外泌體RNA作為胃癌診斷生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展

鄧柯 綜述 劉琦,彭湃瀾 審校

胃癌是第五大最常見的癌癥,也是導(dǎo)致癌癥死亡的第三大原因[1]。胃癌早期通常缺乏明顯癥狀,而患者出現(xiàn)典型癥狀后往往已達(dá)到中晚期,此時(shí)患者的存活率很低,其5年存活率低于20%。而早期胃癌的5年生存率可達(dá)90%以上[2]。因此早期診斷能顯著提高胃癌患者的生存率。目前早期胃癌的診斷方法仍主要是內(nèi)鏡檢查和活檢,但內(nèi)鏡檢查有著一定的漏診率[3-4],以及具有侵入性和組織樣本有限等缺點(diǎn),而腫瘤生物標(biāo)志物以其安全性高及可重復(fù)采集,便于動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn),相較于內(nèi)鏡及活檢更易被受檢者接受。因此液體活檢成為胃癌早期診斷的一種有前途的檢測(cè)手段,故尋找特異性和敏感性均高的胃癌生物標(biāo)志物對(duì)于胃癌患者早診斷有著重要意義。

1 外泌體(Exosomes)

外泌體于1983年由Pan和Johnstone等首次發(fā)現(xiàn)[5],是幾乎所有正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分泌的一類直徑在30～150 nm的膜結(jié)合雙層脂質(zhì)囊泡,與細(xì)胞質(zhì)膜融合后從多種細(xì)胞中釋放到細(xì)胞外[6],廣泛分布于體液中,如血液、尿液、唾液、腦脊液、膽汁、母乳、精液等[7],其內(nèi)包括蛋白質(zhì)、代謝物、脂質(zhì)、氨基酸、多種RNA等物質(zhì)[8],外泌體RNA包括長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)、環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)、微小RNA(microRNA,miRNA)等[9],外泌體通過將其內(nèi)容物傳遞到受體細(xì)胞來參與細(xì)胞間通訊,腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體通過促進(jìn)癌癥增殖,抑制細(xì)胞凋亡,建立轉(zhuǎn)移前的生態(tài)位,在細(xì)胞間傳遞信息以及調(diào)節(jié)耐藥,在惡性腫瘤中起著關(guān)鍵作用。Liu等[10]研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體比正常細(xì)胞多約10倍,導(dǎo)致患者體液中外泌體的濃度顯著高于正常人。傳統(tǒng)生物標(biāo)志物癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、CA199(carbohydrate antigen 19-9)、CA724(carbohydrate antigen 724)的敏感度及特異度均較低[11-12],而外泌體作為雙層脂質(zhì)囊泡,可保護(hù)其轉(zhuǎn)運(yùn)的RNA免受核酸酶的降解,并且在各種溫度和pH條件下保持穩(wěn)定,因此腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體可以較準(zhǔn)確地反映癌癥的發(fā)生及其發(fā)展變化,外泌體檢測(cè)具有快速精確、采集方便、可重復(fù)采集、疼痛小、能夠追蹤腫瘤進(jìn)展等特點(diǎn)[13-14],是可運(yùn)用于臨床的理想液體活檢技術(shù),因此外泌體作為以非侵入方式進(jìn)行癌癥診斷的生物標(biāo)志物具有重要臨床前景。

2 長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)

lncRNA是一組長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸的非編碼RNA,在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控多種細(xì)胞功能,lncRNA通過基因表達(dá)調(diào)控腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展。lncRNA作為癌癥生物標(biāo)志物,在胃癌組織及體液中大量表達(dá),大量研究表明循環(huán)lncRNA可作為胃癌診斷的生物標(biāo)志物[15]。Cao等[16]發(fā)現(xiàn)lncRNA在胃癌組織中表達(dá)具有差異性,大部分的lncRNA表達(dá)上調(diào)。Xiao等[17]在進(jìn)一步研究胃癌中l(wèi)ncRNA的表達(dá)時(shí),檢測(cè)到520個(gè)lncRNA差異表達(dá),其中有328個(gè)表達(dá)上調(diào),192個(gè)表達(dá)下調(diào),且通過對(duì)差異表達(dá)的lncRNA進(jìn)行層次聚類分析,結(jié)果表明差異表達(dá)的lncRNA可以準(zhǔn)確地區(qū)分出正常組織和癌癥組織。Guo等[18]研究表明總循環(huán)lncRNA-GC1幾乎都包含在外泌體中,且循環(huán)外泌體lncRNA-GC1的水平與胃癌組織中表達(dá)一致。這或許提示檢測(cè)胃癌患者循環(huán)中的外泌體長(zhǎng)鏈非編碼RNA表達(dá)水平,相對(duì)于檢測(cè)胃癌組織同樣具有診斷意義。Zhou等[19]計(jì)算出循環(huán)外泌體lncRNA H19的ROC曲線下面積(AUC)為0.849,高于傳統(tǒng)的生物標(biāo)志物CEA(0.721)、CA72-4(0.588)、CA199(0.640),且外泌體lncRNA H19聯(lián)合以上3種傳統(tǒng)胃癌生物標(biāo)志物診斷胃癌的AUC為0.864,與單獨(dú)檢測(cè)外泌體lncRNA H19的AUC(0.849)并沒有顯著的差別。這表明外泌體lncRNA H19診斷胃癌患者的能力明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的胃癌生物標(biāo)志物,意味著其可能成為未來的胃癌診斷標(biāo)志物。Guo等[18]發(fā)現(xiàn)循環(huán)外泌體lncRNA-GC1水平與胃癌分期有顯著關(guān)系,隨著分期的遞增lncRNA-GC1水平逐漸升高(HD與Ⅰ期,t=20.98,P<0.001;Ⅰ期與Ⅱ期,t=2.787,P=0.006;Ⅱ期與Ⅲ期,t=4.471,P<0.001;Ⅲ期與Ⅳ期,t=1.023,P=0.03),表明循環(huán)外泌體lncRNA-GC1可作為早期檢測(cè)胃癌的非侵入性生物標(biāo)志物,且表達(dá)水平越高暗示著患者分期達(dá)晚期的可能性越大。同樣Wei等[20]計(jì)算出lncRNA NR0389785在胃癌患者體液中顯著過表達(dá)其AUC為0.715,且與腫瘤的大小及TNM分期呈正相關(guān)(P<0.05)。Zheng等[21]通過實(shí)驗(yàn)表明胃癌患者的外泌體長(zhǎng)鏈非編碼RNA lnc-SLC2A12-10:1表達(dá)水平較健康對(duì)照組顯著上調(diào),且在最優(yōu)臨界值下外泌體lnc-SLC2A12-10:1的敏感度及特異度分別為78.3%和75.0%,患者術(shù)后的外泌體lnc-SLC2A12-10:1較術(shù)前的表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)。這意味著血液循環(huán)中的外泌體長(zhǎng)鏈非編碼RNA來源于胃癌患者的癌組織細(xì)胞。Xu等[22]研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者血清外泌體lncRNA MIAT的表達(dá)水平顯著高于胃腺瘤(P<0.001)及健康對(duì)照組(P<0.001),并且胃腺瘤患者血清外泌體lncRNA MIAT高于健康對(duì)照組(P=0.001),在胃癌患者接受治療后,患者血清外泌體lncRNA MIAT水平顯著降低(P<0.001),復(fù)發(fā)時(shí)表達(dá)水平明顯升高,且高水平的患者組復(fù)發(fā)率高于低水平表達(dá)患者組。同樣Xiao等[23]研究證明胃癌患者循環(huán)lncRNA CCTA1表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照組、慢性胃炎組及非典型增生患者組,其中非典型增生組表達(dá)水平也高于健康對(duì)照組(P均<0.05)。這些都表明了外泌體長(zhǎng)鏈非編碼RNA在不同胃組織的不同病理階段中表達(dá)不同,且表達(dá)量越高對(duì)于胃癌檢測(cè)越有提示意義,同時(shí)表達(dá)量高的患者預(yù)后相對(duì)于表達(dá)量低的患者更差。Li等[24]實(shí)驗(yàn)得出胃癌患者循環(huán)中的外泌體lncRNA-GNAQ-6:1表達(dá)量顯著降低,其AUC為0.732,高于CEA、CA19-9、CA72-4,但還需要更大規(guī)模的研究來確定其是否可成為胃癌患者診斷的生物標(biāo)志物。Cai等[25]經(jīng)實(shí)驗(yàn)得出與健康對(duì)照組相比,胃癌患者外泌體長(zhǎng)鏈非編碼RNA-psck2-2:1表達(dá)量顯著下降(P=0.006),其AUC為0.896,敏感度及特異度分別為84.0%、86.5%,顯著高于CA724的敏感度(56.0%)及特異度(65.5%),CA199(52.0%、62.0%)。Pang等[26]表明lncRNA-LINC00857表達(dá)下調(diào)抑制胃癌細(xì)胞增殖。Chen等[27]的研究表明lncRNA-LINC01939在胃癌患者中表達(dá)顯著下調(diào),且低表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),lncRNA-LINC01939低表達(dá)與胃癌的進(jìn)展及生存率低有關(guān)。表明不同類型的長(zhǎng)鏈非編碼RNA在胃癌患者與健康人群中體液的表達(dá)水平不同,且長(zhǎng)鏈非編碼RNA的顯著上調(diào)及下調(diào)均意味著胃癌患者的預(yù)后相對(duì)較差。長(zhǎng)鏈非編碼RNA在診斷胃癌時(shí)較傳統(tǒng)生物標(biāo)志物具有更高的敏感度及特異度,因此檢測(cè)胃癌患者體液中長(zhǎng)鏈非編碼RNA的差異表達(dá)對(duì)診斷胃癌患者具有重要的意義。

3 微小RNA(miRNA)

miRNA是一種具有17～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性短鏈非編碼RNA,直接通過與靶向mRNA的3’-UTR中的互補(bǔ)序列結(jié)合,來調(diào)節(jié)相應(yīng)的mRNA降解抑或翻譯,miRNA在細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移、凋亡等過程中起著重要的作用[28]。Ge等[29]研究表明在血清外泌體中的miRNA中有136個(gè)miRNA表達(dá)水平上調(diào)和170個(gè)miRNA表達(dá)水平下調(diào)。研究表明胃癌患者在出現(xiàn)臨床體征或異常影像學(xué)之前,外泌體miRNA在血源性轉(zhuǎn)移胃癌患者中就已經(jīng)失調(diào)了[30]。Shi等[31]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)血清外泌體miR-1246表達(dá)水平增加可以區(qū)分TNM Ⅰ期胃癌患者與健康對(duì)照及良性疾病患者,AUC分別為0.843和0.811。Tang等[32]經(jīng)研究得出外泌體miRNA let-7g-5p在鑒別早期胃癌與健康對(duì)照組的AUC為0.756(95%CI0.659～0.892,臨界值<4.184,敏感度54%,特異度88%),明顯高于CEA的AUC值(0.520,95%CI0.405～0.635,臨界值<1.440,敏感度38%,特異度70%)。提示外泌體miRNA較傳統(tǒng)生物標(biāo)志物更利于胃癌的診斷。血漿外泌體miR-195-5p和miR-211-5p表達(dá)水平更高的胃癌患者預(yù)后相對(duì)于表達(dá)水平低的患者更差[33]。Zhang等[34]指出胃癌患者血清外泌體miR-215-5p表達(dá)水平較健康受試者及良性胃疾病(Benign gastric disease,BGD)患者表達(dá)水平明顯升高(P<0.001),而當(dāng)患者行胃切除術(shù)后血清中外泌體miR-215-5p的水平顯著降低(P<0.001),而在手術(shù)患者中的ETR(early tumor recurrence)患者水平則又顯著升高(P<0.001)。因此當(dāng)血清外泌體miRNA在手術(shù)治療后明顯下降甚至正常,則提示預(yù)后好,而當(dāng)下降后又再次升高,則可能提示復(fù)發(fā),預(yù)后則較差。Wang等[35]研究得出血清外泌體miR-10401-3p、miR-1255b-5p、miR-6736-5p在胃癌患者組表達(dá)水平顯著下降(P<0.05),miR-10401-3p 的AUC為0.833(P<0.001), miR-1255b-5p的AUC為0.832(P<0.001)、miR-6736-5p的AUC為0.814(P<0.001),證明了血清外泌體作為胃癌診斷的生物標(biāo)志物的巨大潛力。Zheng等[36]的研究表明,血清外泌體miR-590-5p在胃癌患者表達(dá)水平顯著降低,在健康對(duì)照組、早期(Ⅰ、Ⅱ期)、晚期(Ⅲ期)中的血清外泌體miR-590-5p表達(dá)水平分別為30.34±6.35、6.19±0.81、2.90±0.19(均P<0.05)。表明其表達(dá)水平與胃癌患者的分期呈負(fù)相關(guān),不僅有利于胃癌患者的早期檢測(cè),還利于對(duì)胃癌患者進(jìn)行病理診斷分期。相關(guān)研究表明外泌體miRNA-3184-5p可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,但胃癌患者中的外泌體miRNA-3184-5p表達(dá)水平下調(diào),以致于抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用減弱[37]。Jin等[38]指出胃癌患者血清外泌體miRNA-134表達(dá)水平降低,而表達(dá)低的患者的總生存期及無復(fù)發(fā)生存期較短。表明檢測(cè)外泌體miRNA表達(dá)水平對(duì)于判斷機(jī)體是否患有胃癌及預(yù)后具有重要臨床意義。

4 環(huán)狀RNA(circRNA)

環(huán)狀RNA是一種非編碼的共價(jià)閉環(huán)內(nèi)源性RNA,于1970年由Sanger等[39]在RNA病毒中發(fā)現(xiàn)和鑒定,由于其沒有5’帽端及3’聚(A)尾,因此對(duì)RNase R和其他核酸外切酶具有抗性而穩(wěn)定存在。環(huán)狀RNA主要通過作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、miRNA海綿以及與蛋白質(zhì)相互作用而發(fā)揮其主要作用[40]。環(huán)狀RNA在胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡等過程中發(fā)揮重要的作用,因其高度穩(wěn)定性及廣泛分布于外泌體中,環(huán)狀RNA在作為胃癌生物標(biāo)志物方面具有巨大潛力[41],其中hsa_circ_0074362、hsa_circ_0000096、has_circ_0061276、has_circ_0001017、circNRIP1、cricKIAA244、circPSMC3、circ133、cricPVT1、circAKT3、circDONSON、circPVRL3等已被作為篩查胃癌的潛在生物標(biāo)志物[42]。Lu等[43]發(fā)現(xiàn)circ-RanGAP1在胃癌組織及胃癌患者的血漿外泌體中表達(dá)量均顯著上調(diào)。Shi等[44]表明胃癌組織中的circ0088300表達(dá)水平與在血漿外泌體中的表達(dá)水平相對(duì)應(yīng)。同樣Xie等[45]證明circSHKBP1在胃癌組織中的表達(dá)量較正常組織高2.31倍(P<0.05),胃癌患者血清中的外泌體circSHKBP1與胃癌患者腫瘤組織中的circSHKBP1水平一致,且血清中表達(dá)量約為腫瘤組織中的6倍(R2=0.679、P<0.001)。這或許表明相對(duì)于侵入性的胃癌組織活檢,檢測(cè)胃癌患者血清中的外泌體環(huán)狀RNA對(duì)診斷胃癌具有同樣的意義。Xiao等[46]通過實(shí)驗(yàn)研究3種外泌體環(huán)狀RNA(circRNA Chr10q11、circRNA Chr7q11、circRNA1p11)在胃癌外泌體中的表達(dá),結(jié)果顯示3種外泌體環(huán)狀RNA在健康受試者組、慢性胃炎組、非典型增生組、胃癌組中的表達(dá)量呈上升趨勢(shì),且各組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,此外結(jié)果還表明,3種外泌體環(huán)狀RNA在Ⅲ期+Ⅳ期的表達(dá)量均顯著高于Ⅰ期+Ⅱ期(均P<0.05)。Zhang等[47]根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得出血清hsa-circ-0007507診斷胃癌的AUC值為0.832(95%CI0.771～0.892,P<0.001,敏感度73%,特異度85%),高于傳統(tǒng)生物標(biāo)志物CEA的AUC值(0.765,95%CI0.697～0.833,P<0.001)及CA199的AUC值(0.587,95%CI0.504～0.670,P=0.044),而hsa-circ-0007507分別聯(lián)合CEA、CA199及三者聯(lián)合的AUC為0.839、0.835、0.849,表明單獨(dú)檢測(cè)hsa-circ-0007507的診斷效能高于傳統(tǒng)生物標(biāo)志物,并且多種生物標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)可以彌補(bǔ)單一生物標(biāo)志物的局限性。Zheng等[48]表明術(shù)后10 d患者外泌體hsa_circ_0015286的表達(dá)水平顯著下降(P<0.01),且低表達(dá)組的患者相對(duì)于高表達(dá)組的患者總生存率長(zhǎng)。說明監(jiān)測(cè)患者手術(shù)前后的外泌體環(huán)狀RNA的表達(dá)量可判斷患者的預(yù)后及生存率。胃癌細(xì)胞的circ0001789表達(dá)量顯著高于正常胃上皮細(xì)胞,circ0001789表達(dá)上調(diào)與胃癌的進(jìn)展及預(yù)后不良有關(guān),高表達(dá)患者存活率明顯高于低表達(dá)患者[49]。Rao等[50]從鑒定出來的67 880個(gè)circRNA中篩選出1 060個(gè)表達(dá)顯著不同的circRNA,其中有620個(gè)circRNA上調(diào)及440個(gè)circRNA下調(diào)。Li等[51]研究證實(shí)Hsa_circ006282在胃癌細(xì)胞和組織中低表達(dá),其低表達(dá)后細(xì)胞增殖、抗凋亡能力增強(qiáng)。Zhang等[52]發(fā)現(xiàn)circSTAU2在胃癌患者中顯著下調(diào),然而circSTAU2的過表達(dá)在體內(nèi)體外都可抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。Lu等[53]通過研究表明胃癌患者血漿Has-circ-0006848顯著下調(diào),在評(píng)估各生物標(biāo)志物檢測(cè)早期胃癌的診斷價(jià)值時(shí),得出Has-circ-0006848、CEA、CA199、CA72-4表達(dá)水平的AUC分別為0.733、0.529、0.562、0.594,四者聯(lián)合檢測(cè)的AUC為0.825,在CEA、CA199、CA72-4表達(dá)水平均正常的早期胃癌血漿中,Has-circ-0006848診斷的AUC為0.692,表明其單獨(dú)及聯(lián)合傳統(tǒng)生物標(biāo)志物具有良好的診斷意義。同樣有研究指出胃癌患者的血漿外泌體circRELL1表達(dá)水平下調(diào),且與較差的分級(jí)及分期有關(guān),而胃癌患者術(shù)后血漿外泌體circRELL1表達(dá)水平升高[54]。表明外泌環(huán)狀RNA相對(duì)于傳統(tǒng)生物標(biāo)志物對(duì)篩查及診斷胃癌具有良好的診斷價(jià)值。

5 結(jié) 語(yǔ)

胃癌仍是世界上發(fā)病率和病死率均較高的惡性腫瘤之一,胃癌的早診斷對(duì)于患者的早治療至關(guān)重要。近年來,液體活檢作為一種非侵入性腫瘤篩查方法受到了極大的關(guān)注,檢測(cè)體液中的外泌體RNA表達(dá)水平在胃癌患者的早期發(fā)現(xiàn)、評(píng)估分期、治療評(píng)估、監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)和預(yù)后評(píng)估中具有重要的意義。但目前臨床上仍缺乏特異度及敏感度都較高的外泌體RNA作為生物標(biāo)志物。有研究表明聯(lián)合檢測(cè)不同的腫瘤標(biāo)志物能提高胃癌早期診斷的陽(yáng)性率[55],也可以準(zhǔn)確地判斷胃癌的遷移和侵襲、預(yù)后等。因此迫切需要開發(fā)出常規(guī)的、無創(chuàng)的、具有高度組織器官特異性的外泌體RNA生物標(biāo)志物,以早期診斷胃癌并指導(dǎo)治療,提高患者的生存率及改善預(yù)后。今后對(duì)于胃癌外泌體RNA生物標(biāo)志物的研究可從以下方面發(fā)展:通過大規(guī)模的臨床試驗(yàn)尋找并且驗(yàn)證高特異度及高敏感度的外泌體RNA生物標(biāo)志物;找到針對(duì)癌癥不同病理類型的更加特異的外泌體RNA生物標(biāo)志物;聯(lián)合檢測(cè)不同的胃癌生物標(biāo)志物對(duì)胃癌進(jìn)行診斷等。