不同來(lái)源接種物對(duì)不同原料產(chǎn)氫烷潛力的影響及微生物群落結(jié)構(gòu)分析

李 凱, 趙紊驍赟, 劉思雨, 張欣蕾, 李祿恩, 梅寶帆, 井琳琳, 孫雅雅, 袁海榮

(北京化工大學(xué) 化工資源有效利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 環(huán)境科學(xué)與工程系, 北京 100029)

厭氧消化是一種很好的處理有機(jī)廢物并產(chǎn)生氫烷的能源化轉(zhuǎn)化技術(shù)。厭氧消化系統(tǒng)的啟動(dòng)都離不開(kāi)良好的接種物,接種物的優(yōu)劣是影響厭氧消化啟動(dòng)成敗的關(guān)鍵。影響厭氧消化的因素有很多[1],研究者的關(guān)注點(diǎn)主要集中在溫度[2]、pH值[3]、有機(jī)負(fù)荷[4]等因素對(duì)厭氧消化性能的影響上,對(duì)單純接種物的研究相對(duì)較少。

接種物是影響厭氧消化的主要參數(shù)之一。Hossain[4]等研究了溫度、接種物類型和接種比對(duì)干式厭氧消化沼氣產(chǎn)量的影響,發(fā)現(xiàn)厭氧污泥和牛糞混合比為1∶2的混合物作為接種物時(shí),城市有機(jī)固體廢物的甲烷產(chǎn)量最高,但沒(méi)有對(duì)接種物中的微生物進(jìn)行分析。Li[5]等對(duì)比了北郎中養(yǎng)豬廠的中溫厭氧消化沼液、北京城市污水處理廠的廢活性污泥和順義釀酒廠的活性顆粒污泥3種接種物對(duì)牛糞、玉米秸稈和蕃茄秧共消化的影響,發(fā)現(xiàn)豬糞沼液作為接種物時(shí)混合物的產(chǎn)甲烷量最高,活性顆粒污泥作為接種物時(shí)混合物的揮發(fā)性脂肪酸濃度較高,并對(duì)3種接種物進(jìn)行了簡(jiǎn)單的微生物群落結(jié)構(gòu)分析,但未對(duì)比3種不同接種物之間的差異性。Aarle[6]等研究了厭氧污泥、顆粒污泥和產(chǎn)酸發(fā)酵液3種接種物分別對(duì)3種復(fù)雜的木質(zhì)纖維素原料酸化產(chǎn)揮發(fā)性脂肪酸的影響。劉偉[7]等對(duì)比了5種接種物對(duì)牛糞高溫厭氧消化產(chǎn)氣性能的影響,發(fā)現(xiàn)接種物為沼液底物和二沉污泥的混合物時(shí)牛糞厭氧產(chǎn)氣效果最好。

綜上所述,研究者們以不同原料為基質(zhì),采用了多種不同接種物進(jìn)行厭氧消化實(shí)驗(yàn),主要研究了不同接種物對(duì)不同基質(zhì)的產(chǎn)氣性能方面的影響,很少有人關(guān)注不同接種物之間微生物群落結(jié)構(gòu)變化和不同接種物之間微生物的差異性。由于在厭氧消化過(guò)程中,真正對(duì)厭氧消化起作用的是接種物里面的微生物,因此,探明不同接種物的群落結(jié)構(gòu)特性及其差異性,關(guān)系到能否正常啟動(dòng)厭氧消化系統(tǒng),是厭氧消化系統(tǒng)啟動(dòng)成敗的關(guān)鍵所在。所以,研究不同接種物對(duì)不同原料的產(chǎn)氣潛力及其微生物群落結(jié)構(gòu)及差異性非常有必要。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原料

為了評(píng)價(jià)不同來(lái)源的接種物是否適合作為厭氧消化的接種物,3種發(fā)酵原料被采用,分別為玉米秸稈、青稞稈和廚余垃圾,分別取自北京市延慶區(qū)、西藏拉薩市和北京化工大學(xué)學(xué)生食堂。秸稈經(jīng)風(fēng)干粉碎至20目后備用,廚余垃圾除雜后用垃圾粉碎機(jī)粉碎后備用。實(shí)驗(yàn)選取3種接種物,分別為牛糞、秸稈厭氧消化液和餐廚干發(fā)酵出料,為表述方便,分別命名為NF、ZY、CN,3種接種物分別取自北京大興區(qū)金銀島牧場(chǎng)、三河市盈盈生物有限公司和北京化工大學(xué)固廢實(shí)驗(yàn)室。原料和接種物的基本性質(zhì)如表1所示。

表1 原料及接種物基本性質(zhì)*

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

產(chǎn)氫烷潛力實(shí)驗(yàn)采用批式厭氧消化方式。實(shí)驗(yàn)裝置由500 mL藍(lán)蓋瓶(有效體積為400 mL)、集氣瓶、乳膠管、三通等組成(見(jiàn)圖1)。將ZY、NF和CN分別作為消化青稞稈、玉米秸稈和廚余垃圾的接種物,并考察其產(chǎn)氫和產(chǎn)甲烷潛力。將3種實(shí)驗(yàn)原料分別與不同接種物按干物質(zhì)比1∶2混合放入藍(lán)蓋瓶,加入去離子水至有效體積,充分?jǐn)嚢杈鶆蚝蠓馍w,然后置于恒溫水浴箱中,保持反應(yīng)器內(nèi)溫度為35 ℃±1 ℃,每天定時(shí)手動(dòng)搖動(dòng)發(fā)酵瓶?jī)纱?采用排水集氣法收集所產(chǎn)生的氣體,每天記錄氣體產(chǎn)量并用氣相色譜儀測(cè)定氣體中氫氣、甲烷和二氧化碳等氣體成分,計(jì)算氫氣出和甲烷的產(chǎn)量。每個(gè)反應(yīng)瓶加入20 gTS原料,為了考察不同接種物是否能快速且正常啟動(dòng)厭氧消化反應(yīng)系統(tǒng)并順利進(jìn)入甲烷化階段,厭氧消化時(shí)間設(shè)定為10天。同時(shí)設(shè)置純ZY、NF和CN接種物作為空白對(duì)照,實(shí)驗(yàn)結(jié)果均扣除接種物空白產(chǎn)氣量,每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行樣,實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3平行樣的平均值。

圖1 實(shí)驗(yàn)裝置示意圖

1.3 分析方法

樣品的總固體含量(TS)和揮發(fā)性固體含量(VS)采用國(guó)標(biāo)法進(jìn)行測(cè)定。堿度采用溴甲酚綠-甲基紅指示劑滴定;氨氮含量采用HI83206高精度試驗(yàn)室多參數(shù)測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定;pH值、總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)和氣體含量分別采用pH 計(jì)、氣相色譜儀(島津GC—2014)和氣相色譜儀(SP—2100)進(jìn)行測(cè)定。選取NF、ZY和CN這3種接種物樣品送至上海美吉生物公司進(jìn)行微生物測(cè)定,細(xì)菌和古菌PCR的引物分別為338F (5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)、806R (5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)和524F10ext(5’-TGYCAGCCGCCGCGGTAA-3’)、Arch958Rmod (5’-YCCGGCGTTGAVTCCAATT-3’)?；?6S rDNA高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)樣品中的微生物群落進(jìn)行分析。并根據(jù)Illumina MiSeq 平臺(tái)上的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行測(cè)序,相關(guān)微生物圖通過(guò)上海美吉生物云平臺(tái)進(jìn)行在線作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)氫烷潛力分析

產(chǎn)氫烷速率和產(chǎn)氫烷潛力是評(píng)價(jià)接種物優(yōu)劣的兩個(gè)重要指標(biāo),不同接種物中加入青稞稈、玉米秸稈和廚余垃圾后其產(chǎn)氫烷速率和產(chǎn)氫烷潛力如圖2～圖4所示。由圖2可以看出:在厭氧發(fā)酵的第1天,廚余-CN組產(chǎn)甲烷速率最高,達(dá)到42.4 mL·g-1VS·d-1,然后產(chǎn)甲烷速率迅速下降,從第4天開(kāi)始產(chǎn)氣幾乎為0。青稞稈-ZY和玉米秸稈-NF組產(chǎn)甲烷速率逐漸緩慢上升,到第10天時(shí),日甲烷產(chǎn)量分別達(dá)到11.4和14.4 mL·g-1VS·d-1。廚余-ZY組在10天的發(fā)酵周期內(nèi)幾乎未產(chǎn)甲烷。在厭氧發(fā)酵的前2天,玉米秸稈-NF和廚余-ZY組表現(xiàn)出良好的產(chǎn)氫氣優(yōu)勢(shì),最大日產(chǎn)氫氣速率分別為26.5和15.8 mL·g-1VS·d-1,最大氫氣含量分別為39.5%和21.0%(見(jiàn)圖3)。從氣體含量來(lái)看(見(jiàn)圖3),不同實(shí)驗(yàn)組中(廚余-ZY組除外)甲烷含量均呈快速上升趨勢(shì),從第3～4天開(kāi)始,甲烷含量均已超過(guò)30%,到第10天時(shí),不同實(shí)驗(yàn)組的甲烷含量為56.7%～70.9%,玉米秸-NF組從第4天開(kāi)始甲烷含量達(dá)到61.4%～71.6%。由圖4可知,玉米秸稈-NF組在10天的厭氧消化周期內(nèi)累積甲烷產(chǎn)量最高,為80.9 mL·g-1VS,分別高出青稞稈-ZY、青稞稈-CN和廚余-CN組54.5%、255.4%和18.1%,這說(shuō)明NF接種物更適合消化秸稈。同時(shí)玉米秸稈-NF組和廚余-ZY組的累積氫氣產(chǎn)量分別為33.9和27.1 mL·g-1VS。因此,玉米秸稈-NF組在產(chǎn)甲烷和產(chǎn)氫氣方面均為最優(yōu),其次是廚余-CN組。這說(shuō)明接種物消化同源原料更容易,也就是NF接種物更適合消化秸稈,而CN接種物更適合消化廚余垃圾,這個(gè)現(xiàn)象與之前用不同來(lái)源沼液作為預(yù)處理劑后厭氧產(chǎn)甲烷的結(jié)果相似[3]。

圖2 不同接種物條件下日產(chǎn)氣甲烷和氫氣速率

圖3 不同接種物條件下甲烷和氫氣含量的變化

圖4 不同接種物條件下累積甲烷產(chǎn)量和氫氣產(chǎn)量

2.2 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 細(xì)菌和古菌群落結(jié)構(gòu)

細(xì)菌在門水平和屬水平上的相對(duì)豐度如圖5～圖7。不同接種物中的細(xì)菌在12個(gè)門和57個(gè)屬上相對(duì)豐度較高。其中厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidota)在3種接種物中相對(duì)豐度占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),分別為35.3%～53.2%和11.6%～36.5%(見(jiàn)圖5)。Firmicutes和Bacteroidota是厭氧發(fā)酵中最常見(jiàn)的兩個(gè)門,其中Firmicutes的主要作用是產(chǎn)生纖維素酶、蛋白酶和各種胞外酶來(lái)降解各種復(fù)雜有機(jī)物,其中部分Firmicutes具有降解纖維素的能力;Bacteroidetes的主要作用是將大分子有機(jī)物降解成小分子的酸類物質(zhì)[8]。在NF接種物中,Firmicutes和Bacteroidota的相豐度均為最高,這說(shuō)明NF接種物的水解酸化能力最強(qiáng),可以很快將原料降解成小分子物質(zhì),這與玉米秸稈-NF組產(chǎn)甲烷和產(chǎn)氫氣的能力均為最強(qiáng)相對(duì)應(yīng)。在屬水平上(見(jiàn)圖7),CN接種物中優(yōu)勢(shì)菌種為未分類的多伊卡菌門g_norank_f_norank_o_norank_c_Dojkabacteria(19.20%),屬于Bacteroidota門類,該類細(xì)菌主要與碳水化合物降解有關(guān),能夠適應(yīng)極端環(huán)境[9]。這就是pH值為4.2的廚余垃圾(見(jiàn)表 1)在CN接種物條件下也能很好地厭氧消化產(chǎn)甲烷而廚余-ZY組則產(chǎn)氣不佳的主要原因,因?yàn)閆Y接種物中缺少大量適應(yīng)極端環(huán)境的細(xì)菌。在ZY接種物中,相對(duì)豐度最高的是Candidatus_Caldatribacterium(10.2%)。NF接種物中,優(yōu)勢(shì)菌種為紫單胞菌(Proteiniphilum)、熱桿菌(Turicibacter)、發(fā)酵單胞菌(Fermentimonas)和賴氨酸芽胞桿菌(Lysinibacillus),相對(duì)豐度分別為16.2% 、12.6%、10.4%和9.0%。Fermentimonas和Proteiniphilum能夠利用不同類型的碳水化合物和纖維素產(chǎn)生氫氣、VFA和CO2以及利用含N類物質(zhì)作為能源產(chǎn)生乙酸[10],Turicibacter主要參與糖類發(fā)酵物質(zhì)的代謝,其代謝產(chǎn)物主要為乳酸[11]。因此,NF接種物以玉米秸為原料時(shí),能夠既產(chǎn)生甲烷,也能夠產(chǎn)生氫氣?？傮w來(lái)說(shuō),上述細(xì)菌大都屬于Firmicutes、Bacteroidota和Proteobacteria菌門,對(duì)促進(jìn)厭氧消化底物的水解起重要作用。

圖5 細(xì)菌在門水平上的相對(duì)豐度

圖6 古菌在門水平上的相對(duì)豐度

圖7 細(xì)菌在屬水平上的相對(duì)豐度

在甲烷化階段,不同的古菌對(duì)產(chǎn)甲烷起到重要的作用,在門水平和屬水平的相對(duì)豐度如圖6、圖8。廣古菌門(Euryarchaeota)和鹵桿菌門(Halobacterota)在門水平上的相對(duì)豐度占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì),兩者的相對(duì)豐度之和占門水平總相對(duì)豐度的96.95%～99.95%(見(jiàn)圖6)。其中ZY接種物中Euryarchaeota和Halobacterota的相對(duì)豐度分別為52.9%和44.0%。NF和CN接種物中相對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門為Halobacterota(80.9%)和Euryarchaeota(98.6%)。在屬水平上,3種接種物之間有明顯區(qū)別(圖8)。Methanosphaera是CN接種物中的優(yōu)勢(shì)菌種,相對(duì)豐度占98.2%。在NF接種物中,優(yōu)勢(shì)菌種為Methanocorpusculum和Methanobrevibacter,其相對(duì)豐度分別為80.5%和18.6%。ZY接種物中的甲烷菌多樣性比NF和CN接種物中的優(yōu)勢(shì)甲烷菌種類豐富得多,相對(duì)豐度大于1%的甲烷菌有8種,其中優(yōu)勢(shì)菌種為甲烷鬃毛菌(Methanosaeta)、甲烷桿菌(Methanobacterium)和甲烷短桿菌(Methanobrevibacter),其相對(duì)豐度分別為41.7%、31.2%和16.4%。Methanosaeta的主要作用是能夠利用不同種類的底物,它可以將甲基胺或甲醇轉(zhuǎn)化為甲烷和二氧化碳,或者將氫氣、二氧化碳和乙酸轉(zhuǎn)化成甲烷[12]。Methanosphaera、Methanocorpusculum和Methanobrevibacter屬于氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌,氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌利用氫氣、甲酸鹽等電子供體還原二氧化碳產(chǎn)生甲烷[8]。由于廚余垃圾易酸化,在CN接種物中其水解酸化過(guò)程產(chǎn)生的氫氣很容易被氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌Methanosphaera所利用,因此,CN接種物中加入廚余垃圾更適合產(chǎn)甲烷。而在廚余-ZY組,由于ZY接種物中缺少M(fèi)ethanosphaera(1.9%),而能利用氫氣產(chǎn)甲烷的Methanobrevibacter豐度僅為16.4%,遠(yuǎn)低于在CN接種物中98.2%豐度的Methanosphaera,故廚余-ZY組的產(chǎn)氫量高,而產(chǎn)甲烷量最低。由于NF接種物中含有極其豐富的氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌和產(chǎn)氫產(chǎn)酸細(xì)菌,因此,NF接種物組產(chǎn)氫和產(chǎn)甲烷效果均最佳。

圖8 古菌在屬水平上的相對(duì)豐度

2.2.2 微生物差異性分析

為了進(jìn)一步分析不同接種物之間微生物的不同,對(duì)不同接種物進(jìn)行了屬水平上的組間差異性分析(見(jiàn)圖9、圖10)。由圖可知,不同接種物之間在細(xì)菌和古菌上的差異性非常明顯。NF接種物與CN和ZY接種物相比,NF接種物中的Proteiniphilum、Turicibacter、Fermentimonas和Lysinibacillus的相對(duì)豐度與接種物CN和ZY中相應(yīng)地細(xì)菌在相對(duì)豐度上存在顯著性差異((9.0%～15.3%)***,p≤0.001)和((8.8%～15.6%)***,p≤0.001),Dojkabacteria和norank_f__W27在NF和CN接種物中也存在明顯差異(-11.0%～-19.2%)***,p≤0.001 )(見(jiàn)圖9)。在古菌屬水平上,NF接種物中的古菌Methanosphera、Methanocorpusculum和Methanobrevibacter的相對(duì)豐度與CN接種物中相應(yīng)古菌的相對(duì)豐度存在顯著性差異(-97.8%***, 18.5%～80.5%***,p≤0.001),NF與ZY接種物中的Methanocorpusculum、Methanosaeta和Methanobacterium的相對(duì)豐度也存在顯著性差異(80.5%***,-41.7%***和-31.1%***,p≤0.001)(見(jiàn)圖10)。這說(shuō)明不同接種物之間在屬水上的細(xì)菌和古菌均存在較大顯著性差異。這可以很好地解釋出不同接種物在產(chǎn)氫烷方面的能力是不同的。

圖9 細(xì)菌在屬水平上的差異

圖10 古菌在屬水平上的差異

2.2.3 微生物群落與接種物特性的相關(guān)性分析

接種物中的pH值、氮氨、堿度和TVFA等基本特性會(huì)直接影響接種物中微生物群落結(jié)構(gòu),最終影響接種物環(huán)境下的原料產(chǎn)氫氣和產(chǎn)甲烷的能力。因此,明確接種物基本特性與接種物中微生物群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性,有助于分析原料的產(chǎn)氣潛力。不同接種物特性與微生物群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性如圖11～圖14所示。由圖11可知:接種物中的pH值和TVFA分別與Fastidiosipila、norank_f__norank_o__norank_c__Dojkabacteria、norank_f__W27和Sedimentibacter、Romboutsia、Paeniclostridium呈現(xiàn)出顯著的正相關(guān)性(R=1.0***),與Turicibacter、Lysinibacillus和Gallicola、Pseudomonas、Rikenellaceae_RC9_gut_group表現(xiàn)出顯著的負(fù)相關(guān)性(R=-1.0***)。堿度和氨氮分別與Turicibacter、Lysinibacillus和Proteiniphilum、Fermentimonas、Acholeplasma表現(xiàn)出顯著性正相關(guān)性,而與norank_f__norank_o__norank_c__Dojkabacteria、norank_f__W27、Fastidiosipila和Candidatus_Caldatribacterium、norank_f__norank_o__MBA03、Christensenellaceae_R-7_group、_Caldicoprobacter、 norank_f__norank_o__norank_c__JS1表現(xiàn)出強(qiáng)烈地負(fù)相關(guān)。產(chǎn)氫潛力與接種物中堿度和微生物的相關(guān)性相似,而產(chǎn)甲烷潛力與接種物中氨氮與微生物的相關(guān)性一致。同時(shí)分析圖12可知,接種物中的堿度和產(chǎn)氫能力與Methanobrevibacter正相關(guān)(R=1***),pH值與Methanobrevibacter顯示出極強(qiáng)的負(fù)相關(guān)性(R=-1***)。Methanosphaera與pH值呈現(xiàn)出正相關(guān)性,與堿度和氫氣產(chǎn)量呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)性。Methanocorpusculum與氨氮和甲烷產(chǎn)量呈現(xiàn)出極強(qiáng)的正相關(guān)性(R=1***)。這表明norank_f__norank_o__norank_c__Dojkabacteria、norank_f__W27、Fastidiosipila的豐度與產(chǎn)氫能力呈現(xiàn)正相關(guān),Methanocorpusculum的相對(duì)豐度與產(chǎn)甲烷能力呈現(xiàn)正相關(guān)。綜合圖11、12可說(shuō)明,接種物中的細(xì)菌和古菌微生物與原料的產(chǎn)氫和產(chǎn)甲烷潛力有關(guān)系。由細(xì)菌和古菌在屬水平上的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖13、14可以進(jìn)一步直觀地看出微生物與接種物的基本特性之間的關(guān)系。厭氧消化系統(tǒng)中TVFA影響厭氧消化過(guò)程中Gallicola等19種細(xì)菌和Methanothermobacter等2種古菌的豐度,產(chǎn)氫潛力與Turicibacter等10種細(xì)菌和Methanosphaera等2種古菌豐度的有關(guān)。產(chǎn)甲烷潛力受Proteiniphilum等17種細(xì)菌和Methanocorpusculu等9種古菌的影響。這說(shuō)明接種物中有多種的細(xì)菌和古菌共同分工協(xié)作,對(duì)加入到接種物系統(tǒng)中的原料的產(chǎn)氫和產(chǎn)甲烷潛力共同起作用。

圖11 細(xì)菌與接種物特性相關(guān)性熱圖

圖12 古菌與接種物特性相關(guān)性熱圖

圖14 古菌網(wǎng)絡(luò)

3 結(jié)論

不同接種物中加入不同原料后其產(chǎn)氫烷速率和產(chǎn)氫烷潛力有明顯不同,接種物消化同源原料效果更好。廚余-CN和玉米秸稈-NF組的最高產(chǎn)甲烷和產(chǎn)氫速率分別為42.4和26.5 mL·g-1VS·d-1。玉米秸稈-NF組的累積甲烷產(chǎn)量最高,為80.9 mL·g-1VS,分別比青稞稈-ZY、青稞稈-CN和廚余-CN組高出54.5%、255.4%和18.1%。玉米秸稈-NF組在產(chǎn)甲烷和產(chǎn)氫氣方面均為最優(yōu),其次是廚余-CN組。

細(xì)菌Firmicutes和Bacteroidota在門水平上的相對(duì)豐度分別為35.3%～53.2%和11.6%～36.5%。NF接種物屬水平上的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種為Proteiniphilum、Turicibacter、Fermentimonas和Lysinibacillus,相對(duì)豐度分別為16.2% 、12.6%、10.4%和9.0%。Euryarchaeota和Halobacterota在門水平上的相對(duì)豐度占總相對(duì)豐度的96.95%～99.95%。Methanosphaera和Methanocorpusculum、Methanobrevibacter分是CN和NF接種物中的優(yōu)勢(shì)菌種,相對(duì)豐度分別為98.2%和80.5%、18.6%。

不同接種物在屬水上的細(xì)菌和古菌之間均存在較大顯著性差異。產(chǎn)氫潛力受Turicibacter等10種細(xì)菌和Methanosphaera等2種古菌豐度的影響。產(chǎn)甲烷潛力與Proteiniphilum等17種細(xì)菌和Methanocorpusculu等9種古菌的相關(guān)。