微波法合成熒光酮及其熒光性質(zhì)研究

葉思彤，張帆，崔亮霞，王寧芳，劉麗敏，張廣昊

（安徽理工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，安徽 淮南 232001）

熒光酮是以呫噸環(huán)為母體，C-9 位芳香取代基為助色團(tuán)的一類有機(jī)化合物[1]，其分子具有剛性共平面和大p 鍵結(jié)構(gòu)，容易吸收紫外、可見光并受激發(fā)產(chǎn)生熒光。苯基熒光酮結(jié)構(gòu)與熒光素相似（如圖1 所示），只是去除了羧基[2]。苯基熒光酮之所以被廣泛應(yīng)用于光度分析、熒光分析、電化學(xué)分析等分析化學(xué)領(lǐng)域是因?yàn)槠鋬?yōu)良的分析性能。近年來，苯基熒光酮類試劑更是被應(yīng)用于金屬離子[3]、糖類[4]、磷酸酯化分子[5]、HIV-1 核酸蛋白[6]、活性氧物種[7]、線粒體滲透性[8]、乙酰膽堿酯化酶[9]及核糖體蛋白酶[10]抑制作用等的分析檢測[11]，另外苯基熒光酮還可以用作硅酸鋁和半胱氨酸探針[12]。然而，目前常用的合成方法產(chǎn)率低且分離提純困難，常因沉淀顆粒太小而無法采用過濾或減壓過濾的方法提純。因此，本文在現(xiàn)有合成方法的基礎(chǔ)上，采用微波加熱技術(shù)[13-14]高效地合成了兩種熒光酮（即化合物A 和化合物B），系統(tǒng)研究了微波反應(yīng)時(shí)間、微波功率和催化劑用量對產(chǎn)率的影響，并探討了pH值和溶劑對紫外-可見吸收光譜和熒光光譜的影響。

圖1 熒光酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of fluorone

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

間苯二酚、對甲苯磺酸、苯甲醛、水楊醛、氫氧化鈉、濃鹽酸、丙酮、乙醇，均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；去離子水。

LWMC-201型微波化學(xué)反應(yīng)器，南京陵江科技開發(fā)有限公司；UV-2550 型紫外分光光度計(jì)，島津儀器有限公司；VECTOR-22型紅外分析儀，德國Bruker分析儀器有限公司；DLX600型核磁共振儀，德國Bruker分析儀器有限公司；F-4600型熒光分析儀，日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.2.1 化合物A的合成

（1）傳統(tǒng)反應(yīng)

取4.6 g（0.04 mol）間苯二酚，0.069 g 對甲苯磺酸于三口瓶中，向其中逐滴加入2.2 mL苯甲醛，控制反應(yīng)溫度為100℃～120℃，快速攪拌，反應(yīng)6 h。反應(yīng)完全后停止加熱，冷卻至室溫。將生成物移入大燒杯中，加入適量10%氫氧化鈉溶液溶解產(chǎn)物，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值為1～3。抽濾，去離子水洗滌至中性，干燥，稱重，記錄數(shù)據(jù)。粗產(chǎn)品用丙酮-乙醇混合溶劑重結(jié)晶3次，產(chǎn)率為26%。

（2）微波反應(yīng)

取間苯二酚4.6 g、苯甲醛2.3 mL 于250 mL 平底燒瓶中，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)正交表（表1）加入不同量的催化劑。連接好回流裝置，接入微波反應(yīng)器中，設(shè)定時(shí)間和功率（合成路線如圖2 所示）。反應(yīng)結(jié)束，將生成物移入大燒杯中，加入適量10%氫氧化鈉溶液溶解產(chǎn)物，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH 值為1～3。抽濾，去離子水洗滌至中性，干燥，稱重，記錄數(shù)據(jù)。粗產(chǎn)品用丙酮-乙醇混合溶劑重結(jié)晶3次。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Tab.1 Factors and levels graph of the orthogonal experiment

圖2 熒光酮的合成路線Fig.2 The synthetic route of fluorone

1.2.2 化合物B的合成

（1）傳統(tǒng)反應(yīng)

取4.6 g（0.04 mol）間苯二酚、0.069 g 對甲苯磺酸于三口瓶中，邊攪拌邊逐滴加入2.4 mL 水楊醛?？刂品磻?yīng)溫度為100℃～120℃，反應(yīng)時(shí)間為6 h，后續(xù)產(chǎn)品處理過程參照化合物A 處理方案，最終得到暗紅色微晶粉末，產(chǎn)率為40%。

（2）微波反應(yīng)

采用上述微波最佳反應(yīng)條件，取4.6 g 間苯二酚、0.069 g 對甲苯磺酸、2.4 mL 水楊醛于平底燒瓶中，微波功率260 W，加熱時(shí)間35 min，后續(xù)產(chǎn)品處理參照化合物A處理方案，產(chǎn)率為52%。

1.3 不同pH值的溶液配制

以化合物A 為例，配制初始濃度為10-4mol/ L 的乙醇溶液。用移液管分別移取1 mL 上述配制好的溶液于12 支比色管中。另取12 支50 mL燒杯，用酸度計(jì)按照pH 值遞減原則，用0.1 mol/ L 稀鹽酸、0.01 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)每個(gè)燒杯溶液pH 值分別為1.08、2.15、3.16、4.05、5.03、6.10、6.85、8.02、9.09、10.17、11.01、12.17。用燒杯中調(diào)節(jié)好pH 值的溶液定容比色管中的樣品液至10 mL，化合物A 的濃度為10-5mol/L。測試上述溶液的UV-Vis 吸收光譜和熒光光譜，化合物B 的溶液配制參照此法進(jìn)行。

1.4 不同溶劑溶液的配制

配制初始濃度為10-4mol/L 的化合物A 的溶液50 mL。溶劑分別為丙酮、乙醇和乙酸乙酯。用移液管分別移取1 mL 上述配制好的3 種不同溶劑的化合物A 溶液于3 支比色管中，加入上述不同的3 種溶劑定容至10 mL，此時(shí)化合物A的濃度為10-5mol/L，備用。

1.5 儀器與測試方法

熒光光譜用F-4600 熒光光譜儀（日本日立）測定，激發(fā)光源為450 W氙燈，激發(fā)波長490 nm，光程10 mm。熒光量子產(chǎn)率Φf用式（1）計(jì)算，參比熒光素在乙醇中的熒光量子產(chǎn)率為Φ0=0.92。

式中：F 表示熒光強(qiáng)度；A 表示激發(fā)波長處的吸光度；n為折光率；S表示樣品；0表示參比。

2 結(jié)果與討論

2.1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2 所示。由表2 可知：影響熒光酮收率因素的主次關(guān)系為C＞A＞B，最佳反應(yīng)條件為C1A2B2。最佳反應(yīng)條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)率為62.3%。我們采用常規(guī)加熱方法合成熒光酮化合物A 和B 的產(chǎn)率分別為26%和40%，與之相比，微波合成方法產(chǎn)率有明顯提高。微波合成法的最佳反應(yīng)時(shí)間為0.5 h，而傳統(tǒng)方法的反應(yīng)時(shí)間為6 h，顯著縮短了反應(yīng)時(shí)間。另外，傳統(tǒng)方法合成的熒光酮顆粒較細(xì)小，后續(xù)處理比較困難。

表2 正交實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果分析Tab.2 The results and analysis of orthogonal experiment

2.2 紅外光譜分析（圖3、圖4）

圖3 化合物A的紅外光譜Fig.3 The infrared spectrum of compound A FT-IR（KBr，disc，cm-1）:3 450，2 930，1 610，1 460，1 210.

圖4 化合物B的紅外光譜Fig.4 The infrared spectrum of compound B FT-IR（KBr，dis c，cm-1）:3 450，1 640，1 460，1 240.

2.3 1H NMR分析

由圖5 可以看出，化學(xué)位移在8.0 ppm 左右有1 個(gè)氫的單峰，歸屬為結(jié)構(gòu)A 的羥基氫原子；化學(xué)位移在7.0～7.5 ppm 左右有6 個(gè)氫原子的多重峰為呫噸環(huán)上的6 個(gè)氫原子；化學(xué)位移在6.8 ppm 左右有5 個(gè)氫的多重峰為苯基上的氫原子，綜上，符合化合物A 的預(yù)期結(jié)構(gòu)。

圖5 化合物A 的1H NMR圖譜Fig.51H NMR spectrum of compound A

由圖6 可以看出，化學(xué)位移在8.5 ppm 左右有2 個(gè)氫的多重峰，歸屬為結(jié)構(gòu)B 的羥基氫原子；化學(xué)位移在7.0～7.2 ppm 左右有6 個(gè)氫原子的多重峰為呫噸環(huán)上的6 個(gè)氫原子；化學(xué)位移在6.8 ppm 左右有4 個(gè)氫的多重峰為苯基上的氫原子，綜上，符合化合物B 的預(yù)期結(jié)構(gòu)。

圖6 化合物B的1HNMR圖譜Fig.61HNMR spectrum of compound B

2.4 pH 值對化合物紫外-可見吸收光譜和熒光光譜的影響

圖7、圖8 分別是化合物A 和化合物B 的紫外-可見吸收光譜。從圖中可以看出，化合物A 和化合物B 的紫外-可見吸收光譜位置和峰型均隨溶液pH 值變化而有所改變，說明化合物在溶液中存在解離平衡（以化合物B為例）：

圖7 水溶液中不同pH下化合物A的紫外-可見吸收光譜Fig.7 UV-Vis absorption spectra of compound A at different pH in aqueous solution

圖8 水溶液中不同pH下歸一化的化合物B的紫外-可見吸收光譜Fig.8 Normalized UV-Vis absorption spectra of compound B at different pH in aqueous solution

當(dāng)溶液pH＜3.16 時(shí)，化合物A 主要以H2M+形式存在，其吸收光譜為在443 nm 處的單吸收峰。隨著溶液pH的增大，H3M+濃度逐漸減小，443 nm處的吸收峰不斷降低，HM 濃度逐漸增加，452 nm 處的吸收峰逐漸增大。當(dāng)溶液pH 增大到6.10 時(shí)，化合物A 主要以HM 形式存在，此時(shí)443 nm 處的吸收峰消失，在452 nm 處有一寬吸收峰。隨著溶液pH 逐漸增大，452 nm 處吸收峰逐漸減弱，499 nm 處新的吸收峰逐漸增強(qiáng)，此時(shí)化合物A 主要以HM 和M-的形式存在。當(dāng)溶液pH 大于10.17 時(shí)，452 nm 處的吸收峰消失，499 nm 處的吸收峰進(jìn)一步增強(qiáng)，表明此時(shí)化合物A主要以M-形式存在。

對于化合物B 來說，當(dāng)pH＜2.05 時(shí)化合物主要以一價(jià)陽離子（H3M+）形式存在，此時(shí)其最大吸收波長為439 nm。當(dāng)溶液pH 在2.05 至7.89 之間時(shí)，化合物主要以中性（H2M）形式存在，此時(shí)一價(jià)陽離子的吸收峰逐漸降低并消失，485 nm 處的吸收峰逐漸增強(qiáng)。當(dāng)溶液pH為7.89～10.02時(shí)，化合物主要以一價(jià)陰離子（HM-）形式存在，此時(shí)中性形式吸收峰消失，一價(jià)陰離子吸收峰增強(qiáng)。當(dāng)溶液pH＞10.02 時(shí)，化合物主要以二價(jià)陰離子（M2-）形式存在，此時(shí)在493 nm 處出現(xiàn)新的強(qiáng)吸收峰。與化合物A 相比，化合物B 在水溶液中的不同解離形式對應(yīng)的吸收光譜峰型相似，只是吸收波長有不同程度的藍(lán)移，這表明在苯環(huán)上引入的羥基對具有共軛大π鍵的呫噸環(huán)結(jié)構(gòu)影響較小，紫外-可見吸收光譜峰形變化不大。

不同pH 值下化合物A 和化合物B 的熒光光譜（激發(fā)波長490 nm）如圖9、圖10 所示。從圖9、圖10 可以看出，隨著溶液pH 值降低，化合物A 的熒光光譜峰位置沒有明顯改變，但是其峰型變寬，熒光強(qiáng)度降低明顯，從pH 為12 的6 851 下降到pH 為1.08 的712.8；化合物B 的熒光光譜受溶液pH 值的影響與化合物A 相似，只是其熒光下降更明顯，從pH 為12 的6 218 下降到pH 為1.08 的56.33，這與文獻(xiàn)[15]中熒光素染料在堿性條件下M2-強(qiáng)度最強(qiáng)，中性和H3M+條件下熒光強(qiáng)度較弱相一致。

圖9 水溶液中不同pH下化合物A的熒光光譜Fig.9 Fluorescence spectra of compound A at different pH in aqueous solution

圖10 水溶液中不同pH下化合物B的熒光光譜Fig.10 Fluorescence spectra of compound B at different pH in aqueous solution

2.5 溶劑對化合物紫外-可見吸收光譜和熒光光譜的影響

圖11、圖12分別是化合物A/B在三種不同溶劑（丙酮、乙醇、乙酸乙酯）中的紫外-可見吸收光譜和熒光光譜?；衔顰/B的紫外-可見光吸收光譜表現(xiàn)出p-p*躍遷的特征強(qiáng)吸收?；衔顰在極性較大的乙醇中，具有更明顯的三個(gè)吸收帶，分別位于439 nm、469 nm和505 nm處。在極性相對較小的丙酮和乙酸乙酯中，其電子躍遷的最大吸收峰由第三峰變?yōu)榱酥虚g峰，且其吸收峰的位置也隨溶液極性增大而發(fā)生紅移，原因是溶劑和熒光酮形成了氫鍵或溶劑的偶極使其極性增強(qiáng)，在π→π*躍遷的情況下，其激發(fā)態(tài)的極性比基態(tài)強(qiáng)，極性溶劑使其激發(fā)態(tài)能量降低，躍遷更容易，吸收帶紅移。對于化合物B 來說，其電子吸收峰型未隨溶劑極性的改變而發(fā)生變化，僅是峰位置隨溶劑極性增大而發(fā)生紅移。計(jì)算得到的對應(yīng)最大吸收峰的摩爾消光系數(shù)以及其他相關(guān)光物理數(shù)據(jù)如表3所示。

表3 化合物A/B不同溶劑熒光量子產(chǎn)率Tab.3 Fluorescence quantum yield of compound A/B in different solvents

圖11 化合物A/B在不同溶劑中的紫外-可見吸收光譜Fig.11 UV-Vis absorption spectrum of compound A and B in different solvents

圖12 化合物A/B在不同溶劑中的熒光光譜Fig.12 Fluorescence spectrum of compound A and B in different solvents

與電子吸收光譜相比，溶劑極性對熒光發(fā)射光譜影響相對較小，化合物在三種溶劑中的熒光發(fā)射光譜峰型相似，峰位置紅移約為2 nm（最大吸收峰紅移約45 nm）。在化合物濃度均為10-5mol/L時(shí)，其熒光強(qiáng)度在三種溶劑中有很大不同，乙醇中的熒光強(qiáng)度明顯高于其他兩種溶劑。這可能是溶劑效應(yīng)和分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移同時(shí)作用的結(jié)果，化合物在丙酮和乙酸乙酯中的熒光量子產(chǎn)率也明顯小于乙醇。化合物A/B 在乙酸乙酯和丙酮中的最低激發(fā)能Es變化很小，而在乙醇中的最低激發(fā)能Es變化相對較大，這與溶劑極性對紫外-可見吸收光譜的影響相一致。

3 結(jié)論

微波法合成熒光酮的最佳反應(yīng)條件：催化劑用量0.046 g（反應(yīng)物質(zhì)量的1%），微波功率260 W，加熱時(shí)間30 min。在此反應(yīng)條件下，產(chǎn)率為62%。此合成方法與傳統(tǒng)方法相比，具有反應(yīng)速率快，溫度易于控制，反應(yīng)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用十分廣泛?；衔顰/B電子吸收光譜峰型和峰位置均隨著溶液pH值的改變而改變，在不同pH 條件下存在三種解離平衡：二價(jià)陰離子、一價(jià)陰離子和中性形式?；衔顰/B 的三種解離形式以二價(jià)陰離子的熒光性能最好?；衔顰/B 的紫外-可見吸收光譜和熒光光譜隨溶劑極性的增大也發(fā)生一定的變化，其中以化合物A 變化較為明顯?；衔顰/B的熒光量子產(chǎn)率均隨溶劑極性增加而增大，其最低激發(fā)能變化則相對較小。