超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定西瓜和土壤中苯醚甲環(huán)唑和氟唑菌酰胺的農(nóng)藥殘留

李燕，萬宇

（1.桐城師范高等?？茖W(xué)校，安徽 桐城 231400；2.安徽省化工研究院，安徽 合肥 230041）

苯醚甲環(huán)唑（Difenoconazole）是三唑類農(nóng)藥殺菌劑，廣泛應(yīng)用于果樹、蔬菜等作物，能有效防治黑星病、黑痘病、白腐病、斑點(diǎn)落葉病、白粉病、褐斑病等。氟唑菌酰胺（Fluxapyroxad）是由BASF 公司開發(fā)的新型農(nóng)藥活性成分(有效成分)，用來防治廣譜真菌病害，該農(nóng)藥屬于羧酰胺類化學(xué)品，其作用方式是對線粒體呼吸鏈的復(fù)合物II中的琥珀酸脫氫酶起抑制作用，從而抑制靶標(biāo)真菌的種孢子萌發(fā)，芽管和菌絲體生長。近年來由苯醚甲環(huán)唑和氟唑菌酰胺組成的復(fù)配制劑因其效果好而受到關(guān)注，市場上類似三唑類和琥珀酸脫氫本酶類制劑也大量上市，但該類制劑的使用也帶來食品和環(huán)境安全的風(fēng)險。本文以苯醚甲環(huán)唑和氟唑菌酰胺在西瓜中使用為例，研究了該制劑在規(guī)范田間試驗(yàn)（GAP）中西瓜和土壤中的農(nóng)藥殘留情況，為食品和環(huán)境安全提供了分析方法和數(shù)據(jù)支持。

1 樣品、材料及前處理方法

1.1 田間試驗(yàn)設(shè)計及樣品采收

1.1.1 田間試驗(yàn)方案的設(shè)計

為確保環(huán)境中樣本能夠按照標(biāo)準(zhǔn)方法采集，本試驗(yàn)按照國家農(nóng)業(yè)部《NY/T 788—2004 農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》和《農(nóng)藥登記殘留田間試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》方案開展試驗(yàn)。

1.1.2 土壤消解動態(tài)試驗(yàn)

施藥時期及施藥方法：與植株殘留消解試驗(yàn)同時進(jìn)行，兌水噴霧土表。施藥劑量：625 g a.i/ha。施藥次數(shù)：1次。

在試驗(yàn)地塊附近，選取15 m2的空白地塊做土壤消解動態(tài)試驗(yàn)，要求地表平整，土壤濕度適宜，施藥后2 h、1 d、3 d、7 d、10 d、14 d、21 d、30 d、45 d、60 d 分別進(jìn)行土壤取樣，在每個小區(qū)隨機(jī)取6 個點(diǎn)，用土鉆取0～10 cm 深的土壤共約2 kg，去除雜物后均勻混合，帶回實(shí)驗(yàn)室處理。

1.1.3 西瓜殘留消解動態(tài)試驗(yàn)

施藥時期：在西瓜果實(shí)生長至成熟個體一半大小時施藥。施藥劑量：250 g a.i/ha。施藥次數(shù)：1次。小區(qū)面積30 m2，重復(fù)3 次。施藥方法：噴霧西瓜全株，分別于施藥后2 h、1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d、21 d、30 d隨機(jī)采摘3~4個生長正常的西瓜，帶回實(shí)驗(yàn)室處理[1]。

1.1.4 最終殘留試驗(yàn)

施藥劑量：低劑量：125 g a.i/ha；高劑量：187.5 g a.i/ha；施藥時期及施藥方法：根據(jù)西瓜成熟期和采收間隔期推算，噴霧法；施藥次數(shù)：2 次、3 次，間隔10 天施藥1次。

每小區(qū)15 m2，重復(fù)3 次。采用多次施藥、一次采摘的方法。兩個施藥劑量分別在西瓜生長期第1 次施藥，以后每隔7 天噴施1 次，噴藥次數(shù)為2 次、3 次。在末次施藥后7 d、10 d、14 d 取西瓜和土壤樣品。西瓜取樣：采用隨機(jī)的方法在試驗(yàn)小區(qū)取生長正常的西瓜4 個。土壤取樣：用采樣器在試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)隨機(jī)選6~10 個點(diǎn)，采集0～15 cm 深的土壤，樣品去除雜物后均勻混合，每小區(qū)取2 kg。

1.1.5 樣品制備及儲運(yùn)

西瓜殘留消解動態(tài)測定樣品為全瓜，最終殘留量測定樣品為全瓜和瓜肉。西瓜樣品：每小區(qū)西瓜樣本于實(shí)驗(yàn)室中清除表面泥土，沿豎直方向均勻切成4~8瓣，取不相鄰的瓜瓣分為兩組。第一組作為全瓜樣品：瓜瓣勻漿后，混勻，分別取150 g 樣品兩份，分別裝入塑料袋密封，貼上標(biāo)簽后，于冰柜內(nèi)-20℃條件下保存?zhèn)溆?；第二組作為瓜肉樣品：瓜瓣用刀沿肉皮交界處分成瓜皮和瓜肉兩部分，分別稱取瓜皮和瓜肉的質(zhì)量并記錄。將瓜肉勻漿后，混勻，分取150 g 樣品兩份，分別裝入塑料袋密封，貼上標(biāo)簽后，于冰柜內(nèi)-20℃條件下保存?zhèn)溆肹1]。

土壤樣品：每小區(qū)土壤樣品混勻后，隨機(jī)分取100 g樣品兩份，分別裝入塑料袋密封，貼上標(biāo)簽后，于冰柜內(nèi)-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品、試驗(yàn)試劑及儀器

（1）標(biāo)準(zhǔn)品為苯醚甲環(huán)唑和氟唑菌酰胺及其代謝物（巴斯夫公司）。

（2）試驗(yàn)試劑

乙腈：色譜純，美國熱電；乙酸(HAc)、乙二胺-n-丙基硅烷化硅膠（PSA）、硫酸鎂(MgSO4)、醋酸鈉(NaAc)、氯化鈉（NaCl）、檸檬酸鈉（TSCD）、檸檬酸氫二鈉（DHS），均為分析純，天津博納艾杰爾公司。

（3）實(shí)驗(yàn)儀器

MS105DU 電子天平，梅特勒托利多；精密移液槍，北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器公司；TDL-40B低速大容量離心機(jī)，上海安亭儀器公司；HC-1014高速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器公司；KD-50 超聲波振蕩器，江蘇昆山超聲儀器有限公司；G560E 渦旋混合器，美國科學(xué)儀器公司；SERO SJ-M70A 高速勻漿機(jī)，東莞瑟諾電器有限公司。

實(shí)驗(yàn)室純水/超純水一體化系統(tǒng)：Millipore 密理博Direct-Q3，默克密理博實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司。超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)：超高效液相色譜WATERS ACQUITY I CLASS UPLC，三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜WA?TERS XEVO TQ-S MICRO，美國沃特世科技有限公司。

1.3 樣品前處理

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)母液的配制

精確稱取固體農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品各10.00 mg（準(zhǔn)確至0.000 1 mg），分別置于10 mL 容量瓶中，使用乙腈溶解并定容，配制為標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，濃度均為1 000 mg/L，于冰柜內(nèi)-18℃條件下保存6個月。

1.3.2 溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確移取苯醚甲環(huán)唑、氟唑菌酰胺、F008和F048農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.10 mL 于同一類10 mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，濃度為10.00 mg/L，于冰柜內(nèi)-18℃條件下保存3個月。

1.3.3 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別使用西瓜和土壤的CK提取基質(zhì)對上述標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行稀釋，分別稀釋到1.0 mg/L、0.5 mg/L、0.1 mg/L、0.05 mg/L、0.025 mg/L、0.01 mg/L、0.005 mg/L 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，-18℃條件下保存5天時間。

1.3.4 西瓜樣品的苯醚甲環(huán)唑和氟唑菌酰胺前處理方法

分別選?、?.0 g MgSO4(無水)、1.5 g NaAc；②4.0 g MgSO4(無水)、1.0 g NaCl、1.0 g TSCD、0.5 g DHS；③4.0 g MgSO4(無水)、1.0 g NaCl；④6.0 g MgSO4(無水)、1.5 g NaCl 共4 種組合提取試劑，根據(jù)添加回收率確認(rèn)①6.0 g MgSO4（無水）、1.5 g NaAc 的QuEChERS 試劑組合作為試驗(yàn)提取試劑的最終選擇[2-3，6]。

樣品經(jīng)組織搗碎機(jī)處理后，取10 g 粉碎樣品放入50 mL 塑料離心管中，加入6.0 g MgSO4(無水)和1.5 g NaAc 的QuEChERS 試劑組合，再加入10 mL 1% 的醋酸乙腈，強(qiáng)力振蕩后渦旋2 min后離心，4 000 r/min離心5 min[4]。

1.3.5 樣品的凈化

取1.5 mL 離心后上層清液加入到50 mg PSA、150 mg MgSO4(無水) 2 mL 的離心管，8 000 r/min 高速離心后取上層清液，0.22 μm針式過濾器過濾收集液，待測。

2 測定及分析方法

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 超高效液相色譜色譜柱的選擇

色譜柱A：WATERS ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm*2.1 mm*50 mm）碳載量18%，表面積185 m2/g，孔徑130 ?；色譜柱B：WATERS CORTECS UPLC C18（1.6 μm*2.1 mm*100 mm）碳載量6.6%，表面積100 m2/g，孔徑90 ?；色譜柱C：WATERS ACQUITY UPLC HSS T3（1.8 μm*2.1 mm*100 mm）碳載量11%，表面積230 m2/g，孔徑100 ?。

從圖1～圖3 可以看出，色譜柱A 分離和保留相對色譜柱B 和C 更加對稱，峰形更加尖銳，分離度達(dá)100%，苯醚甲環(huán)唑和氟唑菌酰胺及其代謝物色譜分離完全滿足色譜分析要求，因此選擇色譜柱A WATERS ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱[5-6]。

圖2 色譜柱B 色譜圖Fig.2 Chromatogram of column B

圖3 色譜柱C色譜圖Fig.3 Chromatogram of column C

2.1.2 流動相的選擇

分別使用A：甲醇∶水；B：乙腈∶水和C：乙腈∶0.1%甲酸水溶液三種流動相后發(fā)現(xiàn)，流動相差異對色譜峰形影響不是特別大，在相同色譜柱、相同梯度和流速下進(jìn)行檢測分析，使用C 流動相即乙腈∶0.1%甲酸水液的流動相保留時間稍短，但質(zhì)譜響應(yīng)更大，這可能與C 流動相中甲酸增加了氫離子濃度，從而提高電噴霧的質(zhì)譜響應(yīng)有關(guān)。在相同色譜柱、相同梯度和流速下進(jìn)行檢測分析，流動相使用乙腈時色譜柱柱壓更低，因此選擇C：乙腈∶0.1%甲酸水溶液作為本研究分析方法流動相。

2.1.3 流速和梯度的選擇

在色譜分離中，流動相的梯度選擇很重要，好的梯度不僅能解決色譜峰分離的問題，同時也是保護(hù)色譜柱一種好的手段。通過梯度的變化適時地保留物質(zhì)和洗脫物質(zhì)，能夠讓所進(jìn)的樣品在梯度下從色譜柱中全部洗出，而且不會對下一次進(jìn)樣產(chǎn)生干擾，同時對下一次進(jìn)樣進(jìn)行平衡，最后確定梯度洗脫條件如表1，該梯度洗脫條件下氟唑菌酰胺及其代謝物的分離色譜質(zhì)譜圖見圖4。

圖4 氟唑菌酰胺及其代謝物的分離色譜質(zhì)譜圖Fig.4 Separation chromatography-mass spectrometry of Fluxapyroxad and its metabolites

通過直接向質(zhì)譜進(jìn)樣（苯醚甲環(huán)唑、氟唑菌酰胺、F008、F048 的單標(biāo)進(jìn)樣），不經(jīng)過色譜柱分離的方式，調(diào)節(jié)錐孔電壓在10~50 V 之間變化，得到苯醚甲環(huán)唑、氟唑菌酰胺、F008、F048 的電離碎片信息[7]。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)錐孔電壓為20 V 時，有利于苯醚甲環(huán)唑、氟唑菌酰胺、F008、F048 的電離，它們的響應(yīng)值最高；掃描方式：正離子源，ESI+；毛細(xì)管電壓：2.7 kV；錐孔電壓：50 V；離子源溫度：150℃；脫溶劑溫度：500℃；脫溶劑氣流量：1 000 L/h；錐孔氣流量：90 L/h；檢測方式：多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM），如表2、圖5。

表2 苯醚甲環(huán)唑和氟唑菌酰胺及其代謝物離子對列表Tab.2 A list of ionic pairs of Difenoconazole and Fluxapyroxad and their metabolites

圖5 混合標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜TIC圖（0.005 mg/kg）Fig.5 Mass spectrometric TIC diagram of mixed standard（0.005 mg/kg）

2.2 方法的準(zhǔn)確度和精密度

2.2.1 方法的檢測限和定量限

以進(jìn)樣量為2 μL 時的3 倍色譜峰信噪比(S/N)大于3 來確定儀器的檢出限(IDL)。方法的檢出限(MDL)換算為實(shí)際樣品中可檢出的目標(biāo)物質(zhì)量濃度(mg/L)[8]。4 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99，方法檢出限為0.005 ~1.0 mg/L，表明該方法的線性范圍好，檢出限低，靈敏度高，不同添加濃度的回收率均滿足農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則的要求[9-10]。

4 種物質(zhì)在0.005 mg/L 時信噪比S/N 分別為F048：295.41，F(xiàn)008：200.06，氟唑菌酰胺：337.11，苯醚甲環(huán)唑：849.88，滿足GB/T 27417-2017《合格評定化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》中對化學(xué)物質(zhì)分析的要求，同時也滿足NY 788-2004中有關(guān)檢測限和定量限的要求[11]。

2.2.2 方法的準(zhǔn)確度

苯醚甲環(huán)唑、氟唑菌酰胺、F008 和F048 在土壤、西瓜全瓜和瓜肉中的添加濃度在0.005~0.4 mg/kg時，回收率分別為80.39%~98.74%，79.66%~94.29%，81.34%~105.62%和97.34%~98.74%，添加回收率的準(zhǔn)確度滿足農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則的要求。

2.2.3 方法的精密度

苯醚甲環(huán)唑、氟唑菌酰胺、F008 和F048 在土壤、西瓜全瓜和瓜肉中的回收率相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.21%~6.93%，1.74%~3.13%，1.50%~4.52%和1.15%~5.28%，添加回收率相對標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果滿足農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則的要求。

2.2.4 基質(zhì)效應(yīng)

將1.0 mg/mL 的苯醚甲環(huán)唑、氟唑菌酰胺、F008、F048 的標(biāo)準(zhǔn)溶液用乙腈稀釋配得0.4 mg/L、0.2 mg/L、0.1 mg/L、0.05 mg/L、0.01 mg/L、0.005 mg/L 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件下進(jìn)行測定，以苯醚甲環(huán)唑、氟唑菌酰胺、F008、F048 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與監(jiān)測離子峰面積作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

苯醚甲環(huán)唑標(biāo)樣線性方程為Y=16 891 645X+112 076，相關(guān)系數(shù)r=0.998 7，其中y 為苯醚甲環(huán)唑峰面積，x 為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度；氟唑菌酰胺標(biāo)樣線性方程為Y=4 113 084X+41 179，相關(guān)系數(shù)r=0.997 2，其中y 為氟唑菌酰胺峰面積，x 為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度；F008 標(biāo)樣線性方程為Y=2 243 283X+12 668，相關(guān)系數(shù)r=0.998 8，其中y為F008 峰面積，x 為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度；F048 標(biāo)樣線性方程為Y=3 695 287X+2 273，相關(guān)系數(shù)r=0.999 7，其中y 為F048峰面積，x為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度。

2.2.5 殘留量的計算

氟唑菌酰胺代謝物F008 和F048 的濃度轉(zhuǎn)化為氟唑菌酰胺的濃度，并與同時測出的氟唑菌酰胺進(jìn)行合并，作為氟唑菌酰胺的殘留量。

式中：R總—氟唑菌酰胺總殘留量；R氟—氟唑菌酰胺母體殘留量；RF008—氟唑菌酰胺代謝F008 轉(zhuǎn)化殘留量；RF048—氟唑菌酰胺代謝F048轉(zhuǎn)化殘留量。

3 檢測結(jié)果

3.1 土壤檢測結(jié)果

3.1.1 土壤中消解情況的檢測結(jié)果

兩年兩地的試驗(yàn)結(jié)果顯示，2016 年苯醚甲環(huán)唑在河北和安徽土壤中消解半衰期分別為99.0 d 和42.5 d，消解符合一級動力學(xué)模式，動力學(xué)方程為Y=0.038 2e-0.0070x，Y=0.038 9e-0.0163x；2017 年苯醚甲環(huán)唑在安徽和河北土壤中消解半衰期分別為49.5 d和55.5 d，消解動力學(xué)方程分別為Y=0.051 4e-0.014x，Y=0.055 6e-0.0125x。

兩年兩地的試驗(yàn)結(jié)果顯示，2016 年氟唑菌酰胺在河北和安徽土壤中消解動力學(xué)方程為Y=0.058 7e-0.0072x，Y=0.071 1e-0.0194x，半衰期分別為96.3 d 和35.8 d；2017 年氟唑菌酰胺在河北和安徽土壤中消解動力學(xué)方程分別為Y=0.154 0e-0.0180x，Y=0.154 1e-0.0186x，半衰期分別為38.5 d和37.3 d，在土壤中消解符合一級動力學(xué)模式。

3.1.2 土壤中最終殘留的檢測結(jié)果

2016 和2017 年兩年兩地殘留試驗(yàn)結(jié)果顯示，收獲期所采土壤樣品中，氟唑菌酰胺的殘留量低于0.243 7 mg/kg，苯醚甲環(huán)唑的殘留量低于0.097 2 mg/kg。

3.2 西瓜中檢測結(jié)果

3.2.1 兩地西瓜中消解情況的檢測結(jié)果

兩年兩地的試驗(yàn)結(jié)果顯示，2016 年苯醚甲環(huán)唑在河北和安徽的西瓜全瓜中消解半衰期分別為6.8 d 和6.0 d。苯醚甲環(huán)唑在西瓜全瓜中消解符合一級動力學(xué)模式，消解動力學(xué)方程為Y=0.073e-0.102x，Y=0.081e-0.115x；2017 年苯醚甲環(huán)唑在河北和安徽的西瓜全瓜中消解半衰期分別為5.5 d 和6.4 d，消解動力學(xué)方程分別為Y=0.092e-0.126x，Y=0.086e-0.108x。

兩年兩地的試驗(yàn)結(jié)果顯示，2016 年氟唑菌酰胺在河北和安徽的西瓜全瓜中消解半衰期分別為5.3 d 和5.4 d。氟唑菌酰胺在西瓜全瓜中消解符合一級動力學(xué)模式，消解動力學(xué)方程為Y=0.075e-0.13x，Y=0.076e-0.12x；2017 年氟唑菌酰胺在河北和安徽的西瓜全瓜中消解半衰期分別為4.9 d 和4.8 d，消解動力學(xué)方程分別為Y=0.077e-0.14x，Y=0.074e-0.14x。

3.2.2 西瓜中最終殘留的檢測結(jié)果

河北和安徽兩年兩地殘留試驗(yàn)結(jié)果顯示，苯醚甲環(huán)唑的殘留量低于0.009 5 mg/kg，氟唑菌酰胺的殘留量低于0.013 3mg/kg；收獲期所采西瓜瓜肉樣品中，苯醚甲環(huán)唑的殘留量低于0.005 1 mg/kg，氟唑菌酰胺的殘留量低于0.005 mg/kg。

4 結(jié)論

將快速前處理技術(shù)應(yīng)用于苯醚甲環(huán)唑、氟唑菌酰胺、F008、F048 的殘留分析，檢測效率高，前處理操作簡單，實(shí)用性強(qiáng)，可滿足對苯醚甲環(huán)唑、氟唑菌酰胺、F008、F048 樣品處理要求，比常規(guī)的液液萃取節(jié)約75%的有機(jī)溶劑和80%試驗(yàn)時間。利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定西瓜中苯醚甲環(huán)唑、氟唑菌酰胺、F008、F048殘留，能夠準(zhǔn)確提供苯醚甲環(huán)唑、氟唑菌酰胺、F008、F048 的一級、二級質(zhì)譜信息，提供了有利的定性定量依據(jù)。樣品添加回收實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，UPLC-MS/MS 檢測與QuEChERS 前處理方法聯(lián)用適用于農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境樣品中苯醚甲環(huán)唑、氟唑菌酰胺、F008、F048 殘留的確證分析，結(jié)果滿足農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則的要求，為農(nóng)藥殘留風(fēng)險評估提供了檢測方法和數(shù)據(jù)支持。