標(biāo)及感官評(píng)價(jià)方面進(jìn)行論述,研究4種石斛部位發(fā)酵米酒在釀酒酵母和異常威克漢姆酵母混合發(fā)酵后的品質(zhì)比較,旨在擴(kuò)展鐵皮石斛根、花、莖、葉資源更進(jìn)一步地利用,促進(jìn)鐵皮石斛葉、莖、花、根不同部位相關(guān)產(chǎn)品的深加工,提高鐵皮石斛的經(jīng)濟(jì)附加值,提高鐵皮石斛根、莖、葉和花的綜合利用度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料:鐵皮石斛,貴州省貴定縣綠春農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司;有機(jī)糯米,遼寧省大連市大連德禾鑫農(nóng)產(chǎn)品加工有限公司。

菌種:釀酒酵母FBKL2.8022(Saccharomycescerevisiae,Sc),從貴州傳統(tǒng)塊狀小曲中分離篩選[12],貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定保藏,保藏編號(hào)CCTCC NO:M2019406;異常威克漢姆酵母FBKL2.8023(Wickerhamomycesanomalus,Wa),從貴州傳統(tǒng)塊狀小曲中分離篩選[13],貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定保藏,保藏編號(hào)CCTCC NO:M2019412。

試劑:α-淀粉酶(3 700 U/g)、糖化酶(≥10 萬(wàn)U/g),北京索萊寶科技有限公司;葡萄糖標(biāo)品,阿拉丁試劑(上海)有限公司;沒(méi)食子酸、蘆丁、福林酚、磺基水楊酸,上海源葉生物科技有限公司;2-辛醇標(biāo)準(zhǔn)品,上海麥克林生化科技有限公司;濃硫酸、濃鹽酸,重慶川東化工(集團(tuán))有限公司;氫氧化鈉、六水氯化鋁,四川西隴科學(xué)有限公司;苯酚,天津市永大化學(xué)試劑有限公司;無(wú)水乙醇,天津市富宇精細(xì)化工有限公司;亞硝酸鈉,天津市優(yōu)譜化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-75SII立式蒸汽壓力滅菌鍋、SPX-250B生化培養(yǎng)箱,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;GFL-230電熱鼓風(fēng)干燥箱,天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司;PHS-3C精密pH計(jì),上海日島科學(xué)儀器有限公司;NP-30S漩渦混合儀,常州恩培儀器制作有限公司;LC-LX-H185C臺(tái)式高速離心機(jī),上海力辰邦西儀器科技有限公司;LT1002E電子天平,常熟市天量?jī)x器有限責(zé)任公司;721紫外可見分光光度計(jì),上海菁華科技儀器有限公司;S-10生物傳感器分析儀,深圳市西爾曼科技有限公司;固相微萃取頭(50/30 μm DVB/CAR/PDMS),美國(guó)Supelco公司;1260安捷倫高效液相色譜儀、7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,安捷倫科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 米酒發(fā)酵

采用Sc和Wa進(jìn)行混合發(fā)酵,分別為混菌發(fā)酵鐵皮石斛根(Do-Ro),混菌發(fā)酵鐵皮石斛花(Do-Fl),混菌發(fā)酵鐵皮石斛莖(Do-St),混菌發(fā)酵鐵皮石斛葉(Do-Fo),未添加鐵皮石斛作為對(duì)照(BC)。

稱取50.0 g糯米加入250 mL蒸餾水浸泡過(guò)夜,瀝干水分,于121 ℃滅菌40 min,滅菌后待糯米冷卻至室溫,添加糖化酶0.56%、淀粉酶1.89%(添加量以糯米干重為基準(zhǔn))和75 mL無(wú)菌水,60 ℃水浴30 min。將Sc和Wa接種到冷卻至常溫的糯米中(接菌比例為Wa∶Sc=1∶10,接菌量為1×106cell/mL)。添加鐵皮石斛粉2.5 g,置于30 ℃恒溫條件下培養(yǎng),每24 h稱重1次并記錄,當(dāng)失重小于0.2 g/d即為發(fā)酵停止,發(fā)酵結(jié)束后檢測(cè)發(fā)酵液中的相關(guān)成分。

1.3.2 鐵皮石斛米酒發(fā)酵工藝流程

鐵皮石斛米酒發(fā)酵工藝流程如下:

鮮鐵皮石斛→挑選分類(根、莖、葉花)→烘干粉碎→擴(kuò)大培養(yǎng)→活化→菌種→糯米浸泡→蒸糧→糖化→接菌→發(fā)酵→過(guò)濾→陳釀

1.3.3 理化指標(biāo)

pH用pH計(jì)直接測(cè)定?？偹釁⒄誈B/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的方法進(jìn)行測(cè)定。酒精度的測(cè)定,將發(fā)酵酒樣稀釋100倍,利用生物氧化酶膜電化學(xué)傳感器吸取25 μL進(jìn)行待測(cè)酒樣的酒精濃度檢測(cè)。還原糖參照NY/T 2742—2015《水果及制品可溶性糖的測(cè)定 3,5-二硝基水楊酸比色法》。采用苯酚-硫酸法[14]測(cè)定石斛米酒總糖含量。

1.3.4 主要活性物質(zhì)測(cè)定

多糖的測(cè)定,同1.3.3節(jié)總糖測(cè)定方法。黃酮的測(cè)定參照繆園欣等[15]測(cè)定黃酮的方法?？偡拥臏y(cè)定參照朱明明等[16]測(cè)定總酚的方法。樣品制備,鐵皮石斛多糖采用水提醇沉法提取并用Savage脫蛋白[17];黃酮和總酚的提取參照劉瑾等[18]、汪江波等[9]的提取方法。

1.3.5 米酒感官評(píng)價(jià)

感官評(píng)價(jià):選擇10名專業(yè)人員,從石斛米酒的口感、色澤、香氣、組織狀態(tài)4個(gè)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)定,滿分100分,感官評(píng)分結(jié)果取平均值,評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 米酒感官評(píng)價(jià)

1.3.6 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定

發(fā)酵液中揮發(fā)性成分測(cè)定參考史學(xué)琴等[7]的方法,采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法。質(zhì)譜數(shù)據(jù)的定性分析通過(guò)比較保留指標(biāo)和鑒定化合物的質(zhì)譜進(jìn)行驗(yàn)證;以2-辛醇為內(nèi)標(biāo),不考慮揮發(fā)性化合物的回收率和響應(yīng)因子,對(duì)各種揮發(fā)性化合物進(jìn)行定量分析。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行,所得數(shù)據(jù)通過(guò)IBM SPSS Statistics 26.0進(jìn)行單因素檢驗(yàn)并分析差異顯著性,利用由Excel 2016、Origin 2018 64Bit、聯(lián)川生物云平臺(tái)等進(jìn)行圖表的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化指標(biāo)分析

米酒在發(fā)酵中,酵母菌利用糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生酒精、CO2等物質(zhì),依據(jù)CO2失重變化(失重<0.2 g/d)判定發(fā)酵終點(diǎn)。如圖1所示,采用Sc、Wa混合發(fā)酵鐵皮石斛4種不同部位的米酒,在發(fā)酵第6天失重已小于0.2 g/d,后期發(fā)酵狀態(tài)穩(wěn)定,4種米酒均在第9天達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn);未添加鐵皮石斛的米酒則是在發(fā)酵第7天趨于平緩,在第10天達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)。Do-Fo米酒總失重為20.88 g,Do-Fl米酒為20.38 g,Do-St米酒為20.20 g,Do-Ro米酒為20.04 g,BC米酒為19.04 g,添加鐵皮石斛的米酒在發(fā)酵期間整體失重變化無(wú)顯著差異,石斛花、葉在發(fā)酵前期失重略高于石斛莖、根,但未添加鐵皮石斛的米酒顯著低于其他。因此,添加鐵皮石斛不同部位可有效促進(jìn)米酒的發(fā)酵,縮短發(fā)酵周期。

圖1 米酒發(fā)酵過(guò)程中CO2失重變化

米酒發(fā)酵后的基本理化指標(biāo)如表2所示,米酒因鐵皮石斛不同部位的化學(xué)成分差異而存在一定的差異。鐵皮石斛花、葉、莖、根發(fā)酵米酒的酒精含量無(wú)顯著差異,均顯著低于BC米酒,鐵皮石斛不同部位對(duì)酒精發(fā)酵均有抑制作用。添加鐵皮石斛后米酒中還原糖、總糖含量顯著增加,Do-Fo和Do-St米酒均顯著高于Do-Fl和Do-Ro。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道鐵皮石斛莖多糖含量(34.61%)>葉(23.51%)>花(13.47%)[19],石斛根的多糖約是莖多糖的1/5[20],微生物發(fā)酵有利于石斛中多糖釋放并降解為小分子糖類物質(zhì),因此,發(fā)酵中添加葉和莖的米酒糖含量較高,初步推測(cè)添加鐵皮石斛后米酒中增加的一部分糖可能來(lái)自于原料或酵母對(duì)原料的轉(zhuǎn)化。Do-Fl、Do-Fo、Do-St、Do-Ro、BC米酒的pH依次減小,總酸含量則呈現(xiàn)相反的變化,5種米酒pH和總酸變化相對(duì)應(yīng),pH越低,總酸含量越高,反之越低。

表2 米酒的理化指標(biāo)

2.2 主要活性物質(zhì)分析

鐵皮石斛中含有多糖、石斛堿、黃酮、酚類等多種功能活性物質(zhì),不同部位多糖、黃酮類、酚類等有顯著差異[21]。因其不同部位活性物質(zhì)差異,鐵皮石斛花、葉、莖、根發(fā)酵的米酒與對(duì)照組米酒,其活性物質(zhì)含量有顯著差異。如表3所示,添加鐵皮石斛后發(fā)酵米酒中活性物質(zhì)顯著增加,鐵皮石斛不同部位其活性物質(zhì)含量也有顯著差異,因此鐵皮石斛花、葉、莖、根發(fā)酵的米酒活性物質(zhì)含量也存在差異。米酒中總酚含量為Do-Fl>Do-Fo>Do-St>Do-Ro>BC,而鐵皮石斛不同部位總酚含量為花>葉>根>莖,這與黃彪等[22]研究幾乎一致,因此Do-Fl米酒總酚含量最高為721.02 mg/L。本研究中鐵皮石斛黃酮含量為花>葉>根>莖,與耿文慧等[23]的研究中鐵皮石斛黃酮含量為花>葉>莖的結(jié)果相似,值得注意的是在發(fā)酵米酒中黃酮含量為Do-Fo>Do-Fl>Do-Ro>Do-St>BC,添加鐵皮石斛葉發(fā)酵的米酒黃酮含量最高。真菌會(huì)產(chǎn)生可降解植物細(xì)胞壁的一系列酶[24-25],因此Do-Fo米酒中黃酮含量最高,這可能與酵母菌內(nèi)在酶系降解鐵皮石斛葉細(xì)胞壁從而釋放其黃酮等活性成分有關(guān)。鐵皮石斛多糖含量為莖>葉>花>根,這與張志信等[26]、尚喜雨[27]研究結(jié)果一致。鐵皮石斛多糖為葡甘露聚糖,其單糖組成主要是葡萄糖、甘露糖[28-30]。發(fā)酵米酒中多糖含量為Do-St、Do-Fo>Do-Fl>Do-Ro>BC,Do-Fo和Do-St中多糖含量顯著高于Do-Fl和Do-Ro,這與前文Do-Fo和Do-St米酒中還原糖、總糖結(jié)果一致。有趣的是Do-Fo和Do-St米酒中多糖含量幾乎一致,這可能是因?yàn)獒劸平湍赴l(fā)酵能有效降解發(fā)酵所得胞外多糖,將大分子多糖降解成小分子多糖[31],把機(jī)體不易吸收的大分子物質(zhì)進(jìn)行降解并用于新陳代謝[32]。因此,推測(cè)酵母菌豐富的酶系能夠更好地促進(jìn)鐵皮石斛葉中多糖溶出。

表3 米酒及鐵皮石斛的活性物質(zhì)含量

2.3 感官評(píng)價(jià)分析

對(duì)發(fā)酵后米酒的色、香、味、形進(jìn)行感官評(píng)價(jià),評(píng)分結(jié)果如表4所示。5種米酒中Do-Fl米酒的感官評(píng)分最高,其口感和氣味的感官評(píng)分也是最高的。

表4 米酒感官評(píng)價(jià)分析結(jié)果

2.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

在5種米酒中共檢測(cè)到47種揮發(fā)性物質(zhì),其中醇類物質(zhì)共17種,酯類物質(zhì)16種,烷烴類物質(zhì)共4種,2種醛類,4種酸類,1種烯烴,1種酮,1種揮發(fā)性酚類,1種有機(jī)化合物,具體檢出的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)見附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.033542)。鐵皮石斛根、花、莖、葉4個(gè)部位發(fā)酵的米酒與對(duì)照組米酒,揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的組成有所不同,米酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量、豐度及百分比組成分如附表1和圖2所示。Do-Ro、Do-Fl、Do-St、Do-Fo、BC米酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量分別為60.00、61.21、51.17、64.71、100.01 mg/L;添加鐵皮石斛后米酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量顯著降低,其中主要降低的是醇類;在鐵皮石斛不同部位發(fā)酵的米酒中,根發(fā)酵的米酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量最高,花發(fā)酵的米酒揮發(fā)性成分最豐富,且米酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)以醇類和酯類物質(zhì)為主。

a-米酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)聚類熱圖;b-揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)個(gè)數(shù)3D柱狀堆積圖;c-揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)百分比含量3D柱狀圖

醇類物質(zhì)是酒中重要的呈香物質(zhì),適量的揮發(fā)醇可以增加酒體的醇香,對(duì)酒的香氣貢獻(xiàn)作用大[33]。5種米酒中含量較多的高級(jí)醇主要有異丁醇、正丁醇、2,3-丁二醇、苯乙醇,適量的高級(jí)醇可使酒體更加協(xié)調(diào),苯乙醇可賦予米酒更豐富的花果香味;2,3-丁二醇會(huì)產(chǎn)生類似黃油、奶油的香味,是為數(shù)不多的可呈香的多元醇之一[34];乙醇對(duì)米酒的呈香、發(fā)酵酒精具有積極作用。相較于BC米酒,添加鐵皮石斛發(fā)酵的米酒中醇類物質(zhì)含量顯著減少,主要是乙醇、異戊醇的減少;相反苯乙醇、異丁醇含量增加;Do-Fl米酒中醇類物質(zhì)含量最多,種類也較為豐富,一縮二丙二醇、3-己烯-1-醇、丙醇是鐵皮石斛花發(fā)酵的米酒中特有的3種醇類物質(zhì);Do-St米酒中醇類物質(zhì)含量雖最少,但其種類較多,米酒中獨(dú)有的2-庚醇具有花果香,芳樟醇(閾值為6 μg/L)具有花果香、草木香[35];1-戊醇是Do-Fo米酒中檢出的一種特有的醇類物質(zhì)。

酯類主要為酒提供水果、鮮花、甜味和牛奶風(fēng)味[36],發(fā)酵米酒中呈酯香的酯類主要是辛酸乙酯(閾值5 μg/L,主要參考賈麗艷等[37]的研究,下同)、月桂酸乙酯(閾值400 μg/L)、乙酸乙酯(閾值12.27 mg/L)[38]。相較于BC,添加鐵皮石斛后,Do-Fl和Do-St米酒中酯類物質(zhì)種類減少,大部分酯類含量也減少;相反Do-Ro和Do-Fo米酒中酯類含量顯著增加,Do-Ro中最主要的正己酸乙酯增加了約4倍。鐵皮石斛根、花、莖發(fā)酵的米酒中均檢出的乙酸異戊酯呈現(xiàn)果香味;米酒均含有的辛酸乙酯、癸酸乙酯(閾值為200 μg/L)具有花果香味,在Do-Ro米酒中含量最高,此外,辛酸乙酯還具有白蘭地的酒香味。Do-Ro米酒中酯類物質(zhì)含量最高為10.58 mg/L,在米酒中的百分比為16.35%,也是占比最高的。Do-Ro米酒中差異性揮發(fā)風(fēng)味物質(zhì)主要是酯類物質(zhì),包括癸酸乙酯、十四酸乙酯、棕櫚酸乙酯、正己酸乙酯(閾值14 μg/L)、3-苯丙酸乙酯等,這些酯類物質(zhì)大多數(shù)具有酯香,可豐富米酒的香氣;Do-Fo、BC米酒中均有12酯類物質(zhì),是種類較為豐富的米酒。

5種米酒中主要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要是醇類和酯類,除此以外米酒中還檢出了少量的揮發(fā)性烷烴類、醛類、酸類等風(fēng)味物質(zhì),這些物質(zhì)在米酒中含量雖少,但是對(duì)米酒的香氣品質(zhì)也存在影響。Do-Ro、Do-Fl、Do-St、Do-Fo、BC米酒中含量較少的揮發(fā)性酸類、醛類等物質(zhì)的百分比含量分別為0.40%、1.73%、1.49%、1.44%、1.03%。發(fā)酵酒中具有較高香氣活性的苯甲醛可賦予米酒果仁香[39];Do-Fl米酒中的3-羥基-2-丁酮呈奶香味,萘具有焦香,米酒中特有的茶香螺烷[40]來(lái)自于鐵皮石斛花。

綜上所述,鐵皮石斛花、莖、葉、根4個(gè)部位發(fā)酵的米酒因?yàn)樵匣蛘咴吓c酵母菌之間的相互作用使得4種鐵皮石斛米酒揮發(fā)性風(fēng)味存在一定的差異。其中Do-Fl米酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類最豐富,含量也較高僅次于Do-Ro米酒,而在前文感官評(píng)價(jià)分析中Do-Fl米酒得分最高且其在氣味方面的得分也是最高的。因此,鐵皮石斛花發(fā)酵的米酒相較于其他部位發(fā)酵的米酒具有更好的風(fēng)味品質(zhì)。

3 結(jié)論

本論文采用釀酒酵母和非釀酒酵母兩株酵母菌混合發(fā)酵鐵皮石斛米酒,比較鐵皮石斛花、莖、葉、根發(fā)酵米酒的理化指標(biāo)、活性物質(zhì)、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)等,分析鐵皮石斛不同部位發(fā)酵米酒的品質(zhì)差異。結(jié)果表明,添加鐵皮石斛后,米酒發(fā)酵周期縮短,在一定程度上抑制了酒精發(fā)酵作用。Do-Fo、Do-St米酒中還原糖、總糖、多糖含量較高,這可能是因?yàn)殍F皮石斛莖和葉中多糖含量高于其他部位;Do-Fl、Do-Fo米酒中黃酮、總酚含量顯著高于其他部位發(fā)酵的米酒,其中Do-Fl米酒總酚含量最高,Do-Fo米酒黃酮含量最高;Do-Ro、Do-Fl、Do-St、Do-Fo米酒中揮發(fā)性風(fēng)味成分分別有25、29、27、26種,Do-Ro米酒種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量最高但種類最少,Do-Fl米酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類最豐富,含量也較高。綜上所述,鐵皮石斛花、莖、葉、根不同部位發(fā)酵的米酒在理化指標(biāo)、活性物質(zhì)、揮發(fā)性成分等品質(zhì)存在差異,其中鐵皮石斛花發(fā)酵的米酒品質(zhì)較佳。