鳩坑龍井茶對(duì)高脂飲食C57BL/6小鼠肝脂肪變性SREBPs通路信號(hào)的影響及腸道菌群調(diào)節(jié)作用研究

龔明秀，袁懿煒，張一帆，葉江成，郭麗，李曉軍，黃皓，毛宇驍，趙蕓，趙進(jìn)*

鳩坑龍井茶對(duì)高脂飲食C57BL/6小鼠肝脂肪變性SREBPs通路信號(hào)的影響及腸道菌群調(diào)節(jié)作用研究

龔明秀1,2，袁懿煒1,2，張一帆1,2，葉江成1,2，郭麗3，李曉軍4，黃皓4，毛宇驍5，趙蕓5，趙進(jìn)1,2*

1. 中國(guó)計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，食品營(yíng)養(yǎng)與質(zhì)量安全研究所，浙江 杭州 310018；2. 特色農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)與危害物控制技術(shù)浙江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310018；3. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；4. 浙江藝福堂茶業(yè)有限公司博士創(chuàng)新工作站，浙江 杭州 311500；5. 杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310024

探究鳩坑龍井茶水提物（LJT）對(duì)小鼠肝組織脂質(zhì)代謝SREBPs通路信號(hào)影響及腸道菌群的調(diào)節(jié)作用。通過(guò)高脂飲食誘導(dǎo)小鼠構(gòu)建非酒精性脂肪肝（NAFL）模型，并給予LJT（300?mg·kg-1）灌胃干預(yù)。定期記錄小鼠的體質(zhì)量，檢測(cè)小鼠血清生化指標(biāo)和葡萄糖耐受水平，觀察并分析Hematoxylin-Eosin（HE）染色、油紅O染色肝組織切片特征；應(yīng)用Real-time qPCR技術(shù)檢測(cè)小鼠肝組織SREBPs通路7個(gè)基因（-、、-、-、-、、）的相對(duì)表達(dá)量，采用蛋白免疫印記技術(shù)（Western Blot）分析肝組織蛋白質(zhì)表達(dá)水平，同時(shí)對(duì)小鼠腸道菌群進(jìn)行高通量測(cè)序（16?S rDNA）并分析其結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，LJT干預(yù)后小鼠體質(zhì)量、血糖AUC、血清TG、TC、LDL-C和肝臟中TG、TC水平有顯著下降，龍井組小鼠肝組織SREBP-1c、FAS、ACC-1、SCD-1和PPAR蛋白表達(dá)水平降低，-、-、、-、-、、基因的相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)；16?S rDNA分析發(fā)現(xiàn)，小鼠腸道菌群門(mén)水平主要為Firmicutes、Bacteroidota、Desulfobacterota和Actinobacteriota4類(lèi)，LJT有效延緩了高脂飲食引起的Firmicutes相對(duì)豐度升高和Bacteroidota相對(duì)豐度下降趨勢(shì)，并增加了腸道菌群的物種豐度。結(jié)果表明，LJT能夠干預(yù)小鼠肝脂肪變性SREBPs通路信號(hào)表達(dá)，改善小鼠腸道菌群紊亂，具有降脂減肥作用。

鳩坑龍井茶；非酒精性脂肪肝；SREBPs通路；腸道菌群紊亂；降脂作用

非酒精性脂肪肝病（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除酒精、藥物和單基因遺傳等肝損傷原因外，導(dǎo)致的肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚引起的綜合征，肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的積聚（即肝脂肪變性）是NAFLD的標(biāo)志[1]。其發(fā)展過(guò)程包括從非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver，NAFL）到非酒精性脂肪性肝炎（Non-alcoholic steato-hepatitis，NASH），甚至是晚期的肝纖維化和肝硬化[2]。此癥狀與心血管疾病[3]、肥胖[4]、Ⅱ型糖尿病[5]和肝外惡性腫瘤[6]等代謝疾病密切相關(guān)。報(bào)道顯示，NAFLD成為我國(guó)發(fā)病率最高的慢性肝病，在部分地區(qū)達(dá)25%[7]。腸道菌群與NAFLD密切相關(guān)，可以通過(guò)激活固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（Sterol regulatory element binding proteins，SREBPs）來(lái)影響宿主脂質(zhì)代謝[8]。SREBPs是調(diào)控膽固醇、甘油三酯和脂肪酸從頭合成的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)調(diào)節(jié)SREBPs信號(hào)通路抑制肝臟中脂質(zhì)沉積，緩解NAFLD癥狀。

《地理標(biāo)志產(chǎn)品龍井茶》（GB/T 18650—2008）指出，鳩坑種是適宜加工龍井茶的茶樹(shù)良種，其芽葉肥壯，持嫩性強(qiáng)，內(nèi)含物質(zhì)豐富，具有相對(duì)豐富的香氣成分[9-10]。茶多酚具有良好的降脂作用，且降脂功效的強(qiáng)弱與其濃度呈正相關(guān)[11]。Li等[12]研究發(fā)現(xiàn)龍井茶能預(yù)防酒精引起的肝臟脂質(zhì)的累積，Ma等[13]研究顯示綠茶通過(guò)調(diào)節(jié)SREBPs信號(hào)通路抑制肝臟中脂質(zhì)沉積。本研究通過(guò)高脂飲食誘導(dǎo)C57BL/6小鼠構(gòu)建非酒精性肝脂肪變性模型，研究鳩坑龍井茶水提物對(duì)小鼠肝組織脂質(zhì)代謝SREBPs通路信號(hào)的影響及腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而解析鳩坑龍井茶改善小鼠NAFLD功效的作用機(jī)理，旨在為促進(jìn)鳩坑龍井茶產(chǎn)品的功效應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2021年11月19日采摘桐廬茶園的鳩坑種茶樹(shù)鮮葉，按照龍井茶工藝加工制作龍井茶。

8周齡雄性SPF級(jí)C57BL/6小鼠購(gòu)自杭州子源實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，使用許可證號(hào)為SYXK（浙）2018-0009。

小鼠普通飼料（蛋白質(zhì)20.6%、脂肪12%、碳水化合物67.4%）購(gòu)自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司，高脂飼料（蛋白質(zhì)26.2%、脂肪34.9%、碳水化合物26.3%）購(gòu)自無(wú)錫帆泊生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 指標(biāo)測(cè)定

水分含量參照GB 5009.3—2016直接干燥法，水浸出物含量參照GB/T 8305—2013方法，咖啡堿含量參照GB/T 8312—2013紫外分光光度法，茶多酚及兒茶素含量參照GB/T 8313—2018方法，游離氨基酸含量參照GB/T 8314—2013方法，可溶性糖含量采用苯酚-硫酸法[14]，可溶性蛋白含量測(cè)定采用微孔酶標(biāo)法。

1.2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國(guó)計(jì)量大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)：2022年第28號(hào)）。40只體質(zhì)量為(23.00±1.00)?g的C57BL/6雄性小鼠，安置在常規(guī)環(huán)境（12?h光/暗循環(huán)）中，自由取食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行隨機(jī)分組，分為正常組（Normal）、高脂組（Model）、陽(yáng)性對(duì)照組（簡(jiǎn)稱(chēng)陽(yáng)性組，Control）和鳩坑龍井茶水提物干預(yù)組（簡(jiǎn)稱(chēng)龍井組，LJT），小鼠分組方案如表1所示，小鼠每天進(jìn)行灌胃。鳩坑龍井茶水提物的制備參照Li等[15]的方法并進(jìn)行完善，用95?℃熱水按料液比1∶20浸提茶制品5?min，趁熱抽濾、旋蒸得濃縮濾液，然后–55?℃冷凍干燥24?h得到茶水提取物凍干粉，用于配置灌胃所需茶湯。每周測(cè)定小鼠體質(zhì)量，在第9周飼養(yǎng)結(jié)束后解剖小鼠，觀察并記錄小鼠、肝臟和附睪脂肪形態(tài)，按照下列公式計(jì)算Lee’s指數(shù)：

式中，為小鼠體質(zhì)量，g；為小鼠體長(zhǎng)，cm。

1.2.3 口服葡萄糖耐受量實(shí)驗(yàn)（OGTT）

在小鼠飼喂第5周，禁食不禁水12?h，測(cè)定各組小鼠空腹血糖值。小鼠灌胃20%葡萄糖水溶液（2?g·kg-1），在小鼠空腹和灌胃后第15、30、60、120?min，分別用羅氏血糖儀和檢測(cè)試紙條依次測(cè)定相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的小鼠血糖值，計(jì)算時(shí)間-血糖曲線(xiàn)下面積（AUC）。

1.2.4 小鼠血清采集

在小鼠培養(yǎng)第9周，禁食不禁水過(guò)夜（12?h）。禁食結(jié)束后，采用眼球取血方式采集小鼠鮮血于抗凝管中靜置2?h，然后以3?000?r·min-1冷凍離心（4?℃）10?min，收集上層血清并及時(shí)儲(chǔ)存于–80?℃冰柜。

1.2.5 血清和肝臟常規(guī)指標(biāo)測(cè)定

血清和肝臟中高密度脂蛋白膽固醇（High-density lipoprotein，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（Low-density lipoprotein，LDL-C）、總膽固醇（Total cholesterol，TC）、總甘油三酯（Total triglyceride，TG）和總蛋白（Total protein，TP）等含量，谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）的活性采用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定。

表1 小鼠分組方案

1.2.6 肝臟組織染色

采集小鼠肝組織并置于10%福爾馬林組織固定液中48?h，參考馮琳等[16]方法并對(duì)其進(jìn)行油紅O染色和HE染色切片制作。

1.2.7 蛋白免疫印記

小鼠肝臟樣品液氮保存送至杭州紐貝生物有限公司，采用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)（Western blot）分析小鼠肝組織脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)情況。通過(guò)SuperSignal?West Dura Extended Duration Substrate進(jìn)行顯影和定影，使用Image J 1.8.0圖像處理軟件（美國(guó)）分析條帶的光密度值，每個(gè)條帶重復(fù)3次，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=[目的蛋白（光密度值）/內(nèi)參（光密度值）]×10n。

1.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1.2.9 腸道菌群檢測(cè)

采集小鼠結(jié)腸部位內(nèi)容物，提取樣品總DNA后，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)得到引物，在引物末端加上測(cè)序接頭，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化形成測(cè)序文庫(kù)并進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫(kù)用Illumina NovaSeq 6000進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序由北京擎科生物公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 鳩坑龍井茶主要理化成分檢測(cè)結(jié)果

鳩坑龍井茶主要理化成分檢測(cè)結(jié)果如表3所示。鳩坑龍井茶中水浸出物含量為(31.590±0.292)%，茶多酚含量為(19.773±0.284)%，可溶性糖含量為(4.656±0.070)%，可溶性蛋白含量為(4.103±0.026)%，咖啡堿含量為(2.455±0.012)%，水分含量為(5.173±0.132)%。

2.2 鳩坑龍井茶對(duì)高脂飲食小鼠臟器、體質(zhì)量和Lee’s指數(shù)的影響

鳩坑龍井茶對(duì)小鼠形體的影響如圖1所示。由圖1A可知，經(jīng)過(guò)9周的高脂飲食誘導(dǎo)性飼養(yǎng)，高脂組、陽(yáng)性組和龍井組小鼠的體型明顯比正常組肥大，其中龍井組小鼠體型比高脂組瘦小；正常組小鼠肝臟呈現(xiàn)為健康的深紅褐色，高脂組肝臟顏色偏黃，有明顯脂肪聚積現(xiàn)象，陽(yáng)性組和龍井組小鼠肝組織形態(tài)與正常組相近；高脂組小鼠附睪脂肪體積與其他3組有明顯差異。

表2 熒光定量PCR引物序列

小鼠飼喂期間體質(zhì)量和體形變化情況如圖1B和圖1C所示。高脂組小鼠體質(zhì)量和Lee’s指數(shù)顯著高于正常組（<0.05），陽(yáng)性組和龍井組小鼠體質(zhì)量顯著低于高脂組（<0.05）。研究結(jié)果顯示，高脂飲食能夠誘導(dǎo)小鼠肥胖與小鼠肝組織脂肪堆積，并導(dǎo)致肝脂肪變性，而通過(guò)長(zhǎng)期飲食鳩坑龍井茶能減緩或者改善小鼠肝脂肪變性癥狀。

2.3 小鼠血糖耐受水平檢測(cè)分析

小鼠血糖變化如圖2所示。正常組小鼠血糖值在口服葡萄糖溶液15?min后達(dá)到最高水平，120?min后下降至接近正常水平，并且正常組小鼠在口服糖期間AUC值顯著低于高脂組（<0.01）；高脂組、陽(yáng)性組和龍井組小鼠血糖在口服葡萄糖后30?min達(dá)到最高水平，120?min后高脂組血糖水平仍高于正常組，而陽(yáng)性組、龍井組小鼠血糖值趨近于正常組水平，并顯著低于高脂組（<0.05）。

表3 鳩坑龍井茶中主要理化成分含量

注：A為小鼠體型、肝臟和附睪脂肪，B為0～9周小鼠體質(zhì)量變化，C為小鼠Lee’s指數(shù)。*表示與高脂組相比P<0.05

由圖2B可知，與高脂組小鼠相比，正常組、陽(yáng)性組和龍井組的小鼠血糖AUC均顯著下降（<0.05）。檢測(cè)結(jié)果表明，高脂飲食能引起C57BL/6小鼠葡萄糖耐受能力受損，通過(guò)長(zhǎng)期灌胃龍井茶水提物能有效改善小鼠葡萄糖耐受性。

2.4 小鼠血清生化指標(biāo)檢測(cè)分析

小鼠血清生化指標(biāo)變化趨勢(shì)如圖3。由圖3A～D可知，與高脂組相比，正常組陽(yáng)性組和龍井組小鼠的TC、TG和LDL-C值顯著降低（<0.05），各組間的HDL-C無(wú)顯著差異。小鼠血清中酶活性水平如圖3E和3F所示，高脂組小鼠AST酶活性水平顯著高于正常組（<0.01），但仍處于正常水平范圍內(nèi)，龍井組小鼠血清AST酶活性水平顯著低于高脂組（<0.05）；小鼠血清ALT酶活性在各組間不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果表明，鳩坑龍井茶能有效降低高脂飲食引起的小鼠血脂含量，推測(cè)長(zhǎng)期飲用鳩坑龍井茶能夠降低血脂累積水平。

注：A為小鼠OGTT血糖變化曲線(xiàn)，B為小鼠OGTT曲線(xiàn)下面積。*表示與高脂組相比P<0.05，**表示與高脂組相比P<0.01，下同

注：N為正常組，M為高脂組，C為陽(yáng)性組，L為龍井組

2.5 小鼠肝組織脂肪變性檢測(cè)分析

小鼠肝組織脂質(zhì)含量如圖4。由圖4A和4B可以得出，高脂飲食能夠顯著增加小鼠肝臟TG和TC的含量（<0.05），陽(yáng)性藥物和鳩坑龍井茶具有顯著降低小鼠肝臟TG和TC的作用（<0.05）。

HE染色結(jié)果顯示（圖4C），正常組的小鼠肝細(xì)胞排列緊密，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，脂肪空泡密度??；高脂組小鼠肝細(xì)胞排列較松散，肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰，大量的脂肪空泡聚集在細(xì)胞核周?chē)?，少量炎性?xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，但無(wú)氣球樣病變；陽(yáng)性組和龍井組小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)中脂肪空泡減少，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象幾乎消失。油紅O染色結(jié)果顯示（4D），正常組小鼠肝組織中甘油三酯的含量較少，高脂組小鼠肝組織甘油三酯遍布大部分或整個(gè)細(xì)胞質(zhì)，且含量顯著高于正常組（<0.05），陽(yáng)性組和龍井組小鼠肝組織甘油三酯含量顯著低于高脂組（<0.05）。肝組織切片病理觀察結(jié)果表明，高脂飲食誘發(fā)小鼠肝組織脂肪堆積并發(fā)生變性，而長(zhǎng)期飲食鳩坑龍井茶能有效緩解該癥狀。

圖4 小鼠肝組織脂質(zhì)含量

2.6 鳩坑龍井茶對(duì)肝組織脂質(zhì)代謝通路信號(hào)的影響

小鼠肝臟蛋白免疫印跡結(jié)果如圖5A所示。分析圖5A和圖5B可知，與高脂組相比，正常組、陽(yáng)性組和龍井組PPAR相對(duì)表達(dá)量顯著降低（<0.05）；由圖5A、圖5C～F可知，正常組、陽(yáng)性組和龍井組中SREBP-1c、SCD-1、FAS蛋白表達(dá)量顯著低于高脂組（<0.05）。與高脂組相比，陽(yáng)性組、龍井組p-ACC-1/ACC-1值顯著升高，結(jié)果表明，陽(yáng)性藥物與鳩坑龍井茶都具有影響高脂飲食小鼠肝組織脂質(zhì)合成代謝過(guò)程的效應(yīng)。

由圖6A可知，正常組、陽(yáng)性組和龍井組相對(duì)表達(dá)量顯著低于高脂組（<0.05），說(shuō)明高脂飲食促使小鼠肝組織相對(duì)表達(dá)量增加，促進(jìn)脂質(zhì)合成代謝。由圖6B可知，高脂組小鼠肝組織中-、、-和-基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常組（<0.05）；與高脂組相比，經(jīng)陽(yáng)性藥物和鳩坑龍井茶干預(yù)后，小鼠肝組織-、、-和-基因表達(dá)水平顯著下降（<0.05）。圖6C顯示，高脂組小鼠肝組織中-和基因表達(dá)水平顯著高于其他組（<0.05），說(shuō)明高脂組中膽固醇合成顯著增加，鳩坑龍井茶干預(yù)能抑制高脂小鼠肝組織膽固醇合成過(guò)程。

2.7 小鼠腸道菌群檢測(cè)分析

各組小鼠腸道菌群分類(lèi)操作單元（Operational taxonomic units，OTUs）韋恩圖如圖7所示。檢測(cè)分析獲得正常組小鼠腸道菌群有457種OTUs，高脂組、陽(yáng)性組和龍井組分別獲得327、319、389種OTUs，分別有201、194、229種OTUs與正常組相同，表明龍井組小鼠腸道菌群構(gòu)成與正常組最為相似。

注：N為正常組，M為高脂組，C為陽(yáng)性組，L為龍井組

圖7 OTUs韋恩圖

2.7.1 腸道菌群的多樣性分析

由稀釋曲線(xiàn)（圖8A）可知，樣品測(cè)序量充分，測(cè)序深度足以覆蓋大多數(shù)菌群，可進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。菌群物種的多樣性和豐度由多樣性分析體現(xiàn)（圖8B～D），由Chao1指數(shù)圖可見(jiàn)，與正常組相比，高脂組小鼠腸道菌群豐度極顯著降低（<0.01），陽(yáng)性組和龍井組顯著降低（<0.05）；由香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)所示，正常組菌群多樣性良好，高脂飲食導(dǎo)致腸道菌群多樣性顯著降低；與高脂組相比，龍井組香農(nóng)指數(shù)顯著增高（<0.05），而正常組、龍井組之間辛普森指數(shù)無(wú)顯著差異。

多樣性主要通過(guò)PCA和PCoA體現(xiàn)出來(lái)（圖8E和8F），由PCA圖（PC1和PC2分別占小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)總體差異的58.69%和9.84%）結(jié)果可知，正常組與高脂組、陽(yáng)性組、龍井組腸道菌群組成結(jié)構(gòu)兩兩之間存在差異，但是鳩坑龍井茶干預(yù)后小鼠腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)趨近于正常組，說(shuō)明鳩坑龍井茶具有改善高脂飲食導(dǎo)致的小鼠腸道菌群多樣性紊亂效應(yīng)，并且促使小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)趨向于正常組小鼠腸道菌群生態(tài)。

2.7.2 腸道菌群組成分析

腸道菌群各水平上分布如圖9所示。在門(mén)水平上主要檢測(cè)到Firmicutes、Bacteroidota、Desulfobacterota和Actinobacteriota等4種菌群（圖9A）。與正常組相比，高脂組小鼠腸道菌群中Desulfobacterota的相對(duì)豐度增加，并且Firmicutes/Bacteroidota比值（F/B值）提高；經(jīng)龍井茶干預(yù)后，小鼠腸道菌群中Firmicutes相對(duì)豐度降低，Bacteroidota相對(duì)豐度增加，F(xiàn)/B值降低趨勢(shì)明顯，顯示小鼠腸道菌群組成有改善效果。

注：A為稀釋曲線(xiàn)，B為Chao1指數(shù)，C為香農(nóng)指數(shù)，D為辛普森指數(shù)，E為PCA圖，F(xiàn)為PCoA圖

注：A為門(mén)水平上菌群分布，B為目水平菌群分布，C為屬水平菌群分布

在目水平上主要檢測(cè)到Lachnospirales、Bacteroidales、Oscillospirales、Erysipelotrichales、Desulfovibrionales、Coriobacteriales等菌群（圖9B）。與正常組相比，高脂組小鼠腸道菌群中Lachnospirales、Desulfovibrionales、Oscillospirales、Coriobacteriales、Peptostreptococcales_Tissierellales的相對(duì)豐度升高，而B(niǎo)acteroidales、Erysipelotr-ichales、Verrucomicrobiales、Campylobacterales和Clostridia_UCG_014的相對(duì)豐度降低；陽(yáng)性組小鼠腸道菌群中Lachnospirales、Peptostre-ptococcales_Tissierellales、Erysipelotrichales和Clostridia_UCG_014相對(duì)豐度進(jìn)一步升高，Bacteroidales、Oscillospirales和Campylobac-terales相對(duì)豐度降低；龍井組小鼠腸道菌群中Lachnospirales、Desulfovibrionales和Campylobacterales相對(duì)豐度降低，同時(shí)Bacteroidales、Erysipelotrichales、Coriobacteriales、Peptostreptococcales_Tissierellales和Clostridia_UCG_014相對(duì)豐度升高。

小鼠的腸道菌群在屬水平的分布如圖9C所示。與正常組相比，高脂組小鼠腸道菌群中、、、和的相對(duì)豐度上調(diào)，同時(shí)、和相對(duì)豐度下調(diào)；陽(yáng)性組小鼠腸道菌群經(jīng)陽(yáng)性藥物干預(yù)后，、、和相對(duì)豐度下降，而相對(duì)豐度上升；龍井組小鼠腸道菌群經(jīng)鳩坑龍井茶干預(yù)后，、、和相對(duì)豐度下降，-、、、和相對(duì)豐度上升。

2.7.3 LEfSe分析

經(jīng)LEfSe多級(jí)物種差異線(xiàn)性判別分析（LDA≥4），各組小鼠體內(nèi)菌群變化結(jié)果如圖10所示。正常組小鼠腸道中主要標(biāo)志性菌屬為、、、、、和；高脂組小鼠主要標(biāo)志性菌屬為和；陽(yáng)性組小鼠主要標(biāo)志性菌屬為、、和；龍井組標(biāo)志性菌屬主要為。

2.7.4 KEGG通路功能性預(yù)測(cè)分析

由圖11A所示，與正常組相比，高脂組下調(diào)花生四烯酸代謝、磷酸鹽和次磷酸鹽代謝、核黃素代謝、丙氨酸代謝、-亞麻酸代謝、維他命B6代謝、煙酸和煙酰胺代謝、亞油酸代謝、-谷氨酰胺和-谷氨酸代謝、入脂代謝、磷酸肌醇代謝和甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸代謝，上調(diào)甲烷代謝、C5-支鏈二元酸代謝、2-氧羧酸代謝、卟啉與葉綠素代謝和半胱氨酸、蛋氨酸代謝。由圖11B所示，與高脂組相比，龍井組下調(diào)次生代謝的生物合成、C5-支鏈二元酸代謝、淀粉和蔗糖代謝、氰基氨基酸代謝和氮代謝，推測(cè)鳩坑龍井茶具有調(diào)節(jié)C5-支鏈二元酸代謝作用。

2.7.5 小鼠腸道菌群豐度與生化指標(biāo)相關(guān)性分析

腸道菌群豐度與小鼠生化指標(biāo)相關(guān)性結(jié)果如圖12A所示。小鼠體質(zhì)量與相對(duì)豐度負(fù)相關(guān)；TG含量與和相對(duì)豐度負(fù)相關(guān)，與相對(duì)豐度正相關(guān)；LDL-C含量與、、和相對(duì)豐度負(fù)相關(guān)，與和相對(duì)豐度正相關(guān)；AST活性水平與、、和-相對(duì)豐度負(fù)相關(guān)，與和相對(duì)豐度正相關(guān)。其中，與小鼠體質(zhì)量及血清指標(biāo)相關(guān)性最高的腸道菌種為和。

圖10 LEfSe分析

注：A為正常組與高脂組KEGG對(duì)比（由于數(shù)據(jù)過(guò)多，僅展示人類(lèi)疾病分類(lèi)且P<0.01），B為高脂組與龍井組KEGG對(duì)比

續(xù)圖11

Continued Fig.11

注：A為小鼠體質(zhì)量、血清生化指標(biāo)與腸道菌群豐度相關(guān)性，B為小鼠肝脂質(zhì)代謝基因相對(duì)表達(dá)量與腸道菌群豐度相關(guān)性

腸道菌群豐度與小鼠肝脂質(zhì)代謝通路基因相對(duì)含量相關(guān)性分析如圖12B所示。SREBP-1基因相對(duì)含量與Patescibacteria、Verrucomicrobiota和unclassified_Archaea相對(duì)豐度呈負(fù)相關(guān)，ACC-1基因相對(duì)含量與Bacteroidota、Cyanobacteria、Patescibacteria和Verrucomicrobiota相對(duì)豐度呈負(fù)相關(guān)，與Desulfobacterota和Firmicutes呈正相關(guān)；SREBP-2基因相對(duì)含量與Patescibacteria和Verrucomicrobiota相對(duì)豐度呈負(fù)相關(guān)；HMGCR基因相對(duì)含量與Bacteroidota、Cyanobacteria、Patescibacteria和Verrucomicrobiota相對(duì)豐度呈正相關(guān)；與Desulfobacterota和Firmicutes相對(duì)豐度呈正相關(guān)；PPAR基因相對(duì)含量與Bacteroidota、Campylobacterota、Cyanobacteria、Patescibacteria和Verrucomicrobiota相對(duì)豐度呈負(fù)相關(guān)，與Desulfobacterota相對(duì)豐度呈正相關(guān)。其中，小鼠肝脂質(zhì)代謝基因相對(duì)含量與Verrucomicrobiota、Bacteroidota和Cyanobac-teria腸道菌種豐度相關(guān)性最高。

3 討論

本研究以C57BL/6小鼠為研究對(duì)象，經(jīng)9周高脂飲食誘導(dǎo)模型組小鼠血脂升高、肝組織脂肪變性、糖耐受能力下降和腸道菌群紊亂，與相關(guān)研究報(bào)道結(jié)果具有相似性[17-20]，進(jìn)一步佐證本研究中NAFL小鼠造模成功的科學(xué)性和可信度。與高脂組相比，經(jīng)龍井茶水提物干預(yù)，小鼠的體質(zhì)量、血脂水平、肝組織脂肪變性癥狀得到緩解，小鼠腸道菌群多樣性和豐度明顯增加并趨于正常組腸道菌群生態(tài)。

在脂肪代謝過(guò)程中，PPAR是啟動(dòng)脂肪細(xì)胞分化的起點(diǎn)[21]。PPAR在脂肪分化方面具有決定性作用[22]。SREBP-1c可靶向促進(jìn)脂質(zhì)合成基因-、、-的表達(dá)，推動(dòng)脂肪酸的合成，在TG和TC合成中發(fā)揮重要作用[23]，其異常高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致肝TG積累和脂代謝紊亂。通過(guò)龍井茶水提物干預(yù)，促使高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝組織脂肪合成關(guān)鍵酶AMPK活性增強(qiáng)，調(diào)控脂質(zhì)代謝通路信號(hào)p-ACC-1/ACC-1比例升高，降低ACC-1蛋白質(zhì)表達(dá)水平，從而抑制脂肪酸合成，減少肝組織脂質(zhì)蓄積[24]。本研究結(jié)果顯示，鳩坑龍井茶水提物具有抑制脂質(zhì)代謝通路SREBP-1c及其下游脂聯(lián)素基因、和-的相對(duì)表達(dá)量，阻斷肝組織脂肪持續(xù)堆積，延緩肝組織脂肪變性，進(jìn)而緩解NAFLD的進(jìn)展。

SREBPs存在3種形式的亞型，除SREBP-1c外還存在SREBP-1a和SREBP-2[25]。SREBP-2是體內(nèi)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞膽固醇代謝合成相關(guān)酶類(lèi)的基因調(diào)控因子，可直接作用于TC合成途徑的限速酶HMGCR，從而直接調(diào)節(jié)膽固醇的合成，同時(shí)還反饋調(diào)節(jié)減少內(nèi)源性膽固醇的生物合成[26]。本研究結(jié)果顯示，鳩坑龍井茶水提物具有降低小鼠肝組織-和基因相對(duì)表達(dá)量，減少肝臟內(nèi)膽固醇從頭合成。

人體腸道中寄生的細(xì)菌數(shù)量有近1014，調(diào)控人體對(duì)攝入飲食的消化吸收，是決定攝入能量轉(zhuǎn)化率的重要組分。本研究結(jié)果顯示，鳩坑龍井茶水提物能夠改善NAFLD小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)，使其接近正常小鼠腸道菌群的生態(tài)。腸道菌群在門(mén)水平中的主要菌為Bacteroidota、Firmicutes、Actinobacteriota和Proteobacteria，占腸道菌群的98%，腸道和肝臟通過(guò)門(mén)靜脈直接關(guān)聯(lián)，通過(guò)“腸-肝軸”影響肝臟脂質(zhì)代謝[27]，腸道菌群失衡是促進(jìn)NAFLD的重要因素[28]。已有研究報(bào)道，高脂飲食C57BL/6小鼠與正常飲食小鼠相比，腸道菌群中厚壁菌門(mén)的種類(lèi)和數(shù)量增加，而擬桿菌門(mén)的種類(lèi)和數(shù)量下降[29]，F(xiàn)/B值升高[30]，F(xiàn)/B值常被用來(lái)作為腸道菌群有序性的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。本研究結(jié)果證實(shí)了高脂飲食能夠引起小鼠腸道菌群中F/B值升高，而龍井組小鼠腸道菌群F/B值下降，表明鳩坑龍井水提物具有調(diào)節(jié)和改善小鼠腸道菌群紊亂的作用效應(yīng)。

Guo等[31]研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸中產(chǎn)生H2S，抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞呼吸作用[32]，抑制丁酸鹽等短鏈脂肪酸（SCFAs）的生成。本研究發(fā)現(xiàn)，在高脂組小鼠腸道菌群中相對(duì)豐度上升，而在龍井組相對(duì)豐度下降。Carter等[33]研究發(fā)現(xiàn)，和能促進(jìn)丁酸鹽的產(chǎn)生，相對(duì)豐度與丙酸含量有很強(qiáng)的相關(guān)性[34]，丁酸可刺激食欲抑制激素分泌，促脂質(zhì)代謝從而減緩NAFLD[35-36]。本研究分析發(fā)現(xiàn)，鳩坑龍井茶水提物干預(yù)后，小鼠腸道菌群中和Erysipelotrichales相對(duì)豐度增加，表明鳩坑龍井茶水提物具有促進(jìn)腸道菌群代謝產(chǎn)生友好型短鏈脂肪酸的效應(yīng)，進(jìn)而緩解小鼠NAFLD癥狀。

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Effect of JiukengLongjing Tea on SREBPs Signaling Pathway and Gut Microbiota Regulation in High-fat Diet C57BL/6 Mice with Hepatic Steatosis

GONG Mingxiu1,2, YUAN Yiwei1,2, ZHANG Yifan1,2, YE Jiangcheng1,2, GUO Li3, LI Xiaojun4, HUANG Hao4, MAO Yuxiao5, ZHAO Yun5, ZHAO Jin1,2*

1. Institute of Food Nutrition and Quality Safety, College of Life Sciences, China Jiliang University, Hangzhou 310018, China; 2. Key Laboratory of Pecialty Agri-product Quality and Hazard Controlling Technology of Zhejiang Province, Hangzhou 310018, China; 3. TeaResearch Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 4. Doctor Innovation Workstation of Zhejiang Yifutang Tea Industry Co., Ltd., Hangzhou 311500, China; 5. Hangzhou Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310024, China

To investigate the effect of Jiukeng Longjing tea water extract (LJT) on liver steatosis and the regulation of gut microbiota in C57BL/6 mice fed with high-fat diet, a non-alcoholic fatty liver model was established in mice induced by a high-fat diet, and LJT (300?mg·kg-1) was gavaged for intervention. The body weight of mice was recorded regularly, and serum biochemical indicators such as AST, ALT, TC, TG, LDL-C, HDL-C, and glucose tolerance levels were measured. The characteristics of HE staining and oil red O staining liver tissue sections were observed and analyzed. Real-time qPCR technology was used to detect the expressions of seven genes including,,,,,, andin mouse liver tissues. The relative expressions of proteins related to lipid metabolism were studied by western blot. At the same time, the gut microbiota of mice was sequenced by high-throughput sequencing (16?S rDNA) and its structure was analyzed. The results show that the body weight, blood glucose AUC, serum TG, TC, LDL-C, and liver TG, TC levels significantly decreased under LJT intervention. Western blot shows that LJT intervention reduced the expressions of SREBP-1c, FAS, ACC-1, SCD-1, and PPARin liver tissue of mice. LJT also significantly downregulated the relative expressions of,,,,,andin liver tissue. The 16?S rDNA detection reveals that the levels of gut microbiota were mainly classified into four categories: Firmicutes, Bacteroidota, Desulfobacterota, and Actinobaciota. LJT could effectively alleviate the trend of increasing the relative abundance of Firmicutes and decreasing the relative abundance of Bacteroidota caused by high-fat diet, and increase the species abundance of gut microbiota. Therefore, LJT could interfere with the signal expression of SREBPs pathway in mouse liver steatosis, and improve the disturbance of gut microbiota in mice, thereby achieve the effect of reducing fat and weight loss.

Jiukeng Longjing tea, non-alcoholic fatty liver, SREBPs path, gut microbiota dysbiosis, lipid-lowering effect

S571.1，R151.3

A

1000-369X(2023)04-576-17

2023-01-16

2023-04-12

浙江省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2020C02045）、杭州市農(nóng)業(yè)與社會(huì)發(fā)展科研項(xiàng)目（202203A06、202203A11、202203B09）、開(kāi)化茶產(chǎn)業(yè)提升浙江省團(tuán)隊(duì)科技特派員項(xiàng)目、杭州市科技特派員項(xiàng)目（20221122I80）、衢州市重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目科技強(qiáng)農(nóng)專(zhuān)項(xiàng)（2023k098）

龔明秀，女，碩士研究生，主要從事藥食同源植物營(yíng)養(yǎng)與功效評(píng)價(jià)研究。*通信作者：zhaojin@cjlu.edu.cn