非洲豬瘟病毒pI215L 蛋白結(jié)構(gòu)與功能的生物信息學(xué)分析

趙金兵，王鐵軍，王莫離，石建州，姚倫廣

（1.南陽(yáng)師范學(xué)院，河南 南陽(yáng) 473061；2.南陽(yáng)農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南 南陽(yáng) 473000）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染引起的豬科動(dòng)物廣泛出血性、高病死率傳染?。?］。ASFV 是一種核質(zhì)大DNA 病毒［2］，病毒粒子的直徑260～300 nm，基因組為線性雙鏈DNA，大小為170～194 kb［3］，含有150～167 個(gè)開放閱讀框［4］。ASFV 基 因 組 編 碼 多 種 蛋 白［5］，包 括54 種 結(jié) 構(gòu) 蛋白以及100 多種非結(jié)構(gòu)蛋白［6］。ASFV 結(jié)構(gòu)復(fù)雜，呈20 面體對(duì)稱形態(tài)，具有多層結(jié)構(gòu)［7-8］，成熟病毒粒子的基因組依次包裹著內(nèi)核芯殼、內(nèi)膜、衣殼和外囊膜［9］。ASFV 基因組編碼的蛋白在病毒生命周期調(diào)控以及免疫逃逸中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［10-12］。

ASFV 基因pI215L 編碼的泛素結(jié)合酶的序列與E2 泛素結(jié)合酶的同源性較高。蛋白pI215L 是一種E2 泛素結(jié)合酶（ubiqutin-conjugating enzyme，UBC），也是目前已知的唯一由病毒基因編碼的UBC。pI215L 蛋白發(fā)揮著泛素-蛋白酶體系的核心功能。pI215L 蛋白調(diào)控病毒的感染和復(fù)制，具生物學(xué)活性，在體外實(shí)現(xiàn)自泛素化和泛素化組蛋白等重要功能［13］。pI215L 蛋白參與調(diào)控宿主細(xì)胞蛋白泛素化的機(jī)制尚不清晰。該研究對(duì)pI215L 進(jìn)行生物信息學(xué)分析，解析蛋白結(jié)構(gòu)和功能，探索其調(diào)控ASFV 復(fù)制和感染宿主的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及分子機(jī)制，也為研發(fā)抗ASFV 藥物和ASFV 新型減毒疫苗提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 pI215L 基因同源性分析

從ASFV 數(shù) 據(jù) 庫(kù) （The African Swine Fever Virus Database，ASFVdb）（http：//asfvdb.popgenetics.net/）下載29 個(gè)不同毒株的pI215L 基因序列，使用DNAMAN 6.0 和DNAStar 7.0 軟件分析核苷酸序列的同源性及遺傳進(jìn)化關(guān)系。

1.2 pI215L 蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)

利用ExPASy 網(wǎng)站ProtParam 在線軟件（http：//web.expasy.org/protparam/）分析pI215L 蛋白的氨基酸組成等理化性質(zhì)。

1.3 pI215L 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利 用SOPMA（http：//npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page =npsa_sop -ma.html）對(duì)pI215L 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行在線分析；運(yùn)用SMART 程序預(yù)測(cè)pI215L 蛋白的功能結(jié)構(gòu)域。利用在線軟件STRING （https：//cn.string-db.org/）分析與pI215L 相互作用的蛋白。

1.4 pI215L 蛋白線性表位預(yù)測(cè)與三維空間位置

使用DNAStar 7.0 軟件的Protean 程序預(yù)測(cè)pI215L 蛋白的B 細(xì)胞抗原表位，分析氨基酸序列，包括親水性、柔韌性、抗原指數(shù)、表面暴露區(qū)。運(yùn)用Kyte-Doolittle 的氨基酸親水標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行疏水性預(yù)測(cè)；根據(jù)Karplus-Sohulz 的柔性蛋白預(yù)測(cè)方案分析柔性區(qū)域位；根據(jù)Emini 原則預(yù)測(cè)表面暴露區(qū)；根據(jù)Jameson-Wolf 抗原指數(shù)方案預(yù)測(cè)B 細(xì)胞抗原表位。利用SWISS-MODEL 同源建模，定位抗原表位的三維空間位置。

2 結(jié)果與分析

2.1 同源性分析

DNAMAN 分析結(jié)果顯示，29 個(gè)不同ASFV 毒株的一致性是93.25%，分離自中國(guó)的5 個(gè)ASFV毒株（China_HLJ_2018、China_ASFV-SY18_2018、China_AnhuiXCGQ_2018、China_wbBS01_2018、China_LN_2018）的pI215L 基因核苷酸序列同源性為100%。DNAStar 分析結(jié)果顯示，不同毒株的pI215L 基因核苷酸序列同源性較高，29 個(gè)毒株的pI215L 基因核苷酸序列同源性分析結(jié)果見圖1，進(jìn)化樹分析結(jié)果見圖2。

圖1 29 種ASFV 毒株pI215L 核苷酸序列同源性比較

2.2 理化性質(zhì)

通過ExPASy 網(wǎng)站PortParam 在線軟件分析pI215L 蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示，pI215L 蛋白共有3360 個(gè)原子組成，其分子式為C1087H1642N264O358S9，相對(duì)分子質(zhì)量為24 425.09；由212 個(gè)氨基酸組成，谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、脯氨酸（Pro）所占比例較高，分別為13.2%、9.4%、8.5%；其中帶正電荷的殘基（Arg+Lys）總數(shù)為19 個(gè)，帶負(fù)電荷的殘基（Asp+Glu）總數(shù)為48 個(gè)；理論等電點(diǎn)（pI）為4.21；在哺乳動(dòng)物體外網(wǎng)織紅細(xì)胞中半衰期為30 h，脂肪系數(shù)為71.79，不穩(wěn)定系數(shù)為58.16，歸類為不穩(wěn)定蛋白；總平均親水性（grand average of hydropathicity，GRAVY）為-0.700。

2.3 pI215L 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、功能結(jié)構(gòu)域分析與蛋白互作關(guān)系預(yù)測(cè)

通過ExPASy 網(wǎng)站的SOPMA 工具對(duì)pI215L蛋白氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要含有α-螺旋（Hh）、延伸鏈（Ee）、β-轉(zhuǎn)角（Tt）、無(wú)規(guī)卷曲（Cc）4 種形式。其中，Hh 有79 個(gè)氨基酸，占37.26%；Ee 有37 個(gè)氨基酸，占17.45%；Tt 有14 個(gè)氨基酸，占6.60%；Cc 有82 個(gè)氨基酸，占38.68%（見圖3），4 種結(jié)構(gòu)貫穿整條氨基酸鏈。

圖3 pI215L 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

SMART 分析pI215L 蛋白功能結(jié)構(gòu)域結(jié)果見圖4，pI215L 蛋白有1 個(gè)泛素化結(jié)合酶E2（ubiquitin-conjugating enzyme E2）結(jié)構(gòu)域，屬于催化結(jié)構(gòu)同系物，位于第4～160 位氨基酸殘基處UBCc 結(jié)構(gòu)域。位于第193～212 位氨基酸有1 個(gè)低復(fù)雜域。

圖4 pI215L 蛋白的結(jié)構(gòu)域分析

pI215L 蛋白互作關(guān)系預(yù)測(cè)見圖5，pI215L 蛋白與UBE2Q1、UBE2H、UBE2U、UBE2J2 和UBE2G2、UBE2F、UBE2V2、CDC34、UBA1 等蛋白存在相互作用關(guān)系。

圖5 pI215L 蛋白互作關(guān)系預(yù)測(cè)

2.4 pI215L 線性表位預(yù)測(cè)結(jié)果與表位的三維空間位置

利用DNAStar 的Protean 預(yù)測(cè)pI215L 的親水性、柔韌性、抗原指數(shù)、表面暴露區(qū)，結(jié)果見圖6。柔性區(qū)段主要有第15～22、25～32、38～52 氨基酸等15 處；親水區(qū)主要位于第7～9、12～33、41～50 氨基酸等7 處；B 細(xì)胞抗原表位可能有第1～2、12～33、35～46 氨基酸等12 處；表面暴露區(qū)主要在第10～11、16～20、26～32 氨基酸等17 處。綜合分析同時(shí)符合4 個(gè)指標(biāo)（親水性、柔韌性、抗原指數(shù)、表面暴露區(qū)）的肽段，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，pI215L 蛋白的抗原表 位 的 肽 段 位 共 16 處 ：16ELKSL20、26EGFRITLV32、41WEVAI45、58FKA60、64FPI66、81MW82、92VKISILH98、102DDPQSG107、120VRTILLS126、133EPNTFS138、140ANVDASVM147、15 2RDSKGKDK159、162AEIIRKQ168、180GV181、183 VPTTLAEYCI196、202YDDEDEEEEDD211（見表1）。

表1 Protean 預(yù)測(cè)的抗原表位

圖6 pI215L 蛋白的抗原表位的肽段位的預(yù)測(cè)

對(duì)pI215L 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，使用SWISS-MODEL 軟件同源建模，與PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中的6NYO.1（ubiquitin-conjugating enzyme E2 R2 和ubiquitin）的同源性達(dá)46.06%，構(gòu)建pI215L 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。使用PyMOL 軟件將預(yù)測(cè)的pI215L蛋白抗原表位在模型中的分布準(zhǔn)確定位，圖7 中綠色部分表示氨基酸個(gè)數(shù)超過5 個(gè)的表位，紅色部分表示氨基酸個(gè)數(shù)小于等于5 個(gè)的表位。

3 討論與結(jié)論

ASF 是我國(guó)當(dāng)前最為嚴(yán)重的外來豬病，被列為一類動(dòng)物傳染病。雖然該病已流行百年，但人們對(duì)ASFV 的蛋白結(jié)構(gòu)與功能、病毒與宿主互作關(guān)系、病原致病與機(jī)體免疫機(jī)制等關(guān)鍵科學(xué)問題認(rèn)識(shí)有限。解析ASFV 抗原蛋白結(jié)構(gòu)與功能，繪制ASFV 與宿主的互作網(wǎng)絡(luò)，為深入研究病毒感染和免疫逃逸機(jī)制提供科學(xué)理論基礎(chǔ)［14］。泛素化是通過酶促反應(yīng)進(jìn)行的，泛素與泛素結(jié)合酶E2 的活性位點(diǎn)的半胱氨酸殘基結(jié)合形成硫酯鍵，泛素連接酶完成泛素由E2-UB 轉(zhuǎn)移至特定底物蛋白的生物過程，是一種可逆的蛋白翻譯后修飾，具有調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、抗病毒應(yīng)答等功能。蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白通過泛素-蛋白酶體途徑降解，這一途徑在調(diào)節(jié)細(xì)胞生存所需的多個(gè)基本生物過程中發(fā)揮作用。病毒借助泛素化修飾完成免疫逃逸，利用病毒自身編碼的泛素連接酶E3 或去泛素化酶實(shí)現(xiàn)免疫逃逸，增強(qiáng)病毒的感染力。pI215L 與泛素結(jié)合蛋白同源，病毒感染宿主，與細(xì)胞40S 核糖體蛋白R(shí)PS23 相互作用，pI215L 結(jié)合翻譯起始因子4E（eukaryotic initiation factor 4E，eIF4E），進(jìn)而影響哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋 白 （mammalian target protein of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路，參與病毒DNA 復(fù)制與轉(zhuǎn)錄［15-16］。pI215L 調(diào)節(jié)宿主的翻譯機(jī)制，調(diào)控宿主細(xì)胞蛋白的表達(dá)和亞細(xì)胞定位，但發(fā)揮作用的功能機(jī)制有待于深入研究和探索［17-18］。

生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，29 個(gè)不同毒株的同源性分析證實(shí)pI215L 的核苷酸序列大概分為歐洲分支和非洲分支，分離自中國(guó)的毒株與歐洲分支的親緣關(guān)系較近。pI215L 蛋白是由212 個(gè)氨基酸組成，分子量24.4 kDa，等電點(diǎn)4.21，性質(zhì)不穩(wěn)定，親水蛋白。二級(jí)結(jié)構(gòu)影響線性B 細(xì)胞表位，蛋白親水性氨基酸含量越高，肽段越柔韌，越容易抗原抗體嵌合［19］。pI215L 蛋白有1 個(gè)E2 泛素化結(jié)合酶功能結(jié)構(gòu)域，屬于催化結(jié)構(gòu)同系物，這與蛋白互作關(guān)系預(yù)測(cè)結(jié)果一致，推測(cè)pI215L 蛋白與UBE2Q1、UBE2H、UBE2U、UBE2V2、CDC34、UBA1等存在相互作用關(guān)系，這些蛋白具有類同的功能。線性表位預(yù)測(cè)有16 處的肽段是潛在的表位。采用SWISS-MODEL 軟件同源建模，與PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中的6NYO.1 的同源性達(dá)46.06%，利用PyMOL 定位了表位肽段在蛋白三維空間的相對(duì)位置。該研究為ASFV 蛋白后續(xù)結(jié)構(gòu)解析、功能深入研究、疫苗和藥物研制等提供了重要的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

pI215L 啟動(dòng)干擾泛素機(jī)制，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和衣殼化等過程，催化位點(diǎn)Cys85 是ASFV 發(fā)揮泛素結(jié)合功能和抑制宿主蛋白合成功能的酶的活性位點(diǎn)［15］。UBCv1 蛋白環(huán)境耐受性較強(qiáng)，pH 值為4～9，4～42 ℃保持催化能力［20］。在酸性依賴去甲基化或EIPA 抑制前，動(dòng)態(tài)蛋白和網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)入后，UBCv1 的表達(dá)隨即開始。UBCv1 在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的彌散分布可能與病毒蛋白和宿主蛋白的泛素化作用有關(guān)，感染早期主要分布在細(xì)胞核；晚期，在細(xì)胞質(zhì)中也能夠檢測(cè)到，動(dòng)態(tài)穿梭于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)［18］。鑒定感染細(xì)胞可溶性成分存在單泛素化、雙泛素化以及多泛素化，產(chǎn)生不同的底物泛素化結(jié)構(gòu)對(duì)不同靶標(biāo)的宿主或病毒蛋白至關(guān)重要，表明pI215L 可能參與了多種調(diào)控途徑。pI215L 是一種非常早期的病毒蛋白，不依賴病毒DNA 復(fù)制，與早期表達(dá)蛋白CP204L 表達(dá)譜相似，在感染晚期逐漸積累。病毒感染早期開始轉(zhuǎn)錄，2 h和16 h 出現(xiàn)兩個(gè)轉(zhuǎn)錄高峰，表明pI215L 可能參與病毒轉(zhuǎn)錄、基因組復(fù)制等不同階段的病毒生命周期，在感染宿主過程中發(fā)揮著重要作用［15］。感染4～20 h 后，pI215L 被招募到“病毒工廠”。pI215L參與病毒的晚期轉(zhuǎn)錄，pI215L 下調(diào)導(dǎo)致B646L 轉(zhuǎn)錄本減少，ASFV 基因組復(fù)制、病毒晚期轉(zhuǎn)錄和子代產(chǎn)生是通過泛素途徑介導(dǎo)的，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在ASFV 感染宿主中發(fā)揮著作用［20］。

機(jī)體先天免疫是宿主抵抗病毒感染的第一道防線，干擾素（IFN）是先天免疫應(yīng)答的重要組成成分，ASFV 如何逃逸宿主的先天免疫系統(tǒng)的防御，干擾素與病毒感染關(guān)系不明晰。新的研究通過siRNA 降低蛋白pI215L 的表達(dá)，ASFV 復(fù)制抑制顯著，但增強(qiáng)了病毒誘導(dǎo)IFN-β 和ISG56 的生成；通過免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜檢測(cè)到和pI215L 互作的E3 泛素連接酶RNF138，pI215L 招募RNF138；促 進(jìn)RNF138 降 解RNF128，抑 制RNF128 對(duì)TBK1 的K63 位泛素化修飾，最終抑制了IFN-β的生成；研究發(fā)現(xiàn)pI215L 能夠抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，并且顯著影響干擾素產(chǎn)生的抑制作用，進(jìn)而闡明了pI215L 抑制Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的分子機(jī)制，揭示了ASFV 免疫逃逸的新機(jī)制［21］。拮抗干擾素產(chǎn)生的基因與病毒致病力密切相關(guān)，如果缺失病毒拮抗IFN 產(chǎn)生的基因?qū)闇p毒疫苗的研發(fā)提供新思路，是研制ASFV 疫苗的有效策略之一。

綜上所述，該研究利用生物信息學(xué)分析了ASFV 的基因編碼的pI215L 蛋白的進(jìn)化和同源性、理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)與功能以及抗原的表位等，可為pI215L 的生物學(xué)功能以及病毒相關(guān)致病性機(jī)制的進(jìn)一步研究提供必要的數(shù)據(jù)參考。