新疆部分地區(qū)屠宰場羊源細(xì)粒棘球蚴分子鑒定及其遺傳多樣性分析

薛 文，王凌云，王云峰，張振杰，趙愛云，王 甜，齊 萌

（1.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木動(dòng)物疫病診斷與防控工程實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾843300；2.新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，新疆 烏魯木齊 830010）

細(xì)粒棘球絳蟲（Echinococcus granulosus）的中絳期幼蟲——細(xì)粒棘球蚴，常寄生于人和多種動(dòng)物的肝臟、肺臟等器官，導(dǎo)致機(jī)械性損傷、毒素作用和過敏反應(yīng)，嚴(yán)重威脅畜牧業(yè)健康發(fā)展和公共衛(wèi)生安全［1］。羊是細(xì)粒棘球蚴重要的中間宿主，感染率可達(dá)90%以上，該病原引起的疾病以囊型包蟲?。╟ystic echinococcosis，CE）為主，是我國重點(diǎn)防治的人獸共患病之一［2］。羊感染細(xì)粒棘球蚴后，臨床多表現(xiàn)為生長緩慢、發(fā)育不良、消瘦、咳嗽和肝炎等［3］。羊感染細(xì)粒棘球蚴的活體診斷較為困難，常采用屠宰時(shí)檢查羊肝臟和肺臟中有無棘球蚴包囊作為確診方法［4］。

基于細(xì)粒棘球蚴線粒體細(xì)胞色素C 氧化酶1（mitochondria cytochrome C oxidase subunit 1）基因（cox1）和NADH 脫氫酶1 （NADH dehydrogenase subunit 1）基因（nad1）的核酸序列分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)粒棘球蚴有10 種基因型（G1～G10），不同國家或地區(qū)的基因型存在地理隔離分布和宿主適應(yīng)性差異［5-6］。在新疆維吾爾自治區(qū)，羊感染細(xì)粒棘球蚴呈高發(fā)態(tài)勢(shì)［7］。該研究旨在對(duì)新疆部分地區(qū)屠宰場羊源細(xì)粒棘球蚴進(jìn)行分析鑒定和遺傳特征分析，為羊包蟲病的防治提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣本來源

于2020 年1 月—2022 年6 月，分別于新疆維吾爾自治區(qū)和靜縣、和碩縣、輪臺(tái)縣、尉犁縣、焉耆回族自治縣、烏魯木齊市米東區(qū)、吐魯番市高昌區(qū)、托克遜縣、特克斯縣、昭蘇縣、新源縣、伊寧縣、吉木薩爾縣、阜康市、木壘哈薩克自治縣和呼圖壁縣共計(jì)16 個(gè)縣（區(qū)）定點(diǎn)屠宰場采集96 份含細(xì)粒棘球蚴包囊的羊肝臟。將采集的肝臟樣本裝于采樣袋中帶回實(shí)驗(yàn)室使用蒸餾水將表面沖洗干凈，用75%酒精進(jìn)行擦拭，待提取基因組DNA。

1.1.2 主要試劑

組織基因組DNA 提取試劑盒（EasyPure Genomic DNA Kit）、2 × EasyTaq PCR SuperMix （+dye）、DNA Marker DL 2 000，均為北京全式金生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

Sorvall Legend Micro 17 型微量離心機(jī)，Thermo Scientific 公司產(chǎn)品；MC proS PCR 儀，Eppendorf公司產(chǎn)品；DYY-7C 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、JY 系列電泳槽，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；Gel Doc XR+型凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad 公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA 提取

對(duì)于無囊液的肝臟包囊樣本，取黃豆大小的包囊囊壁用組織研磨器研磨，將100 μL 研磨好的組織樣本按照組織基因組DNA 提取試劑盒說明書提取樣本的基因組DNA；對(duì)于有囊液的肝臟包囊樣本，用5 mL 無菌注射器抽取包囊液，將200 μL包囊液轉(zhuǎn)入1.5 mL 離心管，按照組織基因組DNA提取試劑盒說明書提取樣本的基因組DNA。每份樣本提取200 μL 的基因組DNA，置于-20 ℃保存，備用。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

參照Guo 等［8］的文獻(xiàn)報(bào)道合成細(xì)粒棘球蚴線粒體cox1 基因PCR 擴(kuò)增引物，參照Ohiolei 等［9］的文獻(xiàn)報(bào)道合成細(xì)粒棘球蚴線粒體nad1 基因PCR 擴(kuò)增引物，引物信息見表1，由蘇州金維智生物科技有限公司合成。

表1 細(xì)粒棘球蚴線粒體cox1 基因和nad1 基因的PCR 擴(kuò)增引物信息

1.2.3 目的基因的PCR 擴(kuò)增

2 個(gè)基因位點(diǎn)的PCR 反應(yīng)體系均為25 μL：2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye）12.5 μL；上、下游引物各0.3 μL；模板DNA 1 μL；ddH2O 10.9 μL。cox1 基因位點(diǎn)2 輪PCR 反應(yīng)條件均為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變 性1 min，56 ℃退 火1 min，72℃延伸2 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃最后延伸10 min。nad1 基因位點(diǎn)的PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃最后延伸10 min。PCR 擴(kuò)增時(shí)，設(shè)置陽性對(duì)照與陰性對(duì)照，陽性對(duì)照為新疆羊源細(xì)粒棘球蚴基因組DNA，由塔里木大學(xué)獸醫(yī)寄生蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)室鑒定保存，陰性對(duì)照為滅菌ddH2O。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物，于1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)，在凝膠成像儀中觀察結(jié)果。將陽性PCR 產(chǎn)物送至蘇州金維智生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.4 序列分析

基于Chromas Pro（http：//technelysium.com.au/ChromasPro.html）對(duì)全部樣本測(cè)序圖譜進(jìn)行序列校正及上、下游序列拼接；基于cox1 基因和nad1基因位點(diǎn)，分別將測(cè)序成功的序列用ClustalX 2.1軟件（http：//www.clustal.org）進(jìn)行比對(duì)，將比對(duì)校正后的序列在NCBI 的GenBank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性鑒定。利用Dna SP 5.10 軟件（http：//.www.ub.es/dnasp）分別對(duì)該研究所獲得的細(xì)粒棘球蚴cox1基因和nad1 基因序列進(jìn)行單倍型分型。

1.2.5 種系發(fā)育分析

在GenBank 數(shù)據(jù)庫中，下載細(xì)粒棘球絳蟲以及多房棘球絳蟲 （Echinococcus multilocularis）、少節(jié)棘球絳蟲（Echinococcus oligarthra）、石渠棘球絳蟲 （Echinococcus shiquicus）、獅 棘 球 絳 蟲（Echinococcus felidis）等絳蟲的mt-cox1 及mtnad1 基因組序列作為參考序列。在cox1 基因和nad1 基因位點(diǎn)，以泡狀帶絳蟲（Taenia hydatigera）為外群。使用MEGA 7.0 軟件（https：//megasoftware.net），采用最大似然法（maximum likelihood，ML）的時(shí)間可逆取代模型（general time reversible，GTR）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。進(jìn)化樹的可靠性用Bootstrap 分析進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)行1 000 個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 屠宰場羊源細(xì)粒棘球蚴PCR 鑒定情況

采用PCR 法對(duì)96 份肉眼觀察為細(xì)粒棘球蚴的基因組DNA 樣本進(jìn)行擴(kuò)增，基于cox1 基因位點(diǎn)，擴(kuò)增出目的條帶的有81 份樣本（84.37%，81/96），細(xì)粒棘球蚴cox1 基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果見圖1；基于nad1 基因位點(diǎn)，擴(kuò)增出目的條帶的有67份樣本（69.79%，67/96），細(xì)粒棘球蚴nad1 基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果見圖2；結(jié)合2 個(gè)基因位點(diǎn)，共有91份樣本擴(kuò)增出目的條帶（94.79%，91/96），在2 個(gè)位點(diǎn)同時(shí)擴(kuò)增出目的條帶的有57 份樣本。

圖1 細(xì)粒棘球蚴cox1 基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

圖2 細(xì)粒棘球蚴nad1 基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.2 cox1 基因位點(diǎn)的序列分析與鑒定

cox1 基因位點(diǎn)序列比對(duì)分析結(jié)果顯示，81 份陽性樣本序列均屬細(xì)粒棘球蚴G1 基因型（n=81）?；贒na SP 5.10 軟件分析顯示，81 條序列存在15 個(gè)單倍型（Hap_1～Hap_15）。其中，Hap_3 為該研究優(yōu)勢(shì)單倍型，所占比例為71.60%（58/81），與我國西部地區(qū)綿羊源 （GenBank 登錄號(hào)：OQ345777）、意大利牛源和羊源 （GenBank 登錄號(hào)：ON606456、ON606453）的細(xì)粒棘球蚴序列同源性為100%。

Hap_15 有5 條序列，占比為6.17%（5/81）；Hap_1、Hap_4、Hap_8、Hap_10、Hap_14 分 別 有2條序列，占比均為2.47%（2/81）；Hap_2、Hap_5、Hap_6、Hap_7、Hap_9、Hap_11、Hap_12、Hap_13 各有1 條序列，占比均為1.23%（1/81）。上述15 個(gè)單倍型彼此間堿基差異較小，其同源性為99.1%～99.7%。

2.3 nad1 基因位點(diǎn)的序列分析與鑒定

nad1 基因位點(diǎn)序列比對(duì)分析結(jié)果顯示，67 份陽性樣本序列鑒定出2 種基因型，分別為細(xì)粒棘球蚴G1 基因型（n=66）和G3 基因型（n=1）。基于Dna SP 5.10 軟件分析顯示，67 條序列存在19 個(gè)單倍型（Hap_1～Hap_19），其中，Hap_10 為該研究優(yōu)勢(shì)單倍型，所占比例為52.23%（35/67），與哈薩克斯坦、蒙古人源（GenBank 登錄號(hào)：MG672257、MG672255），伊朗、阿根廷綿羊源（GenBank 登錄號(hào)：MG672243、MG672253），巴西、智利牛源（Gen-Bank 登錄號(hào)：MG672230、MG672221），墨西哥、阿根 廷 豬 源 （GenBank 登 錄 號(hào)：MG672259、MG672208）的細(xì)粒棘球蚴序列同源性為100%。

Hap_3 有4 條序列，占比為5.97%（4/67）；Hap_2、Hap_8、Hap_17、Hap_19 分別有3 條序列，占比均為4.48%（3/67）；Hap_1、Hap_4、Hap_11 分別有2 條序列，占比均為2.99%（2/67）；Hap_5、Hap_6、Hap_7、Hap_9、Hap_12、Hap_13、Hap_14、Hap_15、Hap_16、Hap_18 各有1 條序列，占比均為1.49%（1/67）。上述19 個(gè)單倍型彼此間堿基差異較小，其同源性為99.5%～99.9%。

2.4 種系發(fā)育分析

根據(jù)cox1 基因位點(diǎn)序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹可知，該研究所獲新疆綿羊源細(xì)粒棘球蚴G1 基因型序列與參考株G1 基因型和G3 基因型序列聚類形成一個(gè)進(jìn)化支，與其他基因型形成不同進(jìn)化支。優(yōu)勢(shì)單倍型Hap_3 與我國四川省人源細(xì)粒棘球蚴序列（GenBank 登錄號(hào)：AB786664）遺傳距離較近，單倍型Hap_4～6、Hap_10～11、Hap_12～13 分別聚類成單獨(dú)亞群，其他單倍型由于單核苷酸多態(tài)性各自形成小的獨(dú)立分支，提示新疆綿羊源細(xì)粒棘球蚴在cox1 基因位點(diǎn)上呈現(xiàn)遺傳多樣性分布（見圖3）。

圖3 基于細(xì)粒棘球蚴cox1 基因位點(diǎn)構(gòu)建的種系發(fā)育進(jìn)化樹

根據(jù)nad1 基因位點(diǎn)序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果，該研究所獲新疆綿羊源細(xì)粒棘球蚴G1 基因型和G3 基因型序列與參考株G1 基因型和G3 基因型序列聚類形成一個(gè)進(jìn)化支，與其他基因型形成不同進(jìn)化支。以G1 為流行基因型（Hap_1～13、Hap_15～19），而G3 基因型僅有1 個(gè)分離株，為單倍型Hap_14。優(yōu)勢(shì)單倍型Hap_10 與其他各單倍型基于單核苷酸多態(tài)性分別成為獨(dú)立分支；Hap_14 與我國四川省人源細(xì)粒棘球蚴（GenBank登錄號(hào)：KJ559023）遺傳距離較近，歸于同一進(jìn)化分支上，提示新疆綿羊源細(xì)粒棘球蚴在nad1 位點(diǎn)上同樣呈現(xiàn)遺傳多樣性分布（見圖4）。

圖4 基于細(xì)粒棘球蚴nad1 基因位點(diǎn)構(gòu)建的種系發(fā)育進(jìn)化樹

3 討論

世界范圍內(nèi)，羊感染細(xì)粒棘球蚴的病例均有報(bào)道，在以畜牧業(yè)發(fā)展為主的國家地區(qū)呈現(xiàn)高發(fā)流行態(tài)勢(shì)。在伊朗開展的調(diào)查顯示，不同養(yǎng)殖環(huán)境和調(diào)查點(diǎn)，羊細(xì)粒棘球蚴的感染率存在較大差異，感染率為5.1%～74.4%［10］。Guo 等［11］調(diào)查發(fā)現(xiàn)，新疆北疆4 個(gè)屠宰場的羊細(xì)粒棘球蚴感染率為3.5%（44/1 270），不同地區(qū)的感染率存在差異，以阿勒泰地區(qū)羊的感染率較高，為4.6%（9/196），烏魯木齊市羊的感染率較低，為2.5%（13/518）。在克孜勒蘇柯爾克孜自治州屠宰場檢查羊、牛、牦牛等家畜臟器中發(fā)現(xiàn)，羊細(xì)粒棘球蚴攜帶率最高，為8.62%（283/3 283）［12］。Gao 等［13］統(tǒng)計(jì)分析 我 國1983—2020 年綿羊棘球蚴病的相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)我國綿羊棘球蚴平均感染率仍較高，為30.9%（192094/826 406），分析結(jié)果提示在高海拔、寒冷、潮濕、高降雨的地區(qū)，綿羊棘球蚴的感染率更高。我國新疆地區(qū)羊常見感染細(xì)粒棘球蚴，嚴(yán)重危害當(dāng)?shù)厝祟惤】?、公共衛(wèi)生安全和畜牧業(yè)健康發(fā)展，應(yīng)長期加強(qiáng)人和動(dòng)物細(xì)粒棘球蚴病的監(jiān)測(cè)和防治。

目前，細(xì)粒棘球絳蟲分為10 種不同基因型（G1～G10），其中，G1 基因型和G2 基因型常見于綿羊；G3 基因型和G5 基因型常見于牛；G4 基因型常見于馬；G6 基因型常見于駱駝科動(dòng)物；G7 基因型和G8 基因型分別感染豬和鹿科動(dòng)物；G9 基因型在波蘭豬體內(nèi)首次被發(fā)現(xiàn)；G10 基因型在亞歐大陸的馴鹿體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)［6，14-16］。Mehmood 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，G1 基因型具有廣泛的宿主范圍和人獸共患風(fēng)險(xiǎn)，在羊和人之間易傳播流行。在新疆地區(qū)，羊主要感染的是細(xì)粒棘球蚴G1 基因型，在伊犁哈薩克自治州、塔城地區(qū)和烏魯木齊市等地發(fā)現(xiàn)羊還可感染G3 基因型［2，17-18］。Vural 等［19］對(duì)土耳其羊源細(xì)粒棘球蚴分離株樣本進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和序列分析，發(fā)現(xiàn)G1 型基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)感染基因型，同時(shí)發(fā)現(xiàn)感染G3 基因型。該研究對(duì)新疆部分地區(qū)81 條細(xì)粒棘球蚴cox1 基因序列進(jìn)行分析，所有樣本均為G1 基因型，存在15 個(gè)單倍型，不同單倍型之間存在多個(gè)單核苷酸差異，其中，優(yōu)勢(shì)單倍型與意大利、伊朗以及我國新疆維吾爾自治區(qū)、甘肅省等地牛源、羊源和人源的分離株基因序列同源性為100%。對(duì)67 條細(xì)粒棘球蚴nad1 基因序列進(jìn)行分析，66 條鑒定為G1 基因型，1 條鑒定為G3 基因型，存在19 個(gè)單倍型，不同單倍型之間具有單核苷酸多態(tài)性，優(yōu)勢(shì)單倍型與非洲、南美洲、歐洲及亞洲的人、牛、羊和豬等多種動(dòng)物源細(xì)粒棘球蚴基因序列同源性為100%［20］。上述研究結(jié)果表明，新疆部分地區(qū)羊源細(xì)粒棘球蚴具有遺傳多樣性分布特征和較有廣泛的中間宿主范圍，提示存在潛在的人獸共患風(fēng)險(xiǎn)，在流行地區(qū)應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)細(xì)粒棘球蚴病的分子流行病學(xué)調(diào)查。

4 結(jié)論

新疆維吾爾自治區(qū)羊源細(xì)粒棘球蚴呈現(xiàn)遺傳多樣性分布特征，常見的基因型為G1 基因型。研究結(jié)果為我國羊的細(xì)粒棘球蚴感染情況調(diào)查和遺傳進(jìn)化特征分析提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。