硫酸化透明質(zhì)酸的制備、活性及應用研究進展

卞兆荃，魏 健，王成山，郭學平

（華熙生物科技股份有限公司，山東 濟南 250101）

透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）是由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖雙糖重復單元組成的糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）。HA廣泛分布于機體各組織中，具有特殊的理化性質(zhì)和獨特的生理功能，廣泛用于骨科[1]、眼科[2]、化妝品[3]和保健食品[4]等多個領域。但未經(jīng)改性的HA有穩(wěn)定性差、易降解等缺點，在人體中無法長期保留，限制了其在藥物和組織支架等方面的應用。通過對HA進行改性得到HA衍生物可有效克服這些缺點，拓展其應用[5-7]。

硫酸化透明質(zhì)酸（sulphated hyaluronic acid或sulfated hyaluronic acid，sHA）是HA的硫酸酯。近年研究表明，相比其他硫酸化多糖，sHA表現(xiàn)出更優(yōu)異的抗炎和抗腫瘤等功效，在傷口愈合和生物涂層方面，sHA同樣顯示出廣闊的應用前景。本文對sHA的制備、生物活性以及現(xiàn)有和潛在應用研究進展進行綜述。

1 sHA的合成

sHA的合成方法較多，早期EP0940410A1[8]采用HA四丁基銨鹽與三氧化硫-吡啶于N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中低溫反應，后期加入冰水終止反應，經(jīng)沉淀、透析、冷凍干燥后可得sHA。Hintze等[9]用三氧化硫-DMF作為反應物，該反應物相比三氧化硫-吡啶更適于合成高取代sHA，室溫反應1 h即可得到取代度2.8以上的sHA，現(xiàn)已成為較主流的合成sHA方法。Guarise等[10]用甲烷磺酸作為助溶劑實現(xiàn)了HA鈉鹽在DMF中的溶解，再與三氧化硫-吡啶復合物反應得到sHA。與傳統(tǒng)方法相比，此法可省去前期合成HA四丁基銨鹽的步驟。Fidia公司進一步優(yōu)化純化工藝[11]，后處理采用一系列精細的洗滌步驟代替?zhèn)鹘y(tǒng)的透析操作，得到了純度和產(chǎn)率均極高的sHA產(chǎn)品，可有效減少后處理時間和成本。

2 sHA的生物活性

2.1 抗腫瘤、癌癥

已有研究指出，HA可調(diào)節(jié)、抑制癌細胞生長和轉(zhuǎn)移[12-13]，對HA進行修飾可進一步加強其抗腫瘤和抗癌活性。近年，sHA等HA衍生物在抗腫瘤、抗癌方面的研究受到廣泛關注。Benitez等[14]研究sHA在前列腺癌細胞中的作用，結果表明，sHA可有效減弱透明質(zhì)酸酶HYAL1的活性，抑制癌細胞的增殖和侵襲。Jordan等[15]發(fā)現(xiàn)，在膀胱癌的臨床前模型中，sHA可能通過抑制血管生成和HA受體-PI-3K/AKT信號，從而抑制癌細胞增殖、遷移和侵襲，表現(xiàn)抗腫瘤活性。Koutsakis等[16]用Mr50×103的HA和sHA處理乳腺癌細胞，在抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力方面，sHA效果更顯著；進一步研究表明，sHA抗癌活性可能與其更強地促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標記物表達、抑制基質(zhì)金屬蛋白酶表達有關。Spinelli等[17]評估不同取代度sHA（0.7，sHA1；2.5，sHA3）對乳腺癌、肺癌和結直腸癌模型腫瘤細胞的作用及對腫瘤微環(huán)境中的其他細胞（如單核/巨噬細胞）的作用，結果表明，在腫瘤細胞中sHA3能降低細胞活性并誘導細胞毒性，sHA3未引起細胞凋亡但顯著降低細胞增殖率，即sHA3通過誘導細胞凋亡以外的分子死亡機制影響癌細胞的死亡；進一步研究表明，sHA降低單核/巨噬細胞中血管生成因子和結合蛋白（如腫瘤壞死因子α誘導蛋白6）表達，下調(diào)HA水平，進而誘導形成抗腫瘤和抗血管生成微環(huán)境。

2.2 抗凝血

肝素是常見的臨床用天然抗凝劑，但過高的抗凝血作用會誘發(fā)不良反應。Magnani等[18]合成了7種不同取代度sHA并進行抗凝血實驗研究，結果表明，sHA的抗凝血作用隨取代度增加而提高，但與天然肝素相比，其顯示更弱的全身抗凝活性?？鼓窱II（AT-III）與肝素結合被活化，進而與凝血酶相互作用并抑制血液凝固。Miura等[19]分別向血漿中添加肝素和sHA，通過測量殘余凝血酶量評估AT-III的活性，結果表明，與肝素不同，sHA不能促進人血漿中AT-III與凝血酶的結合，故表現(xiàn)出更弱的抗凝血作用。

2.3 抗炎

Savage等[20]研究高取代度sHA對牙周炎的抑制作用發(fā)現(xiàn)高取代度sHA抑制與牙周炎的發(fā)生密切相關的多個因素，如牙齦桿菌生長和生物膜形成、Toll樣受體2/ Toll樣受體4介導的細胞激活和體外破骨細胞的形成等。這種對牙周炎多種介質(zhì)的聯(lián)合作用有助于預防或治療牙周炎。Jouy等[21]研究表明，高取代sHA對體外培養(yǎng)的人巨噬細胞有很強的抗炎作用，即使被降解至低分子量依然能保持活性，彌補了作為抗炎藥的高分子量HA用于炎癥環(huán)境時可能被降解致使無效或促炎的缺陷。Pulsipher等[22]研究sHA對口腔黏膜炎的影響，sHA可靶向模式識別受體并抑制下游促炎細胞因子表達，有效干預輻射誘導的小鼠的口腔黏膜炎，且可在不干擾輻射治療的情況下誘導腫瘤消退，有望成為一種潛在治療藥物。

2.4 對細胞因子和酶的作用

2.4.1 轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1） 轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）是一組調(diào)節(jié)細胞遷移、黏附、增殖和分化[23-25]的細胞因子。其中，TGF-β1活性最強，在調(diào)節(jié)炎癥反應、免疫反應，廣泛參與體內(nèi)各種生理、病理過程中起作用。Smissen等[26]研究表明，含有sHA的人工細胞外基質(zhì)可顯著降低TGF-β1的生物活性。另外，sHA通過占用結合位點阻止TGF-β1的信號通路，從而減少TGF-β1驅(qū)動的真皮成纖維細胞分化。Koehler等[27]通過表面等離子體共振檢測TGF-β1受體復合物與sHA的相互作用，發(fā)現(xiàn)高取代sHA阻斷了TGF-β1與轉(zhuǎn)化生長因子β1型受體（TβR-I）和轉(zhuǎn)化生長因子βII型受體（TβR-II）的結合。進一步研究表明，sHA更傾向結合TGF-β1上的TβR-I位點，形成的復合物又會阻礙配體與TβR-II位點的結合。然而向TβR-II/TGF-β1復合物中添加高取代sHA可顯著提升與TβR-I的結合，表明結合順序非常重要。因sHA衍生物對TGF-β1生物活性的抑制作用可能有助于局部干預TGF-β1驅(qū)動的皮膚纖維化，故其是很有前景的功能性生物材料。

2.4.2 堿性成纖維細胞生長因子（bFGF） 人誘導多能干細胞（hiPSCs）保持未分化狀態(tài)，具有多能性，有望應用于藥物開發(fā)[28]、發(fā)育研究[29]、免疫調(diào)節(jié)[30]和再生醫(yī)學[31]等諸多領域。bFGF是維持hiPSC未分化狀態(tài)的重要信號因子。已有研究表明，在人星形膠質(zhì)細胞和人表皮角質(zhì)形成細胞的培養(yǎng)過程中加入sHA，可促進bFGF信號傳導[32]。機制研究表明[33]，sHA對bFGF有很高的結合親和力，二者結合后可增強bFGF/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）信號傳導，并在無養(yǎng)料和無bFGF條件下維持hiPSC的未分化狀態(tài)和多能性。同時，HA不會與bFGF結合或促進bFGF/ERK信號轉(zhuǎn)導，也不能維持hiPSC的未分化狀態(tài)。這為避免人為添加bFGF所帶來的高成本及可能的異種污染提供了解決方案。

2.4.3 血管內(nèi)皮生長因子165（VEGF165） 血管內(nèi)皮生長因子A（VEGF-A）是一種同二聚體糖蛋白，是生理和病理血管生成中最有效和特異的調(diào)節(jié)劑。VEGF165是VEGF-A的主要亞型，在細胞外基質(zhì)中與硫酸化糖胺聚糖（sGAG）相互作用并在血管生成、血管內(nèi)皮細胞存活中發(fā)揮作用。Koehler等[34]通過實驗和計算研究證實，sGAG干擾VEGF165與血管內(nèi)皮生長因子受體-2的相互作用，抑制了VEGF165的生物活性，從而發(fā)揮抗血管生成的作用。這一發(fā)現(xiàn)為sGAG衍生物在血管生成過程中的調(diào)節(jié)潛力提供了新的見解，并為sGAG在治療異常血管生成方面的應用前景指明了方向。

2.4.4 基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）與組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMP） 細胞外基質(zhì)是一個高度動態(tài)的網(wǎng)絡，通過微調(diào)蛋白質(zhì)的形成和降解平衡不斷重塑。MMP是細胞外基質(zhì)降解的關鍵協(xié)調(diào)者，活性受TIMP和GAG控制。在慢性創(chuàng)傷中，MMP和TIMP之間的不平衡會導致病理性的細胞外基質(zhì)降解，需要新的適應性生物材料與這些調(diào)節(jié)因子相互作用重建平衡。Rother等[35]研究表明，sHA以一種明確的方式隔離TIMP-3，而不改變其對基質(zhì)金屬蛋白酶1（MMP-1）和基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）的抑制電位，因此有望通過sHA調(diào)節(jié)TIMP-3水平，從而控制細胞外基質(zhì)的重塑。Ruiz-Gómez等[36]研究MMP-2與不同GAG（硫酸軟骨素、HA、sHA和肝素）的相互作用，以及GAG對MMP-2/TIMP-3復合物形成的影響發(fā)現(xiàn)，sHA降低MMP-2和TIMP-3蛋白水平及MMP-2活性，且只有sHA支持這兩種蛋白在纖維狀結構中的排列。模型結果表明，sHA通過抑制它們的相互作用，影響TIMP-3誘導的MMP-2抑制。

2.4.5 透明質(zhì)酸酶 探索能特異性阻斷透明質(zhì)酸酶的抑制劑有利于相應疾病治療的發(fā)展。Isoyama等[37]評估21種抗透明質(zhì)酸酶1（HYAL-1）、睪丸、蜂毒和鏈霉菌透明質(zhì)酸酶抑制劑發(fā)現(xiàn)，sHA能最有效地抑制 HYAL-1，但也能降低蜂毒透明質(zhì)酸酶和睪丸透明質(zhì)酸酶的活性。細胞遷移誘導透明質(zhì)酸酶1（CEMIP）是最近發(fā)現(xiàn)的一種透明質(zhì)酸酶，通過不同于其他透明質(zhì)酸酶的機制和條件切割HA。Schmaus等[38]研究表明，高取代sHA可有效抑制CEMIP活性，且其抑制CEMIP的選擇性高于其他透明質(zhì)酸酶。此外，高取代sHA對HA水平的影響是通過CEMIP抑制介導，表明sHA衍生物抑制CEMIP在依賴于CEMIP功能的病理條件下具有潛在效用。

3 應用

3.1 傷口敷料

Rother等[39]將膠原蛋白和高取代sHA組成的人工細胞外基質(zhì)加入HA/膠原基水凝膠中，所得改良水凝膠可結合大量TGF-β1，并延緩凝膠中生長因子釋放，通過重新平衡失調(diào)的TGF-β1誘導的細胞反應來改善皮膚修復。Th?nes等[40]研究表明，含有sHA的凝膠可在較長時間內(nèi)結合并緩慢釋放肝素結合表皮生長因子，從而誘導角質(zhì)形成細胞遷移和表皮生長因子受體信號傳導等，進而促進傷口愈合。除此之外，含sHA的水凝膠被證實可用于調(diào)節(jié)炎癥巨噬細胞活性和緩釋VEGF165，以改善皮膚創(chuàng)面愈合結果，故在傷口愈合材料方面表現(xiàn)出應用潛力[41-42]。

3.2 組織支架、涂層

Guarise等[43]合成了一種多巴胺功能化sHA負載抗生素，將所得材料用于涂覆鈦假體。帶負電荷的sHA既能高效地與帶正電荷的抗生素進行靜電結合加以固定，又能起到骨再生作用。通過從植入物涂層持續(xù)釋放抗生素，抑制細菌傳播；后續(xù)體外實驗進一步驗證了該涂層的抗菌性[44]。Al-Maawi等[45]將高取代sHA與膠原纖維結合獲得功能化膠原基支架。細胞實驗表明，該支架可減少細胞因子VEGF、TGF-β1釋放，增加白細胞介素8和上皮生長因子釋放，并在30 d后可充分融入植入?yún)^(qū)并保持穩(wěn)定的結構，有望成為一種全層皮膚再生支架。Krieghoff等[46]將含有sHA的人工細胞外基質(zhì)包覆在支架上，研究評估所得支架的成骨潛力。結果表明，加入高取代sHA可提升小鼠和人間充質(zhì)干細胞的成骨能力和礦化能力，表明涂層對成骨有積極作用。Kemkemer等[47]研制了一種含水的高分子量sHA涂層，用于改善熱塑性聚碳酸酯聚氨酯彈性體（TPCU）的表面性能；該功能化不僅提高材料生物相容性，也可增加TPCU的耐磨性；體外實驗表明，使用該涂層后的TPCU支架表面的軟骨細胞增殖明顯增強。

3.3 治療性藥物、材料

Kabra等[48]研究表明，sHA既能抑制膠原介導的血小板結合，又能抑制血小板衍生生長因子活性，故可作為一種潛在的肝纖維化治療藥物。Dickkopf-1（Dkk1）是一種與骨愈合相關的Wnt抑制因子，Gronbach等[49]證實sHA對Dkk1具有有效清除作用，結合sHA的生物大分子材料有望應用于未來成骨和骨缺損愈合相關的臨床。Nguyen等[50]將不同取代度sHA和胺基封端的聚（N-異丙基丙烯酰胺）偶聯(lián)獲得了一種治療性熱凝膠，用于治療角膜炎癥，該治療劑對眼表面具有熱響應性，能輸送sHA至少7 d，因此在角膜區(qū)域可有效發(fā)揮抗炎和延長治療活性的效果。

3.4 藥物輸送

Purcell等[51]開發(fā)了硫酸化和甲基丙烯酸酯改性的HA大分子單體，并通過自由基引發(fā)的交聯(lián)將它們整合到HA水凝膠中。研究表明，sHA大分子單體與肝素結合蛋白（SDF-1α）具有與肝素相當?shù)挠H和力，故該功能化水凝膠可有效減緩包裹的SDF-1α釋放，用于各種藥物輸送應用。CN110200911A[52]公布了一種sHA-阿霉素（DOX）聚合物和sHA-甘草次酸聚合物自組裝組成混合納米膠束，實現(xiàn)了肝癌靶向給藥和DOX在腫瘤細胞內(nèi)的有效釋放，從而實現(xiàn)更強的腫瘤抑制作用。

4 展望

隨著對sHA研究的進行和報告，功效及其基本功效機制已有了大體的認知，但其背后更深一層的原理及機制如對細胞因子的調(diào)節(jié)方面，還需更多研究以豐富其理論，才能更好地指引未來應用。同時，sHA的應用研究多局限于實驗室或動物模型階段，臨床轉(zhuǎn)化尚需更多研究提供信息與數(shù)據(jù)以進一步驗證其功效。

總之，sHA是一種極具前景的HA衍生物，隨著未來研究及臨床的逐漸深入，相信sHA的功效機制會被不斷揭曉，相應應用也會被不斷挖掘和擴充，在各研究領域必將不斷誕生出更多成熟產(chǎn)品。