山蒼子對水生浮游動物的毒性影響探究

賴芷迎，何文美，陳偉萍，姚婉清

（嘉應(yīng)學(xué)院化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣東 梅州 514015）

我國擁有豐富的山蒼子（Litsea cubeba）資源，山蒼子又名山雞椒、山胡椒、木姜子，屬于樟科木姜子屬[1]，常用于提取山蒼子油。山蒼子油的主要成分是檸檬醛，其具有抗真菌的效果，廣泛應(yīng)用于香料合成、醫(yī)療保健、食品保鮮等領(lǐng)域，有抑菌、滅菌、驅(qū)蟲等作用[2]。林崗[3]等采用掃描電鏡和透射電鏡觀察到山蒼子精油可以破環(huán)同絲水霉卵孢子的細(xì)胞壁、水霉卵孢子內(nèi)脂質(zhì)體外膜結(jié)構(gòu)，對同絲水霉的菌絲生長具有抑制作用。因此，山蒼子也常被應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)[4-6]，對患有水霉病的病魚具有良好的療效。水霉菌還會影響其他水生生物的生態(tài)健康，浮游動物作為水生生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，其生存和健康狀態(tài)對生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定和可持續(xù)發(fā)展至關(guān)重要。

大型蚤處于水生生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)循環(huán)和能量流動的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在水生態(tài)食物鏈起承上啟下的作用[7]。蚤類主要攝食水中的藻類，可以控制藻類爆發(fā)，而且其本身含有大量的蛋白質(zhì)、鈣等營養(yǎng)物質(zhì)，是魚類重要的食物來源之一。大型蚤也常被作為水體健康的重要指標(biāo)，它對水生態(tài)環(huán)境的變化非常敏感，易受到水中污染物、致病微生物如水霉菌、真菌等影響。

本文以大型蚤為試驗生物，研究山蒼子投放對蚤的生長繁殖的影響，探究山蒼子作為水生態(tài)健康調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用前景。

1 實驗材料和方法

1.1 材料

山蒼子由嘉應(yīng)學(xué)院彭夢俠老師課題組提供[8]，產(chǎn)地為廣西桂林；檸檬醛（C10H16O）含量為4.66%；大型蚤和蛋白核小球藻由暨南大學(xué)水生生物研究所贈與。大型蚤的培養(yǎng)和試驗溫度為23℃± 2℃，光暗比為16 h∶8 h，每只大型蚤有10～15 mL 水的生存空間，以保證大型蚤在孤雌生殖的狀態(tài)下。選用實驗室條件下孤雌生殖3代以上的同一批母體產(chǎn)出的24～48 h 內(nèi)的幼蚤為實驗蚤。挑選健康幼蚤進(jìn)行重鉻酸鉀敏感性測定，符合測定標(biāo)準(zhǔn)重鉻酸鉀的24 h-LC50為0.5～1.2 mg/L 后進(jìn)行試驗。小球藻采用BG11 培養(yǎng)液培擴增培養(yǎng)，喂蚤的藻液濃度為10.6×106cell/mL。

1.2 實驗藥劑

山蒼子儲備液：稱取4 g 過35 目篩的山蒼子粉末于500 mL 的細(xì)口瓶中，分3次加入400 mL 純水，每次加入100～150 mL，振蕩15 min，靜置3 h 后取出上清液。三次浸出完成后得到10 mg/mL 的山蒼子儲備液。其余藥品皆為分析純，玻璃器皿都經(jīng)過無菌處理。

1.3 山蒼子毒性預(yù)實驗

按照《水質(zhì)物質(zhì)對蚤類（大型蚤）急性毒性測定方法》（GB/T 13266—91）[9]設(shè)置預(yù)實驗，選用1 mg/mL 和3 mg/mL 為預(yù)實驗濃度，每杯10 只大型蚤，并設(shè)置空白對照組，每組3個平行，24 h后記錄其蚤死亡數(shù)和蛻殼數(shù)。

1.4 大型蚤慢性毒理實驗

根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果確定低、中、高濃度分別為0.02 mg/mL、0.1 mg/mL、0.5 mg/mL 的慢性毒理實驗組，每杯加入10 只大型蚤，并設(shè)置空白對照組，每組3 個平行樣品。所有實驗組放入光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每24 h 更換一次培養(yǎng)液。每日記錄大型蚤的存活數(shù)、蛻殼數(shù)、死亡數(shù)、初次產(chǎn)蚤時間、新生小蚤數(shù)。第1 天和第2 天置于顯微鏡下測量體長，從第3天開始每間隔48 h量一次體長。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

利用excel 和origin 統(tǒng)計數(shù)據(jù)、分析和作圖，顯著性分析選用bonferroni檢驗進(jìn)行兩兩比對。

2 結(jié)果與討論

2.1 山蒼子對大型蚤體長的影響

經(jīng)過14 天的培養(yǎng)，統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，空白組、0.02 mg/mL 組、0.1 mg/mL 組的蚤的最終體長無顯著性差異（p>0.05），但0.02 mg/mL 和0.1 mg/mL 組的大型蚤表現(xiàn)出更快的進(jìn)食速度和活力，頭上的枝角明顯粗壯，說明山蒼子濃度≤0.1 mg/mL 時，山蒼子對蚤的生長有一定的積極作用；0.5 mg/mL 組與其他組的蚤體長有顯著性差異（p<0.05），且大型蚤的體寬偏小，活力差，攝食速度緩慢，同時蚤的枝角與身體上被絮狀物纏繞，使其運動受到影響。14 天后，山蒼子濃度為0.02 mg/mL實驗組的大型蚤的體長最長，平均為1.052 mm，濃度為0.5 mg/mL 的蚤體長最短，平均為0.736 mm（圖1），說明山蒼子投放濃度高于0.5 mg/mL 時，不利于大型蚤的生長。

圖1 大型蚤的平均體長變化（n=3）

由大型蚤平均體長（圖1）與增長率（圖2）可知，山蒼子濃度為0.1 mg/mL 組和0.5 mg/mL 組對幼蚤的生長有抑制作用。在第2 天和第4 天，0.1 mg/mL 和0.5 mg/mL 組的幼蚤體長增長率明顯低于空白組和0.02 mg/mL實驗組（p<0.05），說明山蒼子濃度高于0.1 mg/mL 時會抑制幼蚤的生長（圖2）。在第6 天，0.1 mg/mL 組的幼蚤的體長增長率顯著增加，與空白組、0.02 mg/mL 組和0.5 mg/mL 組的增長率有顯著性差異（p<0.05），說明隨蚤齡增長，大型蚤體質(zhì)增強，能夠抵抗低濃度山蒼子帶來的負(fù)面影響，恢復(fù)正常的生長速率。同時，0.5 mg/mL組的幼蚤的體長增長率無明顯增加，說明高濃度的山蒼子對幼蚤的生長有抑制作用。從第8 天開始，各個實驗組的蚤體長增長速率無顯著差異。

圖2 大型蚤的每日體長增長率的變化

綜上所述，山蒼子濃度低于0.1 mg/mL 時可能更有利于成年蚤的生長，魚類研究學(xué)者也報道在山蒼子治療后的水霉病病魚恢復(fù)健康后表現(xiàn)出更好的食欲和活力，推測山蒼子抑制了大型蚤培養(yǎng)液中的水霉菌[10-11]或其他致病菌的繁殖，使得大型蚤能夠更健康生長。但是，山蒼子濃度高于0.5 mg/mL 時，大型蚤的生長明顯受到抑制，說明山蒼子的投放量應(yīng)受到嚴(yán)格控制。

2.2 對大型蚤蛻殼數(shù)的影響

大型蚤的體長增長是間歇性的，其生長與蛻殼交替進(jìn)行。山蒼子對大型蚤蛻殼數(shù)的影響如圖3 所示。在14 天培養(yǎng)實驗期間，各組的大型蚤的日蛻殼數(shù)總體呈下降趨勢，山蒼子濃度為0.02 mg/mL組的大型蚤的日蛻殼數(shù)始終處于高位，空白組和0.1 mg/mL 數(shù)量次之，而0.5 mg/mL 組的蛻殼數(shù)始終處于最低（p<0.05）（圖4）。燒杯中大型蚤在實驗第2 天初次蛻殼，0.02 mg/mL 組的蛻殼數(shù)量最多，是0.5 mg/mL 組的兩倍多（圖3），遠(yuǎn)大于其他兩組，而0.5 mg/mL 組的蛻殼數(shù)量遠(yuǎn)小于空白組和0.1 mg/mL 組，說明山蒼子的濃度大于0.1 mg/mL 時，幼蚤的蛻殼數(shù)明顯受到影響。第8 天0.1 mg/mL 組的蛻殼數(shù)趨同于空白組，而后超過空白組，說明此時山蒼子對幼蚤的退殼影響逐漸變小，最后各組的日蛻殼數(shù)趨于相同。

圖3 大型蚤的日蛻殼數(shù)

圖4 大型蚤的累計蛻殼數(shù)

從各組的總蛻殼數(shù)來看，也是0.02 mg/mL組的數(shù)量始終處于最高位，空白組和0.1 mg/mL 數(shù)量次之，而0.5 mg/mL 組的蛻殼數(shù)始終處于最低（p<0.05）（圖4）。盡管在第5 和第6 天，空白組和0.1 mg/mL 數(shù)量相同，但是之后空白組的總蛻殼數(shù)高于0.1 mg/mL 組，說明山蒼子對蚤的體長影響可以通過抑制蛻殼來體現(xiàn)，尤其是當(dāng)山蒼子濃度超過0.5 mg/mL時，退殼數(shù)量明顯減少，無法順利退殼，導(dǎo)致大型蚤的生長和發(fā)育滯后。

2.3 對大型蚤產(chǎn)蚤數(shù)量的影響

山蒼子對大型蚤產(chǎn)蚤數(shù)量的影響如圖5 所示?？瞻捉M和0.02 mg/mL 實驗組的大型蚤在第6 天開始背卵，0.1 mg/mL在第7天開始背卵，而0.5 mg/mL組在14天的培養(yǎng)過程中始終沒有出現(xiàn)背卵現(xiàn)象。在4 個培養(yǎng)組中，0.02 mg/mL 組最早產(chǎn)蚤10 只，比空白組還要多8 只，說明0.02 mg/mL 濃度的山蒼子會促使大型蚤提前背卵繁殖。這可能是由于山蒼子的抑菌效果和其中含有的內(nèi)含物為蚤提供了營養(yǎng)物質(zhì)，但該促進(jìn)作用并未持續(xù)至整個實驗周期。在第11 天，空白組、0.02 mg/mL 和0.1 mg/mL 組出現(xiàn)產(chǎn)蚤高峰，其中產(chǎn)蚤數(shù)最多的為0.1 mg/mL組，可見該濃度的山蒼子使得蚤的繁殖滯后。0.5 mg/mL的產(chǎn)蚤數(shù)為0，可見高濃度的山蒼子對蚤有一定的生殖毒害作用。

圖5 大型蚤每日產(chǎn)蚤數(shù)

從大型蚤的產(chǎn)蚤總數(shù)來看（圖6），空白組的總產(chǎn)蚤數(shù)最多，但空白組與0.02 mg/mL 組沒有顯著性差異（p>0.05），而0.1 mg/mL 組的總產(chǎn)蚤數(shù)略低于前兩組。0.5 mg/mL 的山蒼子生殖毒性顯著。此外在培養(yǎng)過程中，除空白組外，其余實驗組的新生小蚤在出生24～48 h 后出現(xiàn)少量的死亡，且0.1 mg/mL 組的新生小蚤死亡數(shù)比0.02 mg/mL組多，說明雖然0.02 mg/mL對初代蚤的生長和蛻殼無明顯影響，但可能會影響到二代蚤的生長。

圖6 大型蚤總產(chǎn)蚤數(shù)（n=3）

2.4 對大型蚤存活率的影響

從大型蚤存活數(shù)量（圖7）可知，0.02 mg/mL 組的存活數(shù)量最高（90%左右），而0.05 mg/mL 組的最低。山蒼子濃度為0.05 mg/mL 的組在第2 天即出現(xiàn)了大型蚤死亡，在第3～5天中死亡率持續(xù)增加至30%，并在第10天后繼續(xù)降低，可見高濃度的山蒼子會導(dǎo)致幼蚤迅速死亡，并在蚤成年后還有毒害作用。中濃度0.1 mg/mL 組也從第5 天開始出現(xiàn)了較大量的死亡，直至第7 天存活的蚤數(shù)保持在較穩(wěn)定的水平，可見中濃度的山蒼子對幼蚤的毒性明顯，但是對成年蚤的毒性較小。值得注意的是，0.02 mg/mL 組的存活數(shù)量始終保持在最高水平，而空白組的死亡數(shù)在第7天開始逐日增加，甚至在第10天以后，空白組低于0.01 mg/mL組。出現(xiàn)這種情況可能是由于在南方濕熱多菌的周邊環(huán)境中，無抑菌物質(zhì)的空白組溶液更容易產(chǎn)生致病菌，使幼蚤染病導(dǎo)致死亡，而少量添加山蒼子可以抑菌，保持較高的蚤的存活率。第14 天，山蒼子濃度為0.02 mg/mL 組的大型蚤存活率最高，為86.7%，且存活數(shù)量與其他組呈顯著性差異（p<0.05），0.1 mg/mL 組與空白組的存活率分別是73.3%和66.7%，這兩組沒有呈現(xiàn)顯著性差異（p>0.05），存活率最低的0.5 mg/mL組只有56.7%。

圖7 大型蚤的存活數(shù)

由此可見，中等山蒼子濃度時，幼年的大型蚤生長受到山蒼子抑制，甚至導(dǎo)致其死亡；隨著年齡的增大，蚤體的抵抗力增加，山蒼子對其生長的負(fù)面作用也慢慢消失，山蒼子抑制水中致病菌繁殖，能降低成年蚤的病死率。其次，山蒼子具有豐富的蛋白質(zhì)和可能含有有利于成年蚤生長的營養(yǎng)元素。低濃度的山蒼子具有抑制殺滅水中致病菌、真菌的作用，改善水生態(tài)環(huán)境，有利于浮游生物的健康。

3 結(jié)論與展望

山蒼子濃度對浮游動物生長繁殖的影響并不是簡單的線性關(guān)系。山蒼子雖然具有抑制水中致病微生物的作用，但是大量使用山蒼子（濃度>0.5 mg/mL）能導(dǎo)致水生浮游動物的死亡，且山蒼子濃度和浮游動物的死亡率成正相關(guān)，不利于水生態(tài)系統(tǒng)的良性發(fā)展。因此在水產(chǎn)養(yǎng)殖中控制山蒼子的使用量非常必要，否則會導(dǎo)致水生蚤類大量死亡，破壞生態(tài)平衡，降低經(jīng)濟(jì)收益。山蒼子的使用濃度低于0.02 mg/mL較為安全，抑制致病菌的同時對浮游動物的繁殖影響較小，而且對其生長有促進(jìn)作用，對水生態(tài)環(huán)境的物質(zhì)循環(huán)與能量流動具有積極的作用，可應(yīng)用于水生生物生長促進(jìn)劑。山蒼子濃度在0.02～0.1 mg/mL 區(qū)間內(nèi)，對幼年浮游動物的生長具有抑制作用，但有利于成年個體的生長，并可能影響下一代幼蚤的存活。山蒼子的抑菌作用可調(diào)節(jié)水生浮游動物的生長環(huán)境，淘汰健康狀況不佳的個體，得到更為身強體壯的個體。

本研究僅分析山蒼子濃度對大型蚤生長繁殖的影響，未測定實驗前后水樣山蒼子主要抑菌成分如檸檬醛的濃度變化。14 天的實驗時間對于蚤的生長周期相對較短，未來的實驗可以增加實驗時長，觀察第二代或者第三代的生長狀況，探討長期的影響。將來的研究可以針對山蒼子對大型蚤的影響，檢測相關(guān)酶活性和蛋白質(zhì)變化，了解山蒼子的作用機理。